Anda di halaman 1dari 13

TUGAS ANALISIS KLINIK LANJUT

APLIKASI ELISA UNTUK MENDETEKSI VIRUS

Oleh:
Evi Kurniawati
051414153005

PROGRAM MAGISTER ILMU FARMASI


FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2015

DEVELOPMENT AND APPLICATION OF AN ANTIGEN CAPTURE


ELISA ASSAY FOR DIAGNOSIS OF JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS
IN SWINE, HUMAN AND MOSQUITO
Li Mei, Peng Wu, Jing Ye, Guangping Gao, Lin Shao, Shaomei Huang,
Yaoming Li, Xiaohong Yang, Huanchun Chen and Shengbo Cao

1. Pendahuluan
Japanese Encephalitis (JE) adalah zoonosis serius yang disebabkan oleh
Japanese Encephalitis Virus (JEV) yang merupakan nyamuk patogen dari
famili Flaviviridae, yang mengancam kesehatan masyarakat di Asia selatan
dan Asia timur. Secara umum, JEV dipelihara dalam siklus transmisi antara
amplifier babi dan nyamuk vektor. Sebagai jalan akhir dalam siklus
penularaan (dead-end), manusia terinfeksi karena gigitan nyamuk yang telah
terinfeksi dan kemudian mengembangkan penyakit neurologis dengan
perkiraan 10.000 kematian per tahun terkait JE. Sebagai patogen penting
dalam babi, JE juga menginduksi konsekuensi yang buruk pada reproduksi
induk babi dan kematian pada babi.
Beberapa metode laboratorium telah dikembangkan untuk mendeteksi
infeksi JEV, seperti isolasi virus, RT-PCR. Namun, bahkan pada laboratorium
dengan fasilitas paling canggih sekalipun, JEV tidak dapat diisolasi dari
spesimen klinis dengan mudah, yang mungkin disebabkan karena sirkurasi
sejumlah virus yang rendah, clearance of transient viremia yang cepat setelah
onset penyakit dan produksi neutralizing antibody yang cepat, disamping itu,
RT-PCR

membutuhkan

teknisi

yang

berpengalaman

dan

peralatan

laboratorium khusus, dan uji serologis seperti Hemagglutination Inhibition


(HI) test, hanya dapat digunakan untuk mendeteksi tingkat serum antibodi
atau untuk memantau situasi imunisasi. Lebih penting lagi, metode ini tidak
sesuai untuk menyelidiki sampel dalam jumlah besar dan mendeteksi tingkat
antigen JEV dalam berbagai jenis sampel klinis.
Dalam studi ini, dikembangkan antigen capture ELISA assay dengan
sangat spesifik, sensitif dan ekonomis untuk mendeteksi antigen JEV pada

babi, manusia, nyamuk dan sampel klinis lain, dalam upaya untuk
memberikan alat yang efektif untuk diagnosis infeksi JEV.
2. Metode
2.1.

Persiapan virus

JEV wide type strain P3 diperbanyak dalam otak tikus yang masih
muda, dan kontrol negatif disiapkan dengan blanko otak tikus. Pseudorabies
virus (PRV, Ea strain), Circovirus porcine (PCV-2, Yu-A strain), Porcine
reproductive and Respiratory syndrome virus (PRRSV, YA strain), Porcine
parvovirus (PPV), West nile virus (WNV, inactivated), Classical swine fever
virus (CSFV, CWH strain) dan Swine influenza virus (SIV) disimpan di
laboratorium.
2.2.

Preparasi Antibodi
Monoclonal antibody (Mab) terhadap protein E Japanese Encephalitis

Virus (JEV)

diproduksi di laboratorium seperti dilansir Li et al.

Hasil

produksi MAb dimurnikan dengan NAbTM Protein A/G Spin Assay (Thermo
Scientific, Rockford, USA) sesuai dengan instruksi produsen. Untuk
menghasilkan polyclonal antibody (PcAb) terhadap JEV, kelinci diimunisasi
subkutan dengan emulsified JEV vaccine by Freund's incomplete adjuvant
(SIGMA, USA). Setelah imunisasi keempat, darah dikumpulkan dan serum
dipisahkan. PcAb dipanen dan dimurnikan dari serum. Aktivitasnya
dikarakterisasi dengan IFA.
2.3.

The Assembling of ELISA


MAb diencerkan hingga 5 g/ml dalam coating buffer (0,05 M

sodium karbonat, pH 9,5-9,7) dan ditambahkan ke dalam 96 wells of


polystyrene microtiter plate (KeQian Hewan Biologi Products Co, Ltd,
Wuhan, Cina). Setelah inkubasi selama semalam pada 4C, plate dicuci lima
kali dengan rinse solution (0,05% Tween-20 dalam PBS). Ikatan nonspesifik
diblok dengan blocking solution (1% bovine serum albumin dalam PBS) pada
37C selama 1 jam. Selanjutnya, sampel yang diencerkan secara serial

dimasukkan sebanyak 100 l/well. Setelah diinkubasi pada 37C selama 30


menit, 100 l PcAb JEV, yang diencerkan dalam 1:10.000 dalam blocking
solution, ditambahkan untuk mendeteksi antibodi. Setelah diinkubasi selama
30 menit pada 37C, horseradish peroxsidase (HRP)-labeled goat anti-rabbit
IgG (Boster, Guanshan Road, Wuhan, Cina) ditambahkan dan diinkubasi lagi
selama 30 menit. Diantara setiap langkah, plate dicuci lima kali dengan rinse
solution

selama

menit.

Setelah

tahap

konjugasi,

ditambahknan

tetramethylbenzidine (TMB), dan hasilnya diukur dengan spektrofotometer


pada panjang gelombang 630 nm.
2.4.

Cut-off standard and detection criteria of ELISA assay


Dalam penelitian ini, background subtraction method digunakan

sebagai nilai perbatasan (border value) antara positif dan negatif, mengacu
pada instruction of PRRSV Ab ELISA Manual (Ver.1.0) PRRSVVR/PRRSVLA (VDPro, Jeno Biotech Inc, Korea).
Test validation: rata-rata OD kontrol positif (PC) = 0.4 atau lebih, ratarata OD kontrol negatif (NC) = 0,2 atau kurang
Perhitungan CPC (Corrected Positive Control): CPC = rata-rata OD
PC rata-rata OD NC
Perhitungan SP (Sample to Positive Ratio): SP = (rata-rata OD sampel
rata-rata OD NC) / CPC
Cut-off
standard

metode

ditetapkan

sebagai

berikut:

Sampel didefinisikan sebagai positif jika nilai SP lebih dari 0,4 dan negatif
jika nilai SP kurang dari 0,2. Jika nilai SP adalah antara 0,2 dan 0,4 sampel
didefinisikan sebagai suspect. Jika nilai deteksi adalah suspect, sampel perlu
dikumpulkan lagi setelah 1 bulan dan diuji lagi untuk konfirmasi.
2.5.

Sensitivity and specifity test of the ELISA


Stok JEV (1106 PFU/ml) diencerkan 10 kali lipat berturut-turut.

Setiap pengenceran diaplikasikan pada uji ELISA. Sensitivitas ditentukan


dengan mencari end point dilution sesuai dengan cut-off standard yang
ditentukan. Spesifisitas ELISA dievaluasi dengan mendeteksi beberapa virus
yang berbeda termasuk PRV, PCV, PRRSV, PPV, inactivated WNV, CSFV
dan SIV. Strain JEV 1,0106 PFU/ml digunakan sebagai kontrol positif,

sedangkan homogenat dari otak tikus yang sehat digunakan sebagai kontrol
negatif.
2.6.

Repeatability, stability and shelf time evaluation of the ELISA


assay
Repeatability uji ELISA dilakukan dengan mendeteksi 3 sampel

dengan dua grup coated microtiter plates. Setiap sampel diuji tiga kali secara
terpisah dalam satu plate untuk intra-repeat assay dan hasil dalam dua plate
dianggap sebagai inter-repeat. Perbedaan dievaluasi dengan membandingkan
koefisien variasi dan menganalisis signifikansi statistik. Untuk menganalisis
stability uji ELISA, coated polystyrene ELISA plate ditempatkan dalam
inkubator pada suhu 37C. Kontrol positif standar dan kontrol negatif
terdeteksi oleh salah satu ELISA plate setiap hari. Untuk menentukan shelf
time uji ELISA, coated ELISA plate disimpan pada suhu 4C dan -20C
selama beberapa bulan. Salah satu bagian dari coated plate digunakan untuk
mendeteksi kontrol positif standar dan kontrol negatif setiap bulan.
2.7.

Deteksi sampel klinis di lapangan


60 sampel klinis (termasuk 20 homogenat nyamuk, 24 jaringan

otak babi dan 16 cairan serebrospinal manusia) dideteksi oleh ELISA assay.
Diantaranya, 16 spesimen cairan serebrospinal dari pasien di Taihe Hospital
(Shiyan, Cina) dikumpulkan pada saat mereka masuk rumah sakit; 24
jaringan otak babi dikumpulkan dari deteksi klinis; 20 spesies nyamuk yang
tertangkap oleh penangkap nyamuk. Sampel klinis dari nyamuk, babi, dan
cairan serebrospinal semua disimpan pada suhu -80C sebelum assay. Lima
gram jaringan otak babi, nyamuk dalam 5 ml media dihomogenkan dalam
grinder steril dan disentrifugasi pada 10.000 x g masing-masing selama 10
menit. Supernatan disaring dengan membran filter 0,22 um dan perkolat
dikumpulkan sebagai sampel jaringan. RT-PCR diaplikasikan sebagai metode
komparatif.

2.8.

Analisis statistik

Analisis statistik yang digunakan adalah t test, dimana P> 0,05


dianggap tidak ada perbedaan yang bermakna.
3. Hasil
3.1.

Produksi dan karakterisasi MAb dan PcAb terhadap JEV


Sebuah monoclonal antibody (MAb) yang sangat spesifik

terhadap JEV Protein E, bernama 4D1, telah dikonfirmasi menyebabkan


immunoreactivity yang kuat dengan protein E dengan Western blot dan
immunofluorescense assay (IFA). Dan ditemukan bahwa titer reaksi
polyclonal antibody (PcAb) yang diproduksi juga bisa mencapai hingga 1:
20.000 melalui indirect ELISA test. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 1,
sinyal fluorescent yang kuat dapat dideteksi oleh IFAdalam sel BHK-21 yang
terinfeksi JEV. Dengan checkerboard titration, konsentrasi optimal dari
antibodi primer (Mab E) dan antibodi deteksi (PcAb) ditentukan sebesar
5g/ml dan 0,2 mg/ml.

Gambar 1. Reactionogenicity dan specifity PcAb diidentifikasi oleh IFA.


Sel BHK-21 diinkubasi dengan JEV selama 1 jam pada 37C. Pada 72
jam pasca infeksi, sel-sel distabilkan dengan metanol absolut dan di treat
dengan IFA, PcAb terhadap JEV. BHK-21 normal tanpa infeksi JEV
digunakan sebagai kontrol (MOCK).

3.2.

Sensitivitas uji ELISA

1106 PFU/ml JEV diencerkan secara serial dan diuji dengan


ELISA. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2, kurva standar untuk
pengenceran 10-kali lipat 1106 PFU/ml uji JEV dibentuk dan homogenat
dari blanko otak tikus digunakan sebagai kontrol negatif untuk membuat
baseline. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah virus minimum untuk
deteksi adalah 1,0 104 PFU.

Gambar 2. Sensitivitas antigen capture ELISA assay. 1106 PFU dari


JEV diencerkan secara serial 10 kali lipat (1:10 sampai 1: 100.000) untuk
diuji; homogenat dari blanko otak tikus digunakan sebagai kontrol
negatif.
3.3.

Spesifisitas ELISA
Untuk mengevaluasi spesifisitas uji ELISA, virus lain yang

berkaitan dengan penyakit virus populer menjadi sasaran untuk pengujian


ini. Sebagai perbandingan, semua sampel virus juga dideteksi dengan RTPCR. Seperti terlihat pada Tabel 1, hasil positif teramati pada kontrol positif
standar dan hasil negatif ditunjukkan pada PRV, PCV, PRRSV, PPV, CSFV
dan SIV. Selain itu, sinyal positif lemah terdeteksi di salah satu dari lima

sampel inactivated WNV. Rreaktivitas silang antara JEV dan WNV sulit
untuk dihindari karena homologi keduanya yang tinggi. Namun, spesifisitas
uji ELISA tidak akan terganggu oleh sinyal lemah dari reaktivitas silang ini.
Tabel 1. Hasil uji specifity ELISA pada beberapa virus yang berbeda
dibandingkan dengan RT-PCR

3.4.

Repe
atability, stability dan shelf time ELISA
Repeatability ELISA dievaluasi dengan tiga sampel. Koefisien

variasi dari tiga sampel yang diuji dalam pengujian ini masing-masing
adalah 6,7%; 6,1% dan 7,6% (Tabel 2). Selain itu, tidak ada perbedaan yang
bermakna ditemukan pada beberapa kali deteksi setiap sampel dengan dua
coated microtiter plates dengan signifikansi (P> 0,05), yang menegaskan
repeatability yang tinggi pada pengujian ELISA ini. Untuk menentukan
stability, plate dilapisi dengan MAb 4D1, disimpan pada suhu 37C. Nilai
OD630 dari kontrol positif standar dan kontrol negatif standar ditunjukkan
dengan penurunan yang tidak signifikan selama setidaknya 5 hari (Tabel 3).
Selain itu, plate yang dilapisi dengan MAb 4D1 dapat disimpan pada suhu
4C atau -20C hingga 6 bulan tanpa kerusakan coating antibody (Tabel 4).
Data ini menunjukkan bahwa uji ELISA memiliki repeatability, stability dan
shelf time yang baik.
Tabel 2. Hasil uji repeatability ELISA pada 3 sampel yang berbeda

Tabel 3. Hasil uji stability ELISA selama 5 hari


Ta
bel
4.

Hasil uji shelf life ELISA pada selama 6 bulan


3.5.

Deteksi sampel klinis


Dengan analisis RT-PCR, 20 dari 60 sampel klinis positif dan 40

negatif. Sedangkan uji ELISA menunjukkan 14 positif dan 46 hasil negatif


dengan positive coincidence 70%, dan negative coincidence 100% (Tabel
5).
Tabel 5. Hasil deteksi ELISA dalam 60 sampl klinik

4. Diskusi
Japanese Encephalitis (JE) adalah penyakit yang bersifat zoonosis yang
menyebabkan demam, aseptik meningitis, acute flaccid paralysis atau classic
meningomyleoencephalitis, dan sampai 50% dari orang-orang yang bertahan
hidup mungkin memiliki gejala neurologis berkepanjangan. Saat ini, ada
kebutuhan mendesak dalam diagnosis secara cepat untuk mendeteksi infeksi
Japanese Encephalitis Virus (JEV) baik pada manusia maupun hewan. Karena
inokulasi vaksin JEV berkontribusi terhadap hasil antibodi-positif, diagnosis yang
akurat masih tergantung pada deteksi antigen. Namun, penerapan metode
konvensional, seperti RT-PCR dan isolasi virus, dibatasi oleh persyaratan
operasional laboratorium, teknisi

yang terampil dan peralatan khusus. Oleh

karena itu, metode yang lebih sederhana dan cepat untuk mendeteksi antigen JEV
perlu dikembangkan.
Dalam penelitian ini dilaporkan antigen capture ELISA untuk diagnosis
infeksi JEV dengan menggunakan MAb 4D1 terhadap protein E dari JEV dan
PcAb dari JEV yang berasal dari kelinci. Karena antibodi primer spesifik JEVdan anti-antibodi yang digunakan, ELISA yang diusulkan dalam laporan ini
terbukti mampu mendeteksi karakteristik antigen JEV secara spesifik, yang secara
efektif mengurangi dan membersihkan interferensi dari flavivirus lain untuk
diagnosis JEV.
Ikatan spesifik antara antibodi dan antigen adalah faktor yang paling
penting bagi keberhasilan pengembangan uji ELISA. Dalam penelitian
sebelumnya, spesifisitas tes telah dimodifikasi dengan menggunakan antibodi

10

monoklonal single strain atau multiple strain. Namun, antibodi poliklonal


biasanya dipilih untuk meningkatkan sensitivitas. Oleh karena itu, dalam
penelitian ini, digunakan antibodi poliklonal JEV diterapkan untuk konjugasi
dengan antigen sebagai antibodi deteksi, karena hasilnya menunjukkan bahwa
antibodi poliklonal bisa lebih mengenali strain JEV, yang meningkatkan
sensitivitas uji.
Secara keseluruhan, uji ELISA yang dikembangkan dalam penelitian ini
memiliki beberapa keuntungan potensial. Pertama, tidak seperti RT-PCR dan
metode isolasi virus lainnya, uji ELISA ini tidak memerlukan reagen mahal dan
fasilitas khusus, dan dapat secara rutin dilakukan di setiap laboratorium biasa
karena kesederhanaan dan kecepatannya. Kedua, uji ELISA telah dikonfirmasi
dengan sensitivitas yang relatif tinggi. Tingkat deteksi minimum ELISA uji dalam
penelitian ini (1,0104 PFU) adalah lebih rendah dari RT-PCR (3.2102 PFU),
tetapi lebih tinggi dibandingkan dengan immunochromatographic strip (ICS)
(2,5105 PFU). Karena reaksi positif palsu oleh RT-PCR sulit dihindari dan
sensitivitas yang rendah dari ICS, penerapan metode ini untuk diagnosis yang
akurat dari JEV sebaiknya dicegah, uji ELISA dalam penelitian ini dapat
dikembangkan sebagai metode alternatif untuk diagnosis cepat infeksi JEV. Selain
itu, sensitivitas yang lebih tinggi dengan capture ELISA untuk mendeteksi antigen
dari JEV dibandingkan

dengan ELISA tradisional telah dikonfirmasi dalam

penelitian ini, itu bisa disebabkan karena horseradish peroxidase (HRP)-labeled


goat anti-rabbit antibody yang secara khusus mengidentifikasi antibodi deteksi,
yang telah diperkuat sinyal reaksi dalam seluruh sistem dan sensitivitas yang
dimodifikasi. Yang paling penting, uji ELISA ini menyediakan cara yang mudah
untuk mendeteksi JEV di sejumlah spesimen klinis termasuk babi, manusia dan
nyamuk, yang belum dilaporkan sebelumnya. Oleh karena itu, metode ini akan
memiliki prospek aplikasi yang luas dalam diagnosis klinis skala besar JEV.
Namun, masih ada beberapa masalah yang tidak dapat diabaikan. Sampel
yang dikumpulkan pada waktu yang tepat diperlukan dalam uji ELISA ini ketika
virus dalam sampel terdeteksi belum terdegradasi. Karena waktu pengumpulan
sampel berpengaruh terhadap kemampuan untuk mengkonfirmasi diagnosis JEV

11

dan diperlukan untuk kesuksesan deteksi dengan teknik apapun. Selain itu infeksi
ringan karena JEV mungkin tidak mampu terdeteksi oleh tes ELISA ini, hal ini
adalah karena fakta bahwa beberapa sampel yang terinfeksi JEV secara ringan
memiliki hasil negatif dengan ELISA ini, tetapi menunjukkan hasil positif dengan
RT-PCR, yang memiliki kemampuan untuk mendeteksi beban virus lebih ringan.
Jadi Uji ELISA pada penelitian ini lebih cocok untuk diagnosis infeksi JEV berat
selama wabah. Hal ini diperlukan bahwa diduga sampel tanpa gejala klasik infeksi
JEV harus dikonfirmasi lebih lanjut dengan teknik lain, seperti histologis,
imunologi, atau tes molekuler.
5. Kesimpulan
Antigen capture ELISA assay telah dikembangkan untuk bisa mendeteksi
antigen JEV pada babi, manusia, nyamuk dan sampel lainnya secara spesifik dan
efektif, yang menunjukkan bahwa uji ELISA ini dapat digunakan sebagai alat
yang cukup sederhana dan efisien untuk mendeteksi secara

klinis dan

mengendalikan infeksi JEV.

12

DAFTAR PUSTAKA
Li Mei, Peng Wu, Jing Ye, Guangping Gao, Lin Shao, Shaomei Huang, Yaoming
Li, Xiaohong Yang, Huanchun Chen and Shengbo Cao, 2012. Virology Journal,
9 : 4. Development And Application Of An Antigen Capture Elisa Assay For
Diagnosis Of Japanese Encephalitis Virus In Swine, Human And Mosquito

13