Anda di halaman 1dari 23

STUDI MORFOLOGI DAN DISTRIBUSI PIGMEN BUNGA

SERTA ANALISIS KERAGAMAN GENETIK DENGAN MARKA SNAP


PADA ANGGREK PHALAENOPSIS

MEGA DEWI HARISTIANITA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUTE PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015

STUDI MORFOLOGI DAN DISTRIBUSI PIGMEN BUNGA


SERTA ANALISIS KERAGAMAN GENETIK DENGAN MARKA SNAP
PADA ANGGREK PHALAENOPSIS

MEGA DEWI HARISTIANITA

Proposal Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUTE PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Anggrek merupakan salah satu kelompok tumbuhan Angiospermae
terbesar. Habitat ekologi anggrek tersebar hampir diseluruh dunia, dapat
ditemukan di daerah pesisir hingga daerah dataran tinggi sekalipun. Anggrek
tergolong tanaman hias yang memiliki nilai ekonomi tinggi dan dapat menjadi
komoditi ekspor utamanya karena keindahan dari morfologi bunga, seperti warna
bunga, bentuk bunga, dan aroma bunga, serta salah satu jenis anggrek yang
memiliki potensi bernilai ekonomi tinggi adalah anggrek Phalaenopsis. Morfologi
dan warna bunga anggrek sangat beragam motif dan variasinya, hal tersebut
berkorelasi dengan keragaman genetik yang dimiliki oleh tiap genotif khususnya
pada bagian lokus atau gen yang berhubungan dengan perkembangan bunga dan
biokimia penyusun pigmen bunga tanaman anggrek. Jalur biokimia dan basis
genetik dari biosintesis pigmen bunga anggrek masih belum teridentifikasi secara
utuh, karena bunga anggrek sendiri memiliki variasi pigmen dan pola novelty
yang tidak terhingga, baik pada anggrek spesies maupun anggrek hibrida
(Puspitaningtyas dkk., 2003).
Flavonoid, karotenoid, dan betalain adalah tiga kelas utama senyawa
pigmen pada tanaman tingkat tinggi yang bertanggungjawab dalam produksi
pigmentasi pada bunga (Davies, 2004). Diantara ketiga senyawa pigmen tersebut,
flavonoid adalah yang paling responsif untuk rentang warna bunga yang luas,
termasuk kuning muda (Ono et al, 2006), ivori, pink, magenta, merah, biru, dan
ungu (Handini, 2014), termasuk yang baru diketahui pigmen putih juga
diturunkan dari jalur biosintesis flavonoid. Pada beberapa kasus, warna bunga
berkorelasi dengan tipe dari antosianidin (seperti antosianin dengan senyawa gula
atau bentuk konjugat yang lain) yang muncul. Walaupun faktor lingkungan
(intensitas cahaya, suhu, dan stres air) juga dapat berpengaruh pada warna bunga.
Faktor biotik seperti pH vakuola, kehadiran ion besi, keberadaan co-pigmentasi,
dan bentuk sel juga dapat berefek pada warna bunga (Davies, 2004).

Program pemuliaan tanaman anggrek memperkaya variasi pigmen dan


pola warna bunga anggrek yang ditujukan untuk mendapatkan tanaman anggrek
yang bernilai jual tinggi. Pola pewarisan ini bersifat acak namun dapat diarahkan,
khususnya apabila telah diketahui genetik yang diduga akan mengendalikan sifat
tertentu (Anserson, 2007), seperti halnya sifat pigmentasi bunga anggrek yang
berpotensi tinggi untuk dikembangkan. Karakter warna bunga adalah karakterkarakter yang komplek, melibatkan berbagai jalur biokimia, enzimatik serta gengen yang mengkode tiap protein atau enzim dalam tahap tersebut. Setiap tahapan
katalisasi dalam jalur biosintesis pigmen dikode oleh gen, sehingga dalam satu
rangkaian jalur biosintesis pigmen dikode oleh berbegai gen yang memiliki peran
masing-masing. Karakter runutan DNA dari gen inilah yang secara langsung
ataupun tidak langsung menjadi satuan molekular keragaman genetik tanaman
anggrek khususnya.
Karakter bunga, khususnya pada anggrek menjadi subjek utama dalam
pengembangannya. Dibandingkan dengan tanaman jenis lain, anggrek merupakan
salah satu yang pewarisan sifat warna bunganya sulit untuk dideteksi karena
siklus vegetatif tanaman anggrek cukup memakan waktu lama dan sejak dini sulit
untuk menentukan arah fenotipe bunga anakan. Seleksi dan deteksi dini perlu
dikembangkan agar produksi anggrek lebih efisien dan efektif. Marka molekular
adalah salah satu metode yang prospektif untuk cara deteksi dini orientasi fenotipe
suatu anggrek (To & Wang, 2006). Pendekatan molekular memanfaatkan gen-gen
yang berkorelasi dengan suatu sifat tertentu dan kemudian berdasarkan variasi
sekuen masing-masing gen dapat ditarik suatu pola yang mengarah pada
keragaman genetik.
Oleh karena itu, data molekular dapat dijadikan data pendukung untuk
data morfologi dan biokimia guna mempelajari dan membuat suatu perangkat
analisis untuk karakterisasi pola pigmentasi bunga anggrek Phalaenopsis, yang
nantinya bisa di aplikasikan baik untuk kepentingan pemuliaan, penentuan tetua,
ataupun deteksi dini tanaman anggrek Phalaenopsis unggul.

Tujuan Penelitian
1. Mengetahui keragaman morfologi dan pola pigmentasi senyawa pigmen
pada anggrek Phalaenopsis.
2. Mengisolasi dan mengkarakterisasi gen biosintesis flavonoid (F35H,
F3H, F3H/DFR) dan karotenoid (PSY)
3. Mengetahui adanya keragaman genetik dengan marka SNAP berbasis gen
pigmen bunga atau co-pigmen karotenoid dan flavonoid pada tanaman
anggrek Phalaenopsis.

2 TINJAUAN PUSTAKA
Keragaman Anggrek Phalenopsis
Anggrek

secara

taksonomi

diklasifikasikan

ke

dalam

filum

Spermatophyta, yaitu kelompok tumbuhan berbiji; kelas Angiospermae atau


berbiji tertutup; subkelas Monokotiledonae atau berbiji berkeping satu; ordo
Gynandrea karena alat reproduksi jantan dan betina bersatu sebagai tugu bunga;
dan famili Orchidaceae atau kelompok tanaman anggrek. Anggrek Phalaenopsis
merupakan salah satu jenis anggrek alam yang memiliki nilai komersil karena
keindahan dan produk alam yang dihasilkannya, selain jenis anggrek lainnya
seperti Vanda, Dendrobium, Rhynchostylis, Paphiopedilum, dan Vanilla.
Phalaenopsis merupakan salah satu marga anggrek (Orchidaceae) yang
dikenal karena memiliki bentuk dan warna bunga yang menarik. Bentuk bunga
Phalaenopsis sangat khas menyerupai bentuk sayap kupu-kupu, sehingga anggrek
ini diberi nama Phalaenopsis yang berasal dari kata Phalaina (= lebah atau
kupu-kupu) dan opsis (= penampakan) yang mengandung arti jenis anggrek
yang morfologinya menyerupai kupu-kupu atau lebah (Puspitanintyas &
Mursidawati, 1999). Indonesia sebagai negara tropis memiliki banyak sekali jenis
anggrek Phalaenopsis alam (kurang lebih 21 spesies) dengan segala variasi
bentuk dan warna bunga yang menarik. Kurang lebih ada 45 spesies anggrek
Phalaenopsis di dunia yang sudah teridentifikasi, yang sebagian besar berada di
negara tropis. Daerah penyebarannya meliputi India, China, Vietnam, Burma,

Thailand, Malaysia, Indonesia, Filipina, Papua Nugini sampai ke benua Australia


bagian utara (Neil, 2007).
Phalaenopsis merupakan anggrek monopodial yang dicirikan sebagai
tanaman epifit atau litofit. Akarnya agak pipih, berdaging dan mengandung
klorofil. Berbatang pendek yag seluruhnya terbungkus oleh pangkal pelepah daun.
Daunnya berwarna hijau atau hijau muda mengkilat, agak lonjong yang biasanya
semakin melebar pada ujungnya, tanpa tangkai daun. Bunga Phalaenopsis
memiliki morfologi perhiasan bunga yang terdiri atas tiga sepal berselang seling
dengan tiga petal, berjajar atau bertumpuk satu sama lain dalam susunan yang
beragam. Petal yang tidak berpasangan yang berada di posisi tengah-depan
disebut dengan lip atau labellum (bibir bunga). Column atau gynandrium
berdaging, tegak atau berbentuk busur. Antera (stamen) berada mengarah di dalam
column, umumnya berada di ujung terminal dengan pada bagian dasar
dibawahnya terletak ovary.

Gambar 1. Bunga dan bagian-bagian bunga anggrek Phalaenopsis


Susunan bunga bermacam-macam bentuknya ada yang tunggal, tandan,
hingga malai. Marga Phalaenopsis dapat berbunga serentak atau bergantian.
Jumlah bunganya sedikit (1 kuntum) hingga banyak (30 kuntum). Kelopak
mahkota tidak berlekatan, dan ukuran antara kelopak dan mahkota relatif sama
atau ukuran mahkota lebih besar dan lebar. Marga Phalaenopsis memiliki
keragaman yang tinggi dalam hal warna bunga, dengan ciri khas warna mencolok.
Variasi warna bunga dasar anggrek ini juga mencakup jenis warna yang luas
seperti putih, merah jambu, ungu, kuning dengan hiasan corak dan pola warna

lain. Variasi motif seperti pola garis atau totol merah hati, coklat, dan merah
jambu menimbulkan kesan warna kontras.
Keberagaman warna dan corak bunga anggrek Phalaenopsis juga banyak
dipengaruhi oleh faktor genetis. Program pemuliaan tanaman melalui persilangan
baik melalui persilangan sendiri (selfing), perkawinan silang (crossing) serta
perkawinan intergenerik antar genus, dapat menghasilkan keragaman konstitusi
genetik dalam tanaman dan populasi sehingga mempengaruhi frekuensi atau
macam fenotif yang terbentuk. Tanaman yang tumbuh dari biji hasil persilangan
dua tetua yang berbeda dikenal dengan istilah tanaman hibrida. Persilangan dua
tetua yang memiliki karakter yang berbeda jauh untuk karakter tertentu (seperti
warna dan corak bunga) dapat menghasilkan variasi anakan sama seperti tetua dan
juga bentuk kombinasi antara kedua tetua. Persilangan antar dua tanaman hibrida
akan menghasilkan zuriat yang beragam dengan sifat genetis yang bervariasi di
kedua sifat induknya (To & Wang, 2006).

Pigmen Tanaman dan Biosintesisnya


Pigmen tanaman, termasuk warna dan pola warna bunga merupakan
ekspresi dari akumulasi senyawa pigmen yang dihasilkan melalui suatu
mekanisme jalur biosintesis tertentu. Pigmen pada tanaman tingkat tinggi secara
umum dibagi menjadi 3 kelas besar yaitu kelompok flavonoid, karotenoid dan
betalain, dan flavonoid merupakan kelompok penghasil pigmen yang paling
responsif dan menghasilkan warna tanaman dalam cakupan gradasi yang luas.
Berdasarkan karakteristik struktur pigmen alami dapat diklasifikan menjadi 5
kelompok yaitu turunan tetrapyrrole (klorofil dan warna heme), turunan
isoprenoid (karotenoid dan iridoid), senyawa N-heterosiklik yang berbeda dengan
tetrapyrrole (pterin, flavin, betalain), turunan benzopiran atau senyawa
heterosiklik teroksigenasi (antosianin dan pigmen flavonoid lainnya, seta quinone
(benzequinon,

anthraquinone,

serta

melanin).

Flavonoid

dan

betalain

diakumulasikan pada organel vakuola tanaman namun karotenoid diakumulasikan


di plastida ditempat yang sama dengan tempat akumulasi klorofil (Barb et al,
2008).
Betalain merupakan senyawa turunan alkaloid (kromoalkaloid) yang
terdiri atas pigmen ungu kemerahan betasianin dan pigmen kuning betaxantin
(Davies et al, 2012). Pigmen betalain berkorelasi dengan tanaman genus
Caryopyllales dan yang paling terkenal adalah pigmen ini penyusun warna merah
pada tanaman bit gula (Beta vulgaris) dan penyusun pigmen pada Amaranthus
tricolor. Jalur biosintesis betalain adalah melalui jalur sikimat menghasilkan
senyawa antara arogenat dan senyawa biosintesis awal cyclodopa dan asam
betalamik yang masing-masing akan menjadi betasianin dan betaxantin. Hingga
saat ini, hanya sedikit enzim atau gen regulasi biosintesis betalain yang dapat
diketahui, walaupun betalain merupakan bahan pewarna makanan yang penting.
Dua klon yang mengkode polifenol oksidase telah berhasil diisolasi dari cDNA
Phytolacca americana penghasil betalain. Transkripsi kedua gen tersebut hanya
nampak pada tahap tertentu dalam fase pematangan buah yang mengandung
betalain (Davies et al, 2012).

Karotenoid memiliki struktur dasar gugus isoprenoid (jalur biosintesis


isoprenoid) dengan struktur umum lycopene (C40H56), melalui jalur samping asetil
Co-A menghasilkan senyawa antara mevalonat (Garcia et al, 2013). Karotenoid
dapat diklasifikasikan menjadi karotenoid primer dan karotenoid sekunder.
Karotenoid primer adalah senyawa yang dibutuhkan oleh tanaman dalam
fotosintesis seperti -karoten, violaxantin, dan neoxantin. Karotenoid sekunder
adalah kelompok senyawa yang dilokalisasi di buah dan bunga meliputi karoten, -kriptoxantin, zeaxantin, anteraxantin, capsantin, dan capsorubin (Feng
et al, 2013). Bunga teridentifikasi mensintesis karotenoid yang teroksigenasi,
umumnya dalam bentuk 5,8 epoxydes, -karoten serta karoten yang spesifik
spesies seperti eschscholzxantin pada tanaman Papaver (Barb et al, 2008).
Regulasi biosintesis karotenoid sangat rumit karena regulasinya terjadi di berbagai
tingkat atau regulasinya spesifik untuk organ yang berbeda. Secara umum gen
karotegenesis eukariot hanya diregulasi oleh satu gen tunggal namun untuk
beberapa gen seperti gen phytoene synthase (PSY) dan geranil geranil phyrofosfat
synthase (GGPP) memiliki variasi sekuen dalam genom tanaman yang tergabung
ke dalam satu kelompok keluarga gen PSY dan GGPP (Yan et al, 2005).
Kelompok pigmen penting dari kelompok flavonoid adalah antosianin,
yang keberadaannya dapat dilihat jelas secara langsung dengan mata telanjang.
Struktur dasar senyawa antosianin adalah kerangka atom C15 dengan cincin
kroman yang membawa cincin aromatik kedua (cincin B) pada posisi C nomer 2
(C6-C3-C6) dan dengan tambahan satu atau lebih gugus gula dengan posisi
terhidroksilasi atau OH pada stuktur dasar. Cincin aromatik dihasilkan melalui
jalur sikimat. Biosintesis antosianin dibagi kedalam dua bagian yaitu 1)
metabolisme prekursor fenilpropanoid dan 2) tahapan spesifik biosintesis
flavonoid. Pada bagian pertama, fenilalanin diubah menjadi p-coumaril-CoA
akibat katalisasi 3 enzim yaitu fenilalanin-amonia-liase (PAL), sinamat-4hidroksilase (C4H), dan 4-coumaril-CoA ligase (4CL). Pada tahap kedua, kalkon
sintase (CHS) yang merupakah enzim kunci biosintesis flavonoid, mengkatalisasi
kondensasi tiga molekul malonil CoA dari senyawa antara kalkon (Barb et al,
2008).

10

Gambar 3. Bagan jalur percabangan (jalur samping metabolisme sekunder)


metabolisme primer (glikolisis), biosintesis karotenoid melalui
senyawa antara mevalonat (terpenoid), biosintesis flanonoid, dan
biosintesis betalain melalui jalur sikimat

Regulasi Gen Kunci Biosintesis Pigmen Karotenoid


Salah satu langkah penting pertama dalam biosintesis karotenoid adalah
pembentukan phytoene dari dua molekul GGPP yang dikatalisasi oleh enzim PSY.
Enzim PSY berfungsi sebagai titik pengaturan karena berfungsi untuk
mengkontrol sumber aliran karbon ke dalam biosintesis karotenoid. Phytoene
synthase (PSY) mengkatalisis kondensasi dua molekul GGPP menjadi phytoene,
yang kemudian dijenuhkan oleh dua enzim, phytoene desaturase dan caroten
desaturase, menjadi lycopene berwarna merah. Konfigurasi poly-cis phytoene
diubah menjadi bentuk trans melalui katalisasi caroten isomerase (Z-ISO).
Lycopene -siklase (LCYE) dan atau -siklase (LYCB) mengkatalisis siklisasi
lycopene dan menjadi percabangan yang penting dalam jalur biosintesis
karotenoid. Tahap akhir biosintesis karotenoid adalah pembentukan neoxantin
oleh neoxantin sintase (NXS) (Silva, 2006).
Pada beberapa jenis tanaman, gen PSY membentuk suatu kelopok kecil
gen (family gene), terdiri atas 2-3 gen PSY. Sub-fungsionalisasi gen PSY
menyebabkan ekspresi gen PSY spesifik pada organ, sehingga tidak salah jika
ekspresi gen PSY tidak selamanya berefek pada akumulasi karotenoid pada suatu

11

jaringan. Ekspresi gen PSY untuk akumulasi karoten pada jaringan fotosintetik
juga dipengaruhi oleh proses fotosintesis, mengingat karoten dan klorofil
dibutuhkan dan diakumulasi pada rasio yang sesuai pada kloroplas. Studi rekayasa
genetika menggunakan pendekatan rekayasa sel kompeten dari kalus embriogenik
jeruk dan dilakukan overekspresi protein CrtB (PSY Erwinia herbicola)
setelahnya, menunjukkan bahwa selain protein ini berkorelasi dengan akumulasi
karotenoid pada sel juga berhubungan dengan beberapa proses biologis seperti
perubahan status redox, metabolisme amilum, serta penurunan akumulasi
flavonoid/antosianin (Cao et al, 2015).
Analisis sekuen cDNA PSY menunjukkan pada sebuah open reading frame
yang mengkode sebuah protein dengan panjang 423 residu asam amino.
Pensejajaran asam amino PSY Arabidopsis dengan PSY dari Erwinia uredovora
(crtB) dan Rhodobacter capsulatus (crtB) menunjukkan bahwa protein PSY
diduga terdiri atas peptida transit sepanjang 150 asam amino pada ujung N
terminal dan sebuah peptida fungsional sepanjang 273 asam amino. PSY1 dan
PSY2 pada Arabidopsis thaliana memiliki kesamaan sekuen hingga 92% dan 85%
dengan sekuen gen phytoene desaturase tomat. Sekuen lengkap PSY pertama kali
diisolasi menggunakan teknologi genome walking dan suppression PCR pada
Dunaliella salina. Total panjang sekuen cDNA gen PSY adalah 1260 bp, yang
mengkode 420 asam amino, sedangkan total sekuen gen PSY adalah 2982 bp yang
terdiri atas lima ekson dan empat intron jika dibandingkan dengan sekuen cDNA
PSY (Emparan et al, 2014). Sekuen gen PSY pada tanaman uniselular memiliki
kemiripan yang tinggi (78-89%) dengan gen PSY tanaman tingkat tinggi serta
sianobakteri, ditunjukkan dari hasil analisis pohon filogenetik (Yan et al, 2005).
Karotenoid disintesis de novo di plastid, namun diakumulasikan di dalam
kloroplas daun untuk fungsi fotosintesis dan diakumulasikan di kromoplas bunga
dan buah. Karotenoid berintegrasi melalui ikatan Chl pada protein di dalam
kloroplas. Sebaliknya, karotenoid berasosiasi dengan lipid polar dan protein
karotenoid, seperti CHRC dan CHRD, untuk menciptakan stabilitas dan
akumulasi yang sesuai pada permukaan kromoplas (Bortakhur et al, 2008). Chiou
et al (2008) mengidentifikasikan bahwa OgCHRC dan promotornya (Pchrc) pada
Oncidium terekspresi spesifik pada bagian bunga. Studi ekspresi Pchrc melalui

12

partikel bombardment menunjukkan bahwa ekspresi OgCHRC nampak pada sel


konika papila dari jaringan epidermis adaksial organ lidah bunga, dan juga
berkorelasi dengan peningkatan akumulasi antosianin dan karoten yang lebih
tinggi.

Gambar 4. Jalur biosintesis karotenoid, panah menunjukkan arah sintesis yang


dikatalisasi oleh enzim-enzim

Regulasi Gen Kunci Biosintesis Pigmen Flavonoid


Enzim dan faktor transkripsi yang terlibat dalam biosintesis flavonoid
telah dikarakterisasi dengan baik pada berbagai spesies tanaman, seperti petunia
(Brugliera et al, 1999), anggur (Castellarin et al, 2006), Arabidopsis, dan berry
(Abeynayake et al, 2012). Kalkon merupakan senyawa antara untuk berbagai
senyawa produk flavonoid yang dihasilkan melalui katalisasi enzim kalkon sintase
(CHS), yang di kode oleh gen tunggal CHS. Pembentukan pigmen antosianin
diawali dengan pembentukan senyawa naringenin yang dimodifikasi oleh
keterlibatan enzim sitokrom monooksigenase seperti F3H, F3H, dan F35H. Gen
putatif F35H telah berhasil diisolasi dari bunga Phalaenopsis. Gen ini terdiri atas
motif

conserve P450, Phe-X-X-Gly-X-Arg-X-Cys-X-Gly (dimana X adalah

daerah non-conserve), dan memiliki homologi dengan P450 pada tabung polen

13

anggrek lain. Gen F35H menghasilkan ekspresi pigmen warna pink hingga
magenta pada petal Phalaenopsis. Pada Oncidium, empat gen yang berkorelasi
dengan sintesis antosianin, OgCHS, OgCHI, OgANS, dan OgDFR telah berhasil
teridentifikasi (Hsu et al, 2015). Gen CHS, CHI, F3H dan ANS yang diisolasi
dari kuncup bunga Phalaenopsis equestris menunjukkan korelasi dengan
pembentukan pigmen warna merah pada petal bunga, namun fungsi dan regulasi
gen-gen ini masih perlu dikarakterisasi lebih lanjut. Akumulasi antosianin yang
stabil di vakuola dipengaruhi oleh serangkaian reaksi oleh flavonoid
glukosiltransferase (UFGT) yang ekspresi gen pengkodenya berkaitan pula
dengan akumulasi pigm en warna merah (Hsiao et al, 2014).
Faktor transkripsi MYB terlibat dalam regulasi biosintesis flavonoid dan
antosianin. MYB dikategorikan menjadi 3 berdasarkan jumlah bagian berulangnya
yaitu faktor MYB dengan satu bagain ulangan, RAR2 MYB dengan dua bagian
berulang, dan MYB3R dengan tiga bagian berulang. Gen faktor transkripsi
pertama yang berhasil diisolasi yaitu CI, R2R3 MYB Zea mays, berkaitan dengan
biosintesis antosianin. Studi yang lebih mendalam mengindikasikan bahwa
kebanyakan dari R2R3 MYB berinteraksi dengan faktor basic helix-loop-helix
(bHLH) untuk mengkontrol akumulasi antosianin (Hsu et al, 2015). Berlawanan
dengan pewarnaan petal bunga yang seragama seperti yang dibahas diatas,
beberapa kultivar Phalaenopsis menunjukkan pola bintik atau garis pada bagian
petal bunganya. Studi pola pewarnaan bunga Phalaenopsis menunjukkan bahwa
faktor transkripsi R2R3 MYB, PeMYB2, PeMYB11, dan PeMYB12, ,masingmasing meregulasi pigmentasi merah seluruhnya, bintik merah dan pola venasi
pada sepal atau petal bunga (Davies et al, 2012).

14

Gambar 5. Jalur biosintesis Flavonoid secara umum, beserta dengan enzim yang
terlibat dalam setiap tahap biosintesis

Perkembangan Marka Molekular Pada Tanaman


Marka molekular atau dikenal dengan marka DNA adalah suatu istilah
yang digunakan untuk merujuk kepada suatu variansi sekuen DNA yang spesifik
diantara individu (sekuen polimorfik) yang diketahui memiliki keterkaitan pada
karakter tertentu (Mondini et al, 2009). Perbedaan sekuen DNA atau variasi dalam
genetik tersebut dikenal sebagai alel. Pengujian marka DNA dilakukan untuk
menentukan alel mana yang akan dijadikan sebagai marka DNA. Penentuan

15

marka DNA sangat ditentukan olek kerumitan fisiologi dan biokimia yang
mendukung karakter yang dijadikan subjek penelitian. Beberapa karakter adalah
merupakan karakter sederhana yang hanya dikontrol oleh gen tunggal sehingga
akan memudahkan penentuan marka DNA yang berkaitan dengan karakter
tersebut. Namun kebanyakan dari karakter agronomis atau bernilai ekonomi
merupakan karakter komplek yang dikontrol oleh banyak gen dan juga
dipengaruhi oleh faktor lingkungan, seperti produktifitas dan warna bunga.
Umumnya, marker DNA bersifat tunggal yaitu berhubungan dengan hanya satu
dari banyak gen yang mengkontrol karakter yang komplek.
Keunggulan menggunakan marka molekular adalah tidak dipengaruhi
secara ekstrim oleh lingkungan, selain itu beberapa keuntungan lainnya adalah
marka molekular dapat diterapkan pada semua bagian dari genom (intron, ekson,
dan domain transkripsi), tidak memiliki pengaruh epistasis dan pleiotropik, dan
mampu membedakan polimorfik yang tidak menunjukkan variasi fenotipe, serta
beberapa dari marka molekular bersifat co-dominan (Mondini et al 2009). Teknik
marka molekular didasarkan kepada dua hal yaitu teknik yang tidak menggunakan
pendekatan PCR atau teknik berdasarkan hibridisasi dan teknik dengan
pendekatan PCR.
Teknik restriksi-hibridisasi, salah satu jenis teknik tanpa menggunakan
pendekatan PCR, yang digunakan di awal perkembangan marka molekular dan
mengkombinasikan penggunaan endonuklease restriksi dan metode hibridisasi.
Endonuklease restriksi akan memotong segmen DNA. Variasi panjang segmen
potongan akan nampak setelah proses digesti enzimatik karena segmen DNA telah
mengalami mutasi diantara dua tapak, atau mutasi di dalam tapak enzim itu
sendiri, dan dijadikan indikator dasar untuk keragaman sekuen didalamnya. RFLP
(restriction fragment lenght polymophism) dan VNTRs (variable numbers of
tandem repeats) adalah contoh marka yang berbasis non-PCR (Mondini et al,
2009).
Marka molekular dengan pendekatan PCR terdiri atas proses amplifikasi
produk DNA diskrit, melalui kecocokan sekuen DNA gen target dengan sekuen
primer. Teknik PCR selanjtnya dapat dibagi ke dalam dua kategori yaitu teknik
yang berdasarkan primer PCR yang acak atau teknik sekuen non-spesifik serta

16

teknik PCR untuk target gen spesifik. Beberapa metode berbasis PCR diantaranya
AFLP (amplified fragment lenght polymorphism), EST-SSRs (expressed sequence
tags-simple sequence repeads), dan microsatellite (SSRs) (Lu et al, 2012). Marka
molekular yang diduga atau disusun berdasarkan viabilitas yang dihasilkan oleh
sekuen mikrosatelit meliputi STMSs (sequence tagged microsatellite site), SSLPs
(simple sequence lenght polymorphism), SCARs (sequence characterized
amplified region), CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences), dan SNPs
(single nucleotide polymorphism) (Mondini et al, 2009).
Variasi nukleotida tunggal dalam sekuen genom tanaman di suatu populasi
diketahui sebagai SNPs. SNPs adalah marka molekular yang memiliki
kesempatan mendapatkan variasi sekuen dalam genom yang berlimpah. Sekuen
tersebut tersebar di sepanjang genom yang variasinya tergantung kepada spesies.
Ketika SNP muncul dalam sekuen ekson (coding region), SNP dapat
menyebabkan baik mutasi non-synonymous yang menghasilkan perubahan
susunan asam amino ataupun mutasi synonymous yang tidak akan merubah
sesunan asam amino (Feng et al, 2013). Analisis genotipe SNP khususnya
didasarkan pada hibridisasi alel-alel spesifik, ligasi oligonukleotida, deteksi PCR
alel spesifik, pemanjangan dan pengkopian sekuen menggunakan primer. Teknik
ini umum digunakan untuk tujuan yang beragam, termasuk identifikasi cepat
untuk tanaman budidaya dan pembuatan pemetaan genetik dengan kerapatan yang
tinggi.
Sebagian besar marka molekular, termasuk SNP, digunakan untuk
mengevaluasi keragaman genetik dan pemetaan genetik dan fenotipe. Pemetaan
fenotipe yang diaplikasikan dengan penggunaan marka molekular dapat
memperlihatkan hubungan antara jarak genetik dengan jarak fenotipe. Marka
molekular juga dapat digunakan untuk studi pewarisan sifat dalam populasi
segregasi dimana pemetaan gen-gen pada individu dapat menunjukkan hubungan
genetik diantara anggota populasi melalui pengalokasian sifat-sifat, baik
monogenik ataupun poligenik yang ada di dalam bagian spesifik sekuen genom
tanaman (Mondini et al, 2009). Sifat tanaman yang bersifat poligenik dan
memiliki nilai agnonomis umumnya bersifat tidak nampak sejak awal, sehingga
tidak bisa diprediksi fenotipe nyatanya, oleh karena itu penggunaan marka

17

molekular menggunakan keragaman sekuen spesifik dapat dijadikan dasar untuk


menghubungkan keberagaman sekuen gen yang berkorelasi dengan sifat tersebut
dengan fenotipe dari tanaman tersebut kelak.
Manfaat Penelitian
Adanya informasi karakter morfologi khususnya pola pigmentasi serta
biokimia penyusun pigmentasi bunga tanaman anggrek dapat menjadi pemahaman
mengenai senyawa pigmen yang berkorelasi dengan pola pigmentasi bunga
anggrek Phalaenopsis, khususnya untuk program pemuliaan tanaman anggrek dan
pola pewarisan karakter-karakter bunga serta pigmentasi bunga yang bernilai
ekonomi dan berestetika tinggi. Data molekular berupa keragaman genetik gengen yang berkorelasi dengan pembentukan pigmentasi dan biokimia senyawa
penyusun pigmen bunga anggrek, nantinya akan membantu dalam penyusunan
marka seleksi genotipe berpotensi unggul khususnya dari segi nilai estetika dan
nilai ekonomi dari pigmentasi bunga.
Ruang Lingkup Penelitian
Kegiatan yang dilakukan dalam penelitian ini memiliki ruang lingkup
yang berbeda, namun acuan penelitian saling mendukung untuk mendukung
tujuan utama dari penelitian. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap
percobaan yang meliputi sebagai berikut:
Percobaan 1: identifikasi morfologi beserta pola pigmentasi senyawa pigmen
bunga anggrek spesies Phalaenopsis dan anggrek Phalaenopsis hasil persilangan.
spesies. Percobaan 2: isolasi dan karakterisasi gen biosintesis flavonoid (F35H,
F3H, F3H/DFR) dan karotenoid (PSY) pada anggrek Phalaenopsis. Percobaan 3:
aplikasi marka SNAP berbasis gen-gen biosintesis pigmen flavonoid dan
karotenoid pada Phalaenopsis spesies dan hibrida hasil persilangan. Hasil dari
aplikasi marka SNAP yang berbasis gen-gen biosintesis pigmen flavonoid dan
karotenoid digunakan untuk mengetahui keragaman genetik dalam genotipe dan
populasi hibrida Phalaenopsis.

18

III BAHAN DAN METODE

Percobaan 1: Identifikasi Morfologi dan Analisis Pola Pigmentasi


Analisis Keragaman Morfologi Anggrek Phalaenopsis Spesies dan Hibrid
Hasil Persilangan
Percobaan ini menggunakan koleksi genotip anggrek Phalaenopsis dan hibrid
hasil

persilangan

yang telah berbunga.

Pengamatan dilakukan dengan

mengumpulkan data karakter kualitatif mengikuti panduan protokol karakterisasi


dari untuk anggrek Phalaenopsis. Karakter kuantitatif yang dikumpulkan dan diuji
meliputi panjang dan lebar daun, jumlah daun, panjang, dan lebar bunga, panjang
dan lebar sepal dorsal dan lateral, serta panjang dan lebar petal. Pola pigmentasi
diamati dan dikarakterisasi untuk dikategorikan sebagai karakter kuantitatif.
Karakter kualitatif dianalisis menggunakan software NTSYS, sedangkan karakter
kuantitatif dianalisis menggunakan uji-F taraf 5%. Analisis gabungan karakter
kualitatif dan karakter kuantitatif yang dikategorikan dianalisis menggunakan
software STAR untuk melihat kedekatan persamaan dan perbedaan karakter yang
diuji pada tiap genotip dalam bentuk pohon fenetik.

Percobaan 2: Isolasi dan Karakterisasi Gen-Gen Biosintesis Flavonoid dan


karotenoid Asal Phalaenopsis Spesies
Desain primer spesifik untuk isolasi gen spesifik
Desain primer menggunakan metode homologi dengan sekuen gen terkait
yang telah dilaporkan sebelumnya pada tanaman anggrek atau tanaman lainnya.
Primer spesifik ditentukan berdasarkan sekuen conserve dari hasil pensejajaran
cdDNA yang diperoleh dari genebank NCBI (gen PSY (phytoene synthase)
Oncidium accession no. AY496865.1, gen F35H Phalaenopsis hybrida
accession no. DQ148458.1, gen F3H Phalaenopsis hybrid accession no.
KC884848.1). Alternatif primer spesifik terpilih diperoleh berdasarkan program

19

online Primer3Plus menggunakan semua aksesi sekuen yang terkait. Primer


forward dan reverse dipesan pada PT Genetika.
Evaluasi efektifitas primer spesifik
Pengujian ini menggunakan genotipe Phalaenopsis berbasis metode PCR.
Reaksi PCR untuk volum 12.5 l menggunakan kit PCR Mix Ready KAPA2G,
dengan komposisi 5.0 l 5 x buffer PCR , 0.5 l MgCl2 25 mM, 0.5 l dNTPs 10
mM, 1 l primer forward dan reverse, 30 ng DNA genom, 0.1 l Taq DNA
polimerase dan 15.4 l ddH2O. Proses PCR menggunakan mesin GeneAmp PCR
system BioRat T-100 pada suhu optimum untuk masing-masing primer.
DNA sequencing dan analisis sekuen DNA
Produk amplifikasi hasil PCR dan visualisasi elektroforesis berupa pita
tunggal, selanjutnya dikirim ke 1stBASE (Malaysia) untuk proses DNA
sequencing. Data yang diperoleh adalah urutan basa nukleotida dari gen target.
Data hasil sequencing merupakan data mentah, dan diolah menggunakan software
BIOEDIT, ClustalX, Blast dan Mega5 untuk dapat dianalisis selanjutnya. Data
sekuen yang diperoleh dianalisis dengan cara membandingkan sekuen DNA antara
genotipe dan prediksi Open Reading Frame (ORF) untuk penentuan dugaan asam
amino yang dihasilkan.
Percobaan 3: Aplikasi Marka SNAP Gen-Gen Biosintesis Flavonoid dan
Karotenoid Pada Phalaenopsis Spesies dan Hibrida Hasil Persilangan
Isolasi DNA
Bahan tanaman yang diisolasi adalah bagian daun muda anggrek
Phalaenopsis spesies dan hibrid hasil persilangan menggunakan metode CTAB
yang

dimodifikasi.

DNA

genom

dikuantifikasi

menggunakan

metode

elektroforesis, dilihat dalam gel agarose 1% dalam buffer SB 1x pada tegangan


100 v selama 60 menit. Visualisasi hasil elektroforesis menggunakan UV
transiluminator ditujukan untuk melihat pita tunggal DNA dan didokumentasikan
menggunakan kamera digital. Gel agarose diwarnai menggunakan gelred.

20

Identifikasi situs SNP dan Desain Primer spesifik alel untuk marka SNAP
Dari semua genotip yang digunakan dalam pengamatan, akan diperoleh
banyak situs sekuen gen, dan dipilih situs SNP yang bagian coding region
menunjukkan adanya perubahan residu asam amino dengan cara mensejajarkan
semua sekuen yang didapat.
Aplikasi Marka SNAP Pada Individu Phalaenopsis Hybrida
Marka

SNAP

dikonfirmasi

efektifitas

penggunaannya

dalam

pengamplifikasi keberagaman sekuen gen-gen yang berkaitan dengan biosintesis


flavonoid dan karotenoid pada individu dalam populasi hibrida Phalenopsis
melalui prosedur PCR.

21

DAFTAR PUSTAKA
Abeynayake SW, Panter S, Chapman R, Webster T, Rochfort S, Mouradov A,
Spangenberg G. 2012. Biosynthesis of proanthosianidins in white clover
flowers: cross talk within the flavonoid pathway. Plant Physiology.
158:666-678
Barb J, Werner D, Griebach R. 2008. Genetics and Biochemistry of Flower Color
in Stokes Aster. Journal America Social Horticulture and Science. 4:
569-578
Bortakhur D, Lu Jl, Chen H, Lin C, Du Y, Liang YR. 2008. Expression of
phytoene synthase (psy) gene and its relation with accumulation
carotenoids in tea (Camelia sinensis). African Journal of Biotechnology.
7(4):434-438.
Brugliera F, Rewell GB, Holton T, Mason J. 1999. Isolation and characterization
of a flavonoid 3-hydroxilase cdna clones corresponding to the ht1 locus
of Petunia hybrida. The Plant Journal. 19(4):441-451.
Cao H, Wang J, Dong X, Han Y, Ma Q, Ding Y, Zhao F, Zhang J, Chen H, Xu Q,
Xu J, Deng X. 2015. Carotenoid accumulation affects redox status, starch
metabolism, and flavonoid/anthocyanin accumulation in citrus. BMC
Plant Biology. 15(27):1-16.
Castellarin S, Gaspero G, Marconi R, Nonis A, Peterlunger E, Paillard S, Blondon
AF, Testolin R. 2006. Colour variation in red grapevine (vitis vinifera):
genomic organisation, expression of flavonoid 3hydroxilase, flavonoid
35-hydroxilase genes and related metabolite profiling of red
cyanidin-/blue delphinidin-based anthocyanin in berry skin. BioMed
Central. 7(12):1-7.
Davies KM (Edt.). 2004. Plant Pigments and Their Manipulation. Annual Plant
Review Vol 14. Blackwell Publishing Ltd.
Davies KM, Albert NW, Schwinn KE. 2012. From landing lights to mimicry: the
molecular regulation of flower coloration and mechanisms for
pigmentation patterning. Functional Plant Biology. 39:619-638

22

Emparan A, Martinez DQ, Bustoz MZ, Cifuentes V, Luy FI, Federico ML. 2014.
Functional analysis of the Brassica napus l. phytoene synthase (psy) gene
family. PLOS ONE Open Access. DOI:10.1371/journal.pone.0114878.
Feng H, Tian X, Liu Y, Sun J. 2013. Analysis of flavonoids and the flavonoid
structural genes in brown fiber of upland cotton. PlosONE. 8(3):110-118
Garcia RM, Alejo ON. 2013. Biochemistry and molecular biology of carotenoid
biosynthesis in chili peppers (Capsicum spp.). International Journal of
Molecular Sciences. 14:19025-19053.
Handini A. Sukma D, Sudarsono. Analisis Keragaman Morfologi dan Biokimia
Pada Anggrek Phalaenopsis Serta Analisis Keragaman Genetik Dengan
Marka SNAP [Thesis]. Bogor (SPSS): Institut Pertanian Bogor
Hsiao Y., Pan Z, Hsu C, Yang Y, Hsu Y, Chuang Y, Shih H, Chen W, Tsan W, Chen
H. 2014. Research on Orchid Biology and Biotechnology. Plant & Cell
Physiology. 52(9):1467-1486
Hsu C, Chen Y, Tsai C, Chen W, dan Chen H. 2015. Three r2r3-myb transcription
factors regulate distinct floral pigmentation patterning in Phalaenopsis
orchids. Plant Physiology. DOI: 10.1104/pp.114.254599.
Juejun N, Chunwongse C, Chunwongse Ju. 2013. Development of est-derivated
marker in dendrobium from est of related taxa. Journal Science and
Technology. 35:149-158
Lightbourn G, Robert J, Janet J, Beverly N, David C, Rao, Stommel J. 2008.
Effect of anthocyanin and carotenoid combination on foliage and
immature fruit color of Capsicum annum L. Journal of Heredity.
99(2):105-111.
Lu JJ, Wang S, Liu JJ, Wang HZ. 2012. Genetic linkage map of est-ssr and srap
markers in the endangered chinese endemic herb Dendrobium
(Orchidaceae). Genetic and Molecular Research. 11(4):4654-4667.
Mondini L, Noorani A, Pagnotta M. 2009. Assesing Plant Genetic Diversity by
Molecular Tools. Open Access Diversity. 1:19-35.
Neil NO (Edt.). 2007. Flower Breeding and Genetics: Issue, Challages, and
Opportunities For The 21th Century. Springer.

23

Ono E, Mizutani M, Nakamura N, Fukui Y, Sakakibara K, Yamaguchi M. 2006.


Yellow flower generated by expression of the aurone biosynthetic
pathways. PNAS. 103:11075-11080
Puspitaningtyas, Mursidawati S, Sutrisno, Asikin J. 2003. Anggrek Alam Di
Kawasan Konservasi Pulau Jawa. LIPI
Puspitaningtyas, Mursidawati S. 1999. Koleksi Anggrek Kebun Raya Bogor Vol 1.
UPT LIPI
Silva JA (Edt). 2006. Floriculture, Ornamental, and Plant Biotekhnology Vol. 1.
Global Science Book. UK
To KY, Wang CK. 2006. Molecular Breeding of Flower Color. Floriculture,
Yan Y, Zhun ZH, Jiang JG, Song DL. 2005. Cloning and sequence analysis of the
phytoene synthase gene from a unicellular Chlorophyte, Dunaliella
salina. Journal Agriculture Food Chemical. 53(5):1466-1469.