coagulase-negative

staphylococci (CoNS), dan

Serratia marcescens (S.
marcescens) diisolasi dari
spesimen klinis. Semua
mikroorganisme yang dikultur
secara aerob pada 37 C
selama 24 jam. Pada akhir
inkubasi, mikroorganisme
dipanen dengan sentrifugasi,
dicuci 3 kali dalam phosphatebuffered saline (PBS), dan
disesuaikan pada konsentrasi
108 CFU / mL (colony forming
unit) di PBS. Strain yang tidak
aktif oleh paparan sinar UV
selama 15 menit untuk
menghambat pertumbuhan
mikroba yang tidak terkendali,
yang dikonfirmasi oleh
penghitungan layak negatif,
dan kemudian disimpan pada
-70 C.
Persiapan sumsum tulang
Tikus dikorbankan dengan
cara dislokasi leher. Femur
(Tulang paha) dan tibiae
(tulang kering) tikus dihapus
dan dimurnikan dari jaringan
otot sekitarnya dengan
menggosok dengan kertas
tissue. Setelah itu tulang utuh

yang tersisa dibiarkan dalam

70% etanol selama 2-5 menit
untuk desinfeksi dan dicuci
dengan PBS. Kemudian kedua
ujungnya dipotong dengan
gunting dan sumsum dibilas
dengan PBS menggunakan
jarum suntik dengan diameter
jarum 0,45 mm. Bagian
dalam suspensi sumsum
dihancurkan dengan oleh
pemipetan yang kuat dan
dicuci di PBS (14).

Kultur sel sumsum tulang

dengan GM-CSF
Prinsip motode untuk
menghasilkan BM-DC dengan
GM-CSF diadaptasi dari
publikasi sebelumnya (12).
Medium kultur sel (RPMI
lengkap) adalah RPMI-1640
(Sigma, Jerman) dilengkapi
dengan penisilin (100 U / mL,
Biochrom AG, Jerman),
streptomisin (100 ug / mL,
Biochrom AG, Jerman), Lglutamin (2 mM, Biochrom AG,
Jerman), 2 mercaptoethanol
(50 pM, Fluka Swiss), dan 10%
FCS yang diinaktivasi dengan

panas (Biochrom AG, Jerman).

Pada hari 0 BM leukosit yang
diunggulkan pada 2 106 per
100 mm diremukkan dalam
10 mL RPMI lengkap
mengandung 200 U / mL (=
20 ng / mL) rmGM-CSF (5
106 U / mg; Peprotech, USA).
Medium kultur diganti
sebagian setiap 3 hari dan
ditambahkan sitokin segar
(200 U / mL rmGM-CSF). Untuk
pematangan (maturation)
yang lengkap pada hari 10,
sel tidak patuh dikumpulkan
dengan pipetting secara
perlahan, disentrifugasi pada
300 g selama 5 menit pada
RT, dan disuspensi dengan 10
mL RPMI lengkap yang segar
dalam 100 mm piring plastik
kultur jaringan yang
mengandung 100 U / mL
rmGM-CSF dan
lipopolisakarida (LPS, Sigma,
Jerman) pada 1 mg / mL. Sel
kemudian dibudidayakan
selama 1 atau 2 hari lagi. Sel
yang dikultur dicuci sekali dan
volume aliquot dicampur
dengan perbandingan 1: 1
dalam Trypan Blue solution
(Sigma, Germany)

Pemisahan sel dan aliran

cytometry
CD11c + DC dimurnikan
melalui magnetik pemilahan
sel (MACS) dengan
menggunakan seleksi positif
menurut protokol produsen
(Miltenyi, USA). Secara
singkat, sel-sel diinkubasi
dengan magnet microbeads
terkonjugasi dengan
monoklonal anti-tikus Antibodi
CD11c di MACS buffer selama
15 menit pada 4 C. Setelah
itu, sel-sel dijalankan melalui
kolom MACS (Miltenyi) dalam
medan magnet. Kolom
kemudian dihapus dari
magnet, dan sel-sel positif
dialirkan keluar. Kemudian
CD11c + DC dianalisis lebih
lanjut oleh aliran cytometer
(Coulter, USA).
Preparasi kultur sel
Satu mililiter BM-DC (106)
Dimasukkan kedalam sumur.
Satu mililiter dari 5 UVpembunuh mikroorganisme
yang berbeda (106 CFU / mL)
seperti E. coli, S.marcescens,
MRSA, kontra, dan C. albicans
ditambahkan ke sumur.
Dengan demikian, DC

dirangsang oleh UVpembunuh mikroorganisme.

Botol/labu kultur kontrol tidak
mengandung mikroorganisme.
Mereka hanya berisi DC dan
media. Setiap sampel diteliti
dalam rangkap tiga. Plat
kultur kontrol dan plat kultur
yang mengandung UVpembunuh mikroorganisme
diinkubasi selama 24 jam
dalam 5% CO2 pada 37 C.
Pada akhir periode ini, isi dari
plat kultur dipindahkan ke
tabung dan disentrifugasi.
Supernatan kultur yang
dihapus dan disimpan pada
-70C sampai digunakan pada
enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA).

Sekresi sitokin
Level sitokin seperti TNF-,
IFN-, IL-1,
IL-2, IL-4, dan IL-6 (minimum
dosis terdeteksi; 1,7 pg / mL
untuk TNF-, <4 pg / mL

untuk IFN-, 1 pg / mL untuk

IL-1, 4 pg / mL untuk IL-2, <2
pg / mL untuk IL-4, <2 pg / mL
untuk IL-6) ditentukan dengan
teknik spesifik ELISA menurut
instruksi dari pabrikan
(Biosource, California, USA).
Konsentrasi sitokin ditentukan
secara spektrofotometri.
Absorbansi terbacakan pada
450 nm (Biotek, USA). Kami
membuat standar kurva
menggunakan standar sitokin.
Konsentrasi sitokin untuk
sampel yang tidak diketahui
dihitung menurut kurva
standar.