BAB I

PENDAHULUAN
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacammacam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa
gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan
ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun
1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu
kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett
untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom.
Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi
untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui
sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai
digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian
pada akhir tahun 1930-an dan permulaan tahun 1940-an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938
oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun
1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941
(untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat
kroinatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan
kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James
mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun
1952 dan akhir tahun 1960-an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu
teknik analisis yang canggih.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas
berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan
segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960-an, semakin
banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu
teknik

mengimbangi

kromatografi

gas.

High

Performance

Liquid

Chromatography(KCKT) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High

Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan
1

Modern = modern) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam
keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga
sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi
dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik
yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang
sederajat dengan kromatografi gas.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 SEJARAH KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau biasa disebut dengan KCKT (High
Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an
dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sampel pada sejumlah bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer-polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan KCKT
terbaru antara lain: miniaturisasi sisstem KCKT, penggunaan KCKT untuk
analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan analisis
senyawa-senyawa kiral.
KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT secara mendasar merupakan
sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut
yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, KCKT didukung oleh
pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini
membuat KCKT dapat memisahkan komponen sampel lebih cepat.
2.2 KEGUNAAN KCKT
Kegunaan KCKT adalah untuk: memisahkan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian (impurities);
analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil); penentuan
molekul-molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian
senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan
senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah
banyak, dan dalam skala proses industri.
KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawasenyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein3

protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat,

produk hasil samping, proses sintesis atau produk-produk degradasi dalam sediaan
farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan; memurnikan
senyawa dalam suatu campuran; memisahkan polimer dan menentukan distribusi
berat molekulnya dalam suatu campuram; kontrol kualitas; dan mengikuti
jalannya reaksi sintetis.
2.3 KELEBIHAN DAN KEKURANGAN KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid
Chromatography (KCKT) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.
KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan
fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini
jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

Mudah melaksanakannya
Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
Dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Mudah melakukan "sample recovery"
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali

jika KCKT dihubungkan dengan spectrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya

adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
2.4 JENIS-JENIS KCKT
Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali KCKT dikelompokkan menjadi KCKT fase
normal dan KCKT fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, KCKT juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis KCKT sebagai berikut:

a) Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatog rafi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam
silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini
memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika
mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
b) Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang
dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan
untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti
dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling
populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran
metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut
yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena
kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya
dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk
spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan
terelusi lebih cepat.
c) Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar
kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang
beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya
adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan
dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal
digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik.
Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi
oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan
kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk
gugus penukar ion pada resin.
5

d) Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada
metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai
muatan yang berlawanan.
e) Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan
dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat
molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau
polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat
diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang
mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian
molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh
lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati
porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam
pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut
dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
f) Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus
molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang
terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis
ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang
sangat kompleks.

2.5 PRINSIP KERJA KCKT

Kerja KCKT pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan KCKT dengan kromatografi
lainnya adalah pada KCKT digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa
gerak.

Campuran

analit

akan

terpisah

berdasarkan

kepolarannya,

dan

kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini
akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Urutan skala
6

polaritas:

golongan

fluorocarbon

<

golongan

hidrokarbon

<

senyawa

terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan
alkohol < golongan asam.
KCKT dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses
kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat
Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard
umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu
dilihat adalah spectrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan
mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua
zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan,
meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen
yang dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada
system KCKT adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis
analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid,
protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat
untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang
khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida).
Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan
juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sampel berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya
adalah proses identifikasi. Hasil analisa KCKT diperoleh dalam bentuk signal
kromatogram.

Dalam

kromatogram

akan

terdapat

menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sampel.

Sampel yang mengandung banyak komponen

peak-peak

yang

didalamnya

akan

mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak
saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan
perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sampel jenis ini
dilakukan tahapan preparasi sampel yang lebih rumit agar sampel yang siap
diinjeksikan ke KCKT sudah cukup bersih dari impuritis. Sampel farmasi
biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif.
Sampel ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
2.6 KOMPONEN-KOMPONEN KCKT

Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada Diagram Blok

KCKT berikut ini:

2.6.1 Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada
fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor
sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut.
Fase Gerak
Fase gerak dalam KCKT adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen
atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran
campuran menuju detektor, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh
karena itu, fase gerak dalam KCKT merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan fase gerak KCKT:

o Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
o

dianalisis.
Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang

dapat mengganggu interpretasi kromatografi.

o Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
o Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
o Zat cair tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
o Sesuai dengan detektor.
Jenis KCKT berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

KCKT fase normal: KCKT dengan kombinasi antara fase diam polar dan
fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau
trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silika. Sedangkan fase gerak

yang digunakan adalah heksana atau i-propil eter.

KCKT fase terbalik: KCKT dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan
fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, metanol, atau
asetinitril. Fase gerak yang baik memberikan faktor kapasitas k pada rentang
yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan
fase gerak yang memberikan k antara 2-5.

2.6.2 Pompa (pump)

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja
tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah
untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
9

reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT
yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang
konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih
umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam KCKT:
a. Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara
gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas
dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola
gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka
bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang
pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b. Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran
yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas
pelarut.
c. Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini
murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan
tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada
viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.
2.6.3 Tempat Injeksi (Injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume
injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume
(misalnya 20 500 L).
Tipe dasar injektor yang dapat digunakan:

10

a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem

tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b) Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan
pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70
atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c)

Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume

lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan
adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.
Syarat- syarat injektor yang baik:

Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin

Mudah digunakan
Keberulangan tinggi
Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

2.6.4 Kolom (Column)

Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya

proses

pemisahan

solut/analit.

Kolom

adalah

jantung

kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan

kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua
kelompok, yaitu:
a. Kolom analitik: Diameter dalam 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada
jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular,
panjang yang digunakan adalah 50-100 cm. Untuk kemasan
poros mikropartikulat, 10-30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom preparatif: Umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25-100 cm.
11

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan

pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,
terutama untuk

kromatografi

penukar

ion dan

kromatografi

eksklusi.

Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid
Chromatography (LSC); Liquid Liquid Chromatography (LLC); Ion Exchange
Chromatography (IEC); Exclution Chromatography (EC).
Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang
lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih
sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril)
lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena
adanya kandungan air yang digunakan.
2.6.5. Detektor (Detector)
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif, seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa) dan
golongan detektor yang spesifik (hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia).
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm.
Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa
dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas,
terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika
12

dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:

-Detektor fluorometer
-Detektor spektrofotometer massa
-Detektor ionisasi nyala
-Detektor refraksi indeks
-Detektor elektrokimia
-Detektor reaksi kimia
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel

Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada

kadar yang sangat kecil

Stabil dalam pengopersiannya
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

Karakteristik detector KCKT:

Dasar
Pendeteksian

Jenis

Maksimum

Peka terhadap

Sensitivitas

sensitifitas

kecepatan alir

suhu

Absorbsi UV

Spesifik

2 x 10-16

Tidak

Rendah

Absorbsi IR

Spesifik

10-6

Tidak

Rendah

Flourometri

Spesifik

10-11

Tidak

Rendah

Indek bias

Umum

1 x 10-7

Tidak

+ 10-4 0 C

Konduktometri

Spesifik

10-8

Ya

2% 0C

Umum

10-10

Tidak

Tidak ada

Spesifik

10-12

Ya

1,5% 0C

Spektometri
massa
Elektrokimia

13

2.7 SELEKSI TIPE KCKT

Analis (pengguna KCKT) sebelum mengoperasikan KCKT, harus membuat
keputusan tipe yang mana yang harus dipilih yang dapat memberikan informasi
yang diinginkan.
Seleksi tipe KCKT adalah suatu petunjuk umum untuk seleksi tipe KCKT.
Informasi ini akan memudahkan para analis untuk memutuskan pemelihan tipe
KCKT yang memberikan para analis untuk memutuskan pemilihan tipe KCKT
yang memberikan kemungkinan terbaik pada pemisahan yang diinginkan.
Namun, sampel yang tidak dikenal (unknown) akan menyulitkan pemilihannya tipe
KCKT.
Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada, besarnya berat
molekul dapat diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data
spektroskopik seperti Nucleic magneticRresonance Spectrosphotometer, Infrared
Spectrophotometer, Ultra Violet Spectrometer, dan Mass Spectrophotometer.
Semua data-data ini dapat digunakan sebagai petunjuk bagi analis memilih tipe
KCKT yang tepat untuk digunakan.

DAFTAR PUSTAKA

14

Dengan berpedoman pada Hukum Dasar "like dissolves like" maka sangat
mudah untuk memutuskan tipe KCKT yang akan dipilih. Dari Skema diatas,
dengan cepat kita dapat melihat bahwa Berat Molekul (BM) lebih besar dari 2000,
maka kita dapat menggunakan kromatografi eksklusi. Fasa geraknya adalah air
jika sampelnya larut dalam air; bila dapat larut dalam pelarut organik maka
digunakan pelarut-pelarut organik sebagai fasa gerak. Fasa

diamnya adalah

Sephadex atau Bondagel Seri E untuk fasa gerak air dan Styragel atau MicroPak
TSK gel untuk rasa gerak organik. Bila BM lebih rendah dari 2000, pertama yang
harus ditentukan adalah apakah sampel dapat larut dalam air. Bila sampel dapat larut
dalam air, maka kromatografi partisi fasa terbalik atau kromatografi penukar ion
dapat digunakan. Bila kelarutan dipengaruhi oleh penambahan asam atau basa
atau bila pH larutan bervariasi lebih dari 2 (dua) satuan pH dari pH 7, maka
kromatografi penukar ion adalah pilihan utama. Bila kelambatan tidak dipengaruhi
oleh asam dan basa dan larutan sampel adalah netral, maka kromatografi partisi
fasa terbalik adalah pilihan terbaik. Tipe Eksklusi menggunakan ukuran poros yang
kecil dan rasa air dapat juga dicoba.
Bila sampel tidak larut dalam air, kromatografi partisi atau kromatografi
padat

cair

dianjurkan

untuk digunakan. Untuk pekerjaan rutin disarankan

menggunakan kromatografi partisi fasa terikat normal karena kolom-kolom ini

tidak begitu rumit dalam perawatannya setelah digunakan. Untuk sampel-sampel
isomer kromatografi padat cair lebih baik digunakan. Bila sampel memiliki
perbedaan ukuran partikel yang besar, kromatografi eksklusi sterik dengan fasa
gerak organik dapat juga digunakan.

15

BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT secara mendasar merupakan
sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Kegunaan KCKT
adalah untuk: memisahkan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-senyawa
tidak mudah menguap (non-volatil); penentuan molekul-molekul netral, ionic,
maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa
yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah
sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri.
3.2 Saran
Kami menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari yang diharapkan. Oleh
karena itu kami mengharapkan adanya kritik dan saran yang positif dan bersifat
membangun demi kesempurnaan makalah ini di masa yang akan datang.
16

DAFTAR PUSTAKA

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, (1979), Farmakope Indonesia

Edisi III, Departemen Kesehatan R.I, Jakarta
Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, (1995), Farmakope Indonesia
Edisi IV, Departemen Kesehatan R.I, Jakarta
Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rahman, (2007), Kimia Farmasi Analisis, Pustaka
Pelajar, Yogyakarta
Johnson, E.L. and Steven Son, R., (1978), Basic Liquid Chromatography, Varian,
California
Lindsay, S., (1992), High Performance Liquid Chrotomagraphy Second Edition,
John Wiley & Sons Inc, Chischer, New York
Snyder, L.R and Kirkland J.J., (1979). Introduction to Modern Liquid
Chromatography Second Edition, John Wiley & Sons.Inc, Chischer,
NewYork

17

18