Anda di halaman 1dari 11

NAMA

: FITRA ADI PRAYOGO


NIM
: 24020112130110
TUGAS RESUME KULIAH REKAYASA GENETIKA

RESUME 1 : PCR (Polimerase Chain Reaction)


1. PCR : Teknik memperbanyak atau mengamplifikasi suatu sekuens tertentu dari total DNA.
2. Prinsip Dasar : Reaksi polimerase berulang yang dimulai dari suatu primer yang dirancang
khusus untuk memperbanyak sekuens target.
3. Primer : Oligonukleotida pendek sekitar 20 bp yang pada urutan basanya sama pada
ujung-ujungnya.
4. Primer ada 2 : Primer Forward dan Primer Reverse.
5. Primer Forward : Menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 5 ------- 3.
6. Primer Reverse : Menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 3 ------- 5.
7. Tahap Tahap PCR :

Pre-Denaturasi : Tahap ini merupakan tahap untuk mempersiapkan proses berikutnya,


yaitu denaturasi (Pemanasan), Suhu yang digunakan 95C. Hanya terdiri dari satu
siklus selama 5 menit.

Denaturasi : Tahap pemisahan antara untai satu dengan yang lain sehingga masing
masing menjadi untai tunggal. Suhu yang dipakai 94C. Proses yang tidak sempurna
dapat memutuskan rantai DNA. Jika terlalu lama dapat menghilangkan aktivitas
enzim polimerase.

Annealing : Tahap terpenting. Faktor yang mempengaruhi adalah suhu annealing dan
primer. Suhu rendah dapat mengakibatkan primer tidak dapat melekat pada untai
DNA dengan kurang sempurna. Suhu Tinggi dapat mengakibatkan salah sasaran, atau
primer melekat pada urutan basa yang salah. Suhu melting annealing primer optimum
dapat diukur dengan rumus Tm = 2 ( A+T ) + 4 ( G + C ). Setelah itu dari masing
masing dikurangi 5C ( Suhu = Tm - 5C ). Lalu hasil keduanya dihitung rata
ratanya.

Ekstention : Proses pemanjangan untai DNA yang telah melekat pada primer. Suhu
optimal yang dipakai 72C, bertujuan untuk mengaktifkan Enzim Taq Polimerase.
Enzim Taq Polimerase berasal dari bakteri Thermus aquaticus. Penggandaanya n2.

Post PCR : Tahap ini hanya tahap optimalisasi proses running. Suhu 72C, 1 Siklus, 7
Menit.

Finalizing : Tahap penyelesaian. Suhu 4C.

8. Fungsi Penambahan :

ddH2O : Pelarut dalam PCR mix.

Buffer dream Taq : Penyangga larutan.

dNTP : Pembentuk Basa Komplementer dan Penyusun DNA. Terkandung DNA


template, Sepassang Primer, dan campuran nukleotida. Berisi dATP, dGTP, dCTP,
dTTP.

DNA template : cetakan DNA yang akan diamplifikasi. Berisi sekuens target untuk
penempelan primer.

Taq Polimerase : Enzim Polimerase.

9. Faktor yang mempengaruhi :

PCR mix (DNA template, Enzim Polimerase, Buffer, dNTP, Primer)

Temperature Annealing

Panjang Siklus Tahap tahap PCR.

10. Amplifikasi DNA : Metode untuk melipatgandakan untai DNA target.

RESUME 2 : Elektroforesis

1. Prinsip Kerja : Migrasi fragmen DNA yang bermuatan negatif ke kutub positif tangki
elektroforesis melalui membran matrix gel agarose akibat dialiri medan listrik.
2.

Elektroforesis adalah teknik pemisahan senyawa yang memiliki muatan dengan

meletakkannya pada medan listrik.


3.

Gel yang digunakan Gel Agarose karena gel agarose memiliki kemampuan untuk

menampung ukuran fragmen yang lebih besar.


4. Gel agarose yang digunakan memiliki konsentrasi 0,8 %, karena dengan konsentrasi
tersebut diharapkan ideal bagi ukuran fragmen yang dipakai pada praktikum ini.
5. Pada prinsipnya dalam memilih konsentrasi gel agarose semakin besar konsentrasi gel
agarose yang digunakan semakin kecil ukuran fragmen yang dapat digunakan.
6. Running Elektroforesis ini bertipe Reptetion (Seperti Reptil).
7. Buffer TAE (50ml) : Memiliki fungsi sebagai penyangga dan media penghantar listrik
yang tepat.
8. Loading Dye (1l) : Berisi pelarut ddH2O, Pewarna Bromophenol Blue/Silen Silanol,
pemberat Sukrosa/Gliserol.
9. Ethidium Bromida (EtBr) : Berfungsi untuk mengikat DNA dan menyebabkan DNA yang
ada pada gel agarose dapat berpendar saat disinari UV.
10.Elektroforesis ada dua macam : Elektroforesis Horizontal dan Vertikal.
11.Berdasarkan jenisnya Elektroforesis terbagi menjadi dua, yaitu : Elektroforesis Zona dan
Elektroforesis Bebas.
12.Elektroforesis Bebas : Molekul yang akan dipisahkan disebar ke seluruh permukaan gel,
dan kemudian diliri listrik. Akibat aliran listrik tersebut akan membentuk batas diantara
dua larutan.

13.Elektroforesis Zona : Molekul diletakkan pada zona zona yang telah dibuat dan
ditentukan, yang kemudian dialiri listrik. Akibat dari aliran listrik tersebut terjadinya
migrasi.
14.Power Supply yang digunakan : 400mA, 90 V, 30 Menit.
15.Marker yang digunakan 3l, 1 kb.
16.Faktor yang mempengaruhi Elektroforesis :

Ukuran Molekul DNA

Konsentrasi Gel

Bentuk Molekul

Arus Listrik dan Voltase

Arah Medan Listrik

Densitas Muatan

17.Gel Doc : Perangkat digital yang digunakan untuk mendokumentasikan hasil


elektroforesis yang memanfaatkan sinar UV untuk memendarkan fragmen DNA.
18.Componen Gel Doc : Camera, Komputer (Software), dan Sinar UV.

RESUME 3 : Squencing

1. Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang
relatif pendek . Pengurutan ( sequencing ) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui
kode genetic dari molekul DNA.
2. Prinsip dasar : DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain
Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya
dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim
dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa
pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.
3. Yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:
Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang)

seperti PCR

ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan

menghilangkan gugus 3-OH pada ribosa.


4. Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA

Metode Maxam-Gilbert

Metode Maxam-Gilbert merupakan metode yang didasarkan atas pemotongan


DNA didaerah spesifik oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini
sekarang jarang digunakan .

Metode Sanger.
Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun

1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah
yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP,
yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A
jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
5. Komponen-komponen yang terlibat dalam proses squencing meliputi:

Beberapa kopi dari template DNA utas tunggal

Primer yang sesuai (sepotong DNA yang dapat berpasangan dengan DNA template
yang bertindak sebagai titik mulai untuk replikasi)

DNA polymerase (suatu enzim yang meng-kopi DNA, menambahkan nukleotid baru
pada ujung 3 dari template)

Suatu kolam berisi nukleotida normal

Sejumlah kecil dideoksinukleotida terlabel (radioaktif atau dengan pewarna fluoresent

6. Hasil dari skuencing adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang satu
sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen tersebut kita dapat
menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul DNA yang diperiksa.
5. DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini bisa dikembangkan untuk
berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa
keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism), community analysis seperti tRFLP (Terminal Restriction Fragment Length
Polymorphism) untuk mengetahui apakah individu tersebut membawa varian tertentu dari
satu gen atau mengetahui adanya mutasi dan aplikasi lainnya.

RESUME 4 : Hibridisasi
1. Hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida
yang saling komplementer melalu perpasangan basa N. Hibridisasi dapat menunjukkan
suatu keseragaman sekuens. Pasangan DNADNA, DNARNA, atau RNARNA dapat
terbentuk melalui proses ini[1] .Hibridisasi DNADNA terbentuk dalam Southern blotting
sedangkan hibridisasi DNARNA terbentuk dalam Northern blotting.
2.

RESUME 5 : Pustaka Genom dan cDNA

3. Genom dalam genetika dan biologi molekuler modern, adalah keseluruhan informasi
genetik yang dimiliki suatu sel atau organisme, atau khususnya keseluruhan asam
nuklet yang memuat informasi tersebut. Secara fisik, genom dapat terbagi menjadi
molekul-molekul asam nukleat yang berbeda (sebagai kromosom atau plasmid),
sementara secara fungsi, genom dapat terbagi menjadi gen-gen.

4. Pustaka genom merupakan koleksi berbagai klon bakteri yang berisi plasmid
rekombinan maupun koleksi klon fage yang mengandung DNA rekombinan.
5. Di dalam pustaka genom ini, setiap plasmid rekombinan atau setiap DNA fage
rekombinan membawa salah satu potongan atau fragmen DNA genom yang dipelajari
6. DNA komplemen atau comlementary DNA (cDNA) merupakan DNA untai tunggal
(single-stranded) sintetik/buatan yang disalin dari untai mRNA menggunakan teknik
PCR dengan memanfaatkan enzim reserve transcription. Penggunaan cDNA ini sangat
luas, terutama dalam analisis ekspresi genetik dan transkriptomika. mRNA berkas
tunggal atau transkriptom bersifat tidak sabil karena mudah dicerna dan dilebur dalan
sel. Pengubahan mRNA berkas tunggal menjadi cDNA membuatnya lebih mudah
dianalisis karena DNA lebih stabil (tidak mudah dilebur).
7. Sintesis cDNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim reverse transkriptase dan
primer oligo dT yang akan menempel pada daerah ekor poli A yang merupakan ciri
khas dari mRNA
8. Tahap sintesis: a) isolasi mRNA : mRNA yang digunakan merupakan hasil isolasi dari
eukariot. mRNA digunakan karena lebih spesifik terhadap ekspresi gen yang
dihasilkan. mRNA digunakan karena pada mRNA terdapat ekor polyA karena adanya
proses poliadenilasi yang tidak dimiliki oleh RNA lainnya, seperti rRNA dan tRNA . b)
visualisasi : menggunakan gel agarosa untuk mengetahui hasil isolasi. c) sintesis cDNA
untai pertama : pada tahapan ini diperlukan enzim reverse transcriptase yang akan
mengkatalisis sintesis pita tunggal DNA dari cetakan mRNA dengan bantuan primer
oligo dT yang akan menempel pada poli A ujung 3 dari mRNA. Kemudian, mRNA
didegradasi dengan menggunakan ribonuklease atau larutan basa.

RESUME 6 : Particle Bombardment


1. Teknik paling modern dalam transformasi tanaman adalah penggunaan metoda gene gun
atau particle bombardment. Metode transfer gen ini dioperasikan secara fisik dengan
menembakkan partikel DNA-coated langsung ke sel atau jaringan tanaman. Dengan cara
partikel dan DNA yang ditambahkan menembus dinding sel dan membran, kemudian
DNA melarut dan tersebar dalam secara independen. Telah didemonstrasikan bahwa
teknik ini efektif untuk metransfer gen pada bermacammacam eksplan. Penggunaan
senjata gen memberikan hasil yang bersih dan aman, meskipun ada kemungkinan terjadi
kerusakan

sel selama

proses

penembakan berlangsung.

Penggunaan particle

bombardment membuka peluang dan kemungkinan lebih muda dalam memproduksi


tanaman transgenik dari berbagai spesies yang sebelumnya sukar ditransformasi dengan
Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil seperti padi, jagung, dan turfgrass.
2. Particle bombardment Yaitu teknologi yang menggunakan metode penembakan partikel
atau gen gun. DNA yang melapisi partikel ditembakkan secara langsung ke dalam sel
atau jaringan tanaman (Klein et al.1988). Partikel yang mengandung DNA tersebut
menembus dinding sel dan membran, kemudian DNA berdifusi dan menyebar di dalam
sel secara independen. Metode transformasi dengan penembakan partikel pertama kali
diaplikasikan pada jagung oleh Gordon-Kamm et al. (1990) dan berhasil mendapatkan
jagung transgenik yang fertil.

RESUME 7 : Transformasi Agrobacterium tumefaciens

1. Transformasi gen adalah proses dimana DNA asing dimasukkan kedalam sel tanaman,
dimana pemulian tanaman dapat memasukkan gen asing kedalam sel atau jaringan
tanaman, baik secara langsung maupun tak langsung tanpa merujuk kepada tingkat
hubungan genetik atau kompatibelilitas suatu jenis. Teknologi pemindahan gen atau
transfer gen dapat dibedakan menjadi dua, yaitu langsung Contohnya adalah
perlakuan

pada

protoplas

tanaman

dengan

eletroporasi

atau

dengan polyethyleneglycol (PEG), penembakan eksplan gen dengan gene gun atau di

vortex dengan karbit silikon. Kedua yaitu tidak langsung contohnya adalah dengan
bantuan bakteri Agrobacterium. Bakteri ini mampu mentransfer gen kedalam genom
tanaman melalui eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf disc ) atau bagain lain
2.

dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi beregenerasi tinggi.


Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak
digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan

3.

suatu tanaman transgenik.


Proses : Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens.
Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami karena
memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di
dalam plasmid Ti terdapat gen yang menyandikan sifat virulensi untuk menyebabkan
penyakit tanaman tertentu. Gen asing yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman dapat
disisipkan di dalam plasmid Ti. Selanjutnya, A. tumefaciens secara langsung dapat
memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA) tanaman. Setelah
DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat

diekspresikan tumbuhan.
4. Peran Agrobacterium sangat besar dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi
untuk mendapatkan sifat yang diinginkan. Peran Agrobacterium dalam hal ini ialah
sebagai

pembawa gen (DNA) yang diinginkan. Agrobacterium tumefaciens

merupakan bakteri aerob obligat gram negatif yang hidup alami di tanah.
Kemampuannya dalam menyebabkan penyakit ini berhubungan dengan gen
penginduksi tumor yang ada pada plasmid (Ti) yang dijumpai dalam bakteri tersebut.