Anda di halaman 1dari 25

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Perkembangan Kromatografi


Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang
akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan
fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu
proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu
diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu
menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul
atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).
Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang
berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga
menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang
pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan
tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk
kromatografi padatan cair (LSC).
Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov
dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik
sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak
hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk
pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James

mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir
tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih
(Sudjadi, 1986).
Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan
dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi
proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah
dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik
kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh
Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm -2 (3000p.s.i).
Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung
berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar
1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih
cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada
dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat
membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance =
Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed= Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah
berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan
kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian
membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini

dengan teknik yangsudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang
sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contohcontoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung
gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai
penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya
cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara
keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk
menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel
penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high
performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC
menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel
penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar,
2003).
HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam
penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam
fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia
HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau
sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan
sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit
tentang High Perfomance Liquid Chromatography.
2.2 Teknik Pemisahan dengan HPLC

Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat
atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair.
Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing- masing
komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen
merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara
fasa gerak dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada
fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).
Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan,
sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup
(melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi
yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya
baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka
dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang
digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai.
Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu
retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan.
a.

Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu
komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat
konsentrasi maksimum.

b. Faktor kapasitas (k) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k
kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k yang lebih besar, maka
pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya

melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k optimum, yaitu antara 1 sampai 10. Kolom dinyatakan
baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang
cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas () harus lebih besar
daripada 1., dimana semakin besar nilai maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat
diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa
diam; mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil
waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen.
c.

Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan
hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat.

d. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi R (ukuran besar
kecilnya pemisahan). Jika nilai R 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik.
e.

Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan
nilai Tf < 2,0.
Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke
arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang
berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai
pemakaian pelarut pengembangdengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC
didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan
dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah
senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities);
analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic,

maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace
elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.

2.3 Prinsip Kerja Dari KCKT


Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut
terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase
diam.
2.4 Kegunaan KCKT
Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ; analisis senyawa-senyawa
tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter
ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir
sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah
banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif dan
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
2.5 Mekanisme Kerja KCKT
Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai
macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom,
kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
Instrumen KCKT pada dasarnya tersiri atas delapaan komponen pokok yaitu :
1.

Wadah fase gerak

2.

Sistem penghantaran fase gerak

3.

Alat untuk memasukkan sampel

4.

Kolom

5.

Detektor

6.

Wadah penampung buangan fase gerak

7.

Tabung penghubung

8.

Suatu komputer atau integrator atau perekam

Gambar Rangkaian Instrumen HPLC

1.

Wadah fase gerak pada KCKT


Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan fase gerak harus dilakukan
degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul
dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Pada saat membuat pelarut pada fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut,
bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih terpilih lagi jika pelarutpelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade).

2.

Fase Gerak

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting dalam
pemilihan fase gerak.

Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi
sebagai fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan
detektor.

Beberapa deret eluotropik KCKT :


Parameter
Parameter
kekuatan
Pelarut

UV cut off
kekuatan pelarut

pelarut

(nm)
(partisi)

n-heksana
Sikloheksana
Tetraklorometan

(adsorbsi)
0,01
0,04
0,18

0,1
-0,2
1,6

195
200
265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang yang mana pada kuvet 1 cm,
pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk
menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar panjang
gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan
dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos alkohol.
3.

Pompa
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure)
dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi
menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan
suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau
peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor
sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa
syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat.Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa aliran fase
gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan konstan.
Syarat syarat pompa yang ideal:
a.

Mampu membangkitkan tekanan tinggi

b. Pulse free out put


c. Control laju alir yang akurat
d. Tahan korosi
e. Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak
f. Bebas pulsa
g. Perlude gasser

h. Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
i. Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
j. Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)

Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume
internalnya kecil sekitar 35 400 l, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi
menggunakan elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom
dan akibat dari kekentalan solven.
2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringe dengan sebuah
penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak
dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas
pompa terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh
gas bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis
pompa ini. Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya
sekitar 2000 psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat
digunakan untuk sistem elusi gradien.

4.

Injektor (penyuntikan sampel)

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang
mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga
tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal. Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana
mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama
halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).
Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya
dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak mengalir
melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk
sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk
otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT.
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang dibutuhkan oleh
senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagaiwaktu retensi. Waktu
retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan
ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki
waktu retensi yang berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari
fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi
yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom 1. Elusi Gradien Elusi Gradien didefinisikan
sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung.

Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang
tertahan kuat pada kolom. Dasar- dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien
menawarkan beberapa keuntungan :
a.

Total waktu analisis dapat direduksi

b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah


c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter
Tabung

Kolom konvensional
Stainless steel

kolom

Panjang 3,10,15,20 dan 25 Panjang 25 dan 50 cm

Fase diam

Kolom mikrobor
Stainless steel

cm

Diameter luar 0,25 inci

Diameter luar 0,25 inci

Diameter dalam 1 atau 2 mm

Diameter dalam 4,6 cm


Porous, silika ukuran kecil, Porous, silika ukuran kecil, silika
silika

yang

dimodofikasi yang dimodofikasi secara kimiawi

secara

kimiawi

phase),

atau

polimer

phase),

atau

polimer-

polimer- polimer stiren/divinil benzen.Ratastiren/divinil rata diameter partikel 3,5 atau

benzen.Rata-rata
partikel

(bonded (bonded

3,5

diameter 10m dengan kisaran sempit.

atau

10m

dengan kisaran sempit.

Tekanan

500-3000 psi

1000-5000 psi

operasional

(35-215 bar

(70-350 bar)

Fase gerak

Hidrokarbon+pelarut

Hidrokarbon+pelarut

terklorinasi

atau

alkohol atau alkohol untuk fase normal.

untuk fase normal. Untuk Untuk


fase

terbalik

terklorinasi

fase

terbalik

(reversed

(reversed phase) digunakan metanol atau

phase) digunakan metanol asetonitril

atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan

air
alir

atau
10-100

bufer.Kecepatan alir : 1-3 l/menit.Modifikasi instrumen


ml/menit

Sistem penghantaran pelarut yang


mampu memberikan kontrol aliran
di bawah 10l/menit.Katup injeksi
sampekl

Kinerja

bervolume

kecil;sel

detektor bervolume kecil.


Efisiensi meningkat dengan Sangat efisiensi dan sensitif, akan
bekurannya ukuran partikel tetapi lambat,konsumsi fase gerak
fase diam, akan tetapi umur hanya dari kolom konvensional.
kolom

dengan

ukuran

partikel 3 m lebih pendek.


Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom
konvensional, yakni :
1.

Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100
l/menit)

2.

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung
dengan spektrometer massa.

3.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini
sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan
di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran
panjang kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung
dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4 10 mm dengan ukuran partikel 5 10 m.
Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000 lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan kecepatan
dan kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran
partikel 3 5 m. Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga 100.000 hanya dengan
panjang 3 sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang
diperlukan dalam pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi pertimbangan penting karena
mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi (chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel
berpori (porous particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori
berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 m. Lapisan tipis berpori silika,
alumina, divinil benzen sintetis polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada
permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3
10m terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar

kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara
kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis
sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. Kolom diisi
dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang
berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan fasa gerak yang
dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.
Komponen- komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak
yang satu sama lain tidak bercampur. Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari
besarnya partikel fase stasioner. Oleh karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka
tinggi plat teoritik akan berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang
meningkatkan efisiensi kolom. Dengan kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan
berjalan dengan cepat.
Terdapat banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat
diatur dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang
lebih tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan
viskositas fase gerak yang agak tinggi.
6. Fase diam

Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.Permukaan silika
adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen yang akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis
karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu
karekateristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang
tidak dimodifikasi.

Oktadesil silika (ODS atau C18 )merupakan fase diam paling sering digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor (tailing peak) pada
penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi
antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada silika.Masalah ini dapat
diatasi dengan end-chapping yakni proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus
trimetilsilil dan menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi
(kandungan logam <1ppm)

7.

Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti
detektor indeks bias dan detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang

hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, detektor
Fluoresensi dan elektrokimia.

Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :


1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10 -8 hingga 1015

gram zat terlarut per pembacaan

2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik


3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
4) Waktu respon yang singkat
5) Kemudahan pada penggunaan
6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak

Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :


1.

Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel

2.

Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat
kecil.

3.

Stabil dalam pengoperasiannya

4.

Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk
kolom konvensional, selnya bervolume 8l atau lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya
bervolume 1 l atau lebih kecil lagi.

5.

Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier).

6.

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :

1) Detektor Absorban (UV-Vis)


Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi.
Untuk meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil
mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 10 l dengan panjang sel 2 10 mm. Umumnya sel
detektor mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan
diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.
2) Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluorofotometer. Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan
filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu Xenon digunakan pada
instrumen yang lebih baik dengan gratting sebagai monokromatornya.
3) Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel.
Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara bersamaan
untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4) Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan
dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan
detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5) Detektor Spektra Massa
Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada
kecepatan alir 10 50 l per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan,
dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa.

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah

dipakai

untuk

menjelaskan

yaitu

penggunaan

serapan

ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika
anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada
sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang
diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak
mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap
dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.
2.6 Jenis Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
a. Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat agak
polar. Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Jenis
kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut
jugakromatografi fasa normal.
b. Kromatografi partisi

Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar. Jenis
kromatografi ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya lebih polar
daripada fasa diam. Salah satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas sebagai
ketidakcampuran kedua fasa. Karena keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak digunakan
lagi sebagai teknik analisis rutin.
c. Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling banyak
digunakan saat ini. Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat dan kromatografi partisi
memiliki persamaan. Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang
dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam pada kromatografi partisi
terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan zat cair non polar.
Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :
1) Merupakan fasa yang stabil
2) Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung bila kepolaran solutsolut bervariasi.
3) Kolom mempunyai umur panjang.
4) Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik.
5) Lebih ekonomis.
d. Kromatogarfi penukar ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau molekulmolekul yang dapat diionkan. Ion-ion bersaing dengan ion-ion fase gerak untuk memperebutkan
tempat berikatan dengan fasa diam. Dasar pemisahan kromatografi ini berasal dari perbedaan
afinitas senyawa bermuatan terhadap permukaan penukar ion.

e. Kromatografi ekslusi ukuran


Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi
ukuran. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori paking kolom.
Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan
dikenal dengan istilah volume terekslusi begitu pula sebaliknya. Teknik ini berguna untuk
mengkarakterisasi distribusi berat molekul polimer, pemurnian cuplikan biologis dan pemisahan
senyawa-senyawa dengan berat molekul 2000 atau lebih
2.7 Ada 3 sistem KCKT yang dikenal, yaitu:
1. Sistem elusi isokratik (isocratic elution)
Sampel diinjeksikan ke dalam kolom yang komposisi fasa geraknya tidak berubah selama analisis dilakukan sampai
sampel terelusi dari kolom, sistem isokratik yang memiliki nilai k (rasio atau koefisien partisi yang bervariasi) akan
menghasilkan resolusi yang buruk dan sukar mendeteksi pita elusinya.
2. Sistem elusi gradient (gradient elution)
Ada perubahan fasa gerak baik secara bertahap atau berkesinambungan selama proses berlangsung. Pada mulamula elusi, seluruh komponen sampel ditahan di bagian atas kolom, setelah gradien mulai, kekuatan elusi fase
gerak akan meningkat. Pada akhirnya harga k akan menjadi cukup kecil sehingga komponen zat tersebut akan
bermigrasi sepanjang kolom secara cepat sampai ia keluar dari kolom.
3. Sistem elusi bertahap
Baik digunakan untuk sampel yang mengandung komponen-komponen yang bergerak cepat, yang diikuti senyawasenyawa yang lambat gerakannya, tetapi tidak mengandung senyawa dengan nilai k setelah sampai diinjeksikan.
Komposisi fase gerak secara bertahap diganti.
Hasil sistem KCKT dan optimasinya sangat tergantung pada beberapa hal, antara lain :
a. Temperatur
b. Tekanan
c. Diameter partikel fase diam
d. Viskositas
e. Panjang kolom

Secara sistematik diagram alat HPLC dapat digambarkan sebagai berikut:

2.8 Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC


Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography
(HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis
terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara
lain:
a.

Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

b. Mudah melaksanakannya
c.

Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

d. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik
e.

Dapat digunakan bermacam- macam detektor

f.

Kolom dapat digunakan kembali

g. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.

h. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC

dilakukan pada suhu kamar.


i.

Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.

j.

Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat
tinggi seperti polimer

k. Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
l.

Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak
analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

m. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
n. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
o. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.
p. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (1012 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll,
dapat juga digunakan dalam HPLC
q. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom
yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven
yang digunakan

r.

Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC
dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut.

s.

Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan
destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.

t.

Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.
Sedangkan kekurangannya adalah:

a.

Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

b. Hanya bisa digunakan untuk asam organic


c.

Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi

d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas


- See more at: http://ekaandrians.blogspot.co.id/2013/04/hplc.html#sthash.1VhIrrjc.dpuf

DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press.
Surabaya.
Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga
University Press. Surabaya.
Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.
Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis
Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.
Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi.
Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3
Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta.
- See more at:
http://ekaandrians.blogspot.co.id/2013/04/hplc.html#sthash.1VhIrrjc.dpuf