Anda di halaman 1dari 9

Pemeriksaan Hepatitis B Virus Surface Antigen (HBsAg)

dengan Metode ELISA

OLEH
Ni Made Inki Arianti

(P07134013004)

Ni Luh Gede Mulan Tirtayanti

(P07134013018)

I Dewa Ayu Sintya Candra Yuni

(P07134013020)

I Nyoman Krisna Wicaksana

(P07134013022)

Dewa Ayu Yuni Dewantari

(P07134013026)

A.A Inten Pradnya Suamami

(P07134013030)

Christian Naftali Ranni

(P07134013032)

Ni Gusti Ayu Pradnya Dewi

(P07134013034)

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA


POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR
JURUSAN ANALIS KESEHATAN
2015

Pemeriksaan Hepatitis B Virus Surface Antigen (HBsAg)


dengan Metode ELISA
I. Tujuan
Untuk menentukan secara kuantitatif adanya Hepatitis B Surface Antigen
(HBsAg) di dalam serum atau plasma pasien
II. Dasar Teori
Hepatitis B merupakan radang hati yang disebabkan oleh karena infeksi
Virus Hepatitis B (VHB). Apabila seseorang terinfeksi dengan virus ini maka
gejalanya dapat sangat ringan sampai berat sekali. Ketahanan hidup virus ini
sangat tinggi, virus Hepatitis B sangat berbahaya karena sisa dari serangan virus
ini meninggalkan penyakit yang kronis dan menahun seperti penyakit
pengerasan hati dan kanker hati (Nurun, 2006).
Hepatitis B adalah suatu penyakit hati yang disebabkan oleh virus
Hepatitis B, suatu anggota famili hepadnavirus yang dapat menyebabkan
peradangan hati akut atau kronis yang dapat berlanjut menjadi sirosis hati atau
kanker hati. Hepatitis B akut jika perjalanan penyakit kurang dari 6 bulan
sedangkan Hepatitis B kronis bila penyakit menetap, tidak menyembuh secara
klinis atau laboratorium atau pada gambaran patologi anatomi selama 6 bulan
(Mustofa & Kurniawaty, 2013).
Tes - tes yang sangat sensitif pun telah banyak dikembangkan secara luas
untuk meneggakan diagnosa Hepatitis B dalam kasus - kasus ringan, sub klinis
atau yang menetap. Salah satu tes pemeriksaan yang tergolong dalam generasi
ketiga menurut WHO adalah ELISA. ELISA dianggap pemeriksaan yang
memiliki spesifitas dan sensitifitas yang tinggi yang mampu menunjang
diagnosa klinis hepatitis B (Nasroudin, 2007).
Prinsip dari pemeriksaan ELISA ( Enzym Linked Imuno Sorbent Assay )
adalah reaksi antigen-antibodi (Ag - Ab) dimana setelah penambahan konjugat
yaitu antigen atau antibodi yang dilabel enzim dan substrat akan terjadi
perubahan warna. Perubahan warna ini yang akan diukur intensitasnya dengan
alat pembaca yang disebut spektrofotometer atau ELISA reader dengan
menggunakan panjang gelombang tertentu (Nasroudin, 2007).

Ada tiga tahapan penting dalam uji ELISA yaitu :


1. Pelapisan ( coating ) dengan antigen atau antibodi pada plate. Pelapisan
dengan dengan antigen untuk penentuan antibodi untuk penentuan antigen.
2. Penambahan bahan yang ditentukan (diperiksa), misalnya serum dan cairan
tubuh yang lain.
3. Penambahan detektor yang berfungsi untuk mendeteksi ikatan Ag Ab
yang terjadi. Ada dua detektor yang digunakan yaitu :
a. Penambahan

konjugat

yaitu

antigen

atau

antibodi

yang

berlabel enzim, misalnya Horse Radish Peroxidase ( HRPO). Alkaline


Phosphatase,Urease,Glukose-Oxidase(GOP) dan lain-lain.
b. Penambahan

substrat

yang

berfungsi

memberi

perubahan

warna pada reaksi. Misalnya TMB (Tetra Methyl Benzidine, OToluidine, OPD, ABTS dan lain-lain.
ELISA sendiri terdiri dari beberapa macam metode diantaranya ELISA
kompetitif, ELISA double sandwich antigen atau antibodi dan indirect ELISA
yang ketiganya memiliki prinsip dasar reaksi yang sama yaitu reaksi Ag - Ab.
Dalam penulisan ini akan dijelaskan mengenai pemeriksaan terhadap anti-HBs
dengan menggunakan teknik ELISA metode double sandwich Ag sebagai
deteksi terhadap orang-orang yang pernah menderita hepatitis B atau pernah
kontak dengan virus hepatitis B dan scrining test pravaksinasi VHB
(Nasroudin, 2007).
III. Alat dan Bahan
III.1
Alat
Sumur Mikrotiter
Mikropipet
Tip
Botol Semprot
Beaker glass
III.2

Bahan
Enzym Conjugate
Positive control
Negatif control
Sampel diluent
Color A & B
Stop solution

Wash buffer
Aquadest
Tisue
IV. Cara kerja
A. Pembuatan Wash Buffer
1. Wash buffer pekat dicampurkan dengan aquadest

dengan perbandinga

(1:19)
2. Campuran yang sudah jadi disimpan pada suhu ruang selama satu minggu
B. Prosedur Pemeriksaan
1. Semua reagen dan spesimen dikondisikan pada suhu ruang
2. Siapkan nomor yang dibutuhkan untuk sumur yang terdiri dari 1 sumur
untuk blanko, 2 sumur untuk kontrol positif, 2 sumur untuk kontrol negatif
dan 1 sumur untuk setiap spesimen. Tulis nomo seri untuk kontrol dan
spesimen pada kolom data
3. Spesimen diluent ditambahkan sebanyak 20l pada masing-masing sumur
4. Spesimen, kontrol negatif, kontrol positif ditambahkan 100 l sesuai dengan
5.
6.
7.
8.
9.

kolom data (sediakan 1 sumur untuk blanko)


Kemudian dihomogenkan
Plate diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37C selama 60 menit
Enzym conjugate ditambahkan pada setiapa sumur sebanyak 50 l
Plate kembali diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37C selama 30 menit
Setiap sumur dicuci dengan wash buffer dengan prosedur:
Pencucian yang dilakukan harus sesuai dengan petunjuk, apabila ada

pencucian yang tak sempurna maka akan mempengaruhi hasil


Semua isi sumur dimasukan pada labu cuci. Kemudian ditambahkan 350

l / lebih
Pastikan tidak ada cairan didalam tip dan setelah pemipetan terakhir
10. Color A dan B dimasukan pada setiap sumur sebanyak 50 l
11. Plate diinkubasi pada inkubator selama 30 menit
12. Hentikan reaksi dengan penambahan 50 l stopping solution di setiap sumur
13. Absorbansi setiap sumur dibaca pada panjang gelombang 450 nm (single
wavelength) serta 450 nm dan 630 nm (dual wavelength)
14. Perhitungan
Single wavelength (450 nm)
OD
= OD 450 ODBC 450
= Sampel Control
Dual wavelength (450 nm/630 nm)
OD
= OD 450/630
V. Interpretasi Hasil
Reaktif

= Nilai Absorbansi Sampel Cut-Off

Non Reaktif = Nilai Absorbansi Sampel < Cut-Off


VI. Hasil Pengamatan
Hasil pemeriksaan :

Hasil
Hasil
Hasil

Blank

Positif

Positif

Negatif

Negatif

0,019
Sampel 1
3,689
Sampel 6
3,69

Control
2,986
Sampel 2
3,689
Sampel 7
3,532

Control
2,685
Sampel 3
3,715
Sampel 8
3,548

Control
0,04
Sampel 4
3,66

Control
0,052
Sampel 5
3,726

Perhitungan :
Cut off Value = Negative Control x 2,1
0,04+0,052
=
x 2,1
2
= 0,046 x 2,1
= 0,0966
Sampel 1

: Absorbansi sampel = 3,689


3,689>0,0966 Hasil reaktif

Sampel 2

: Absorbansi sampel = 3,689


3,689>0,0966 Hasil reaktif

Sampel 3

: Absorbansi sampel = 3,715


3,715>0,0966 Hasil reaktif

Sampel 4

: Absorbansi sampel = 3,66


3,66>0,0966 Hasil reaktif

Sampel 5

: Absorbansi sampel = 3,726


3,726>0,0966 Hasil reaktif

Sampel 6

: Absorbansi sampel = 3,69


3,69>0,0966 Hasil reaktif

Sampel 7

: Absorbansi sampel = 3,532


3,532>0,0966 Hasil reaktif

Sampel 8

: Absorbansi sampel = 3,548


3,548>0,0966 Hasil reaktif

VII. Pembahasan

Uji HbsAg dengan metode Elisa dengan prinsip antibodi ganda


"sandwich" immunoassay, yang menggunakan antibodi anti-HBsAg spesifik
antibodi monoklonal untuk HBsAg di bagian bawah microtiterwells, dan
antibodi poliklonal untuk HBsAg dengan horseradish peroxidase (HRP)
sebagai Conjugate Solution. Selama uji tersebut, HBsAg yang ada dalam
spesimen akan bereaksi dengan antibodi tersebut untuk membentuk sebuah
"Antigen-HBsAg-antibodi-HRP" immuno-kompleks. Setelah bahan terikat
dicuci off selama prosedur uji, substrat digunakan untuk menunjukkan hasil
tes. Munculnya warna biru di microtiterwells menunjukkan hasil reaktif
HBsAg. Ketidakhadiran warna menunjukkan hasil non-reaktif dalam spesimen.
Pada praktikum ini dilakukan uji HbsAg pada 8 sampel serum. Tahap
pemeriksaan HBsAg ini yang pertama microtiter diisi dengan sampel diluent
yang mengandung protein stabil ke sebanyak 6 sumur. Tahap ini dikenal
sebagai blocking, Karena protein serum memblok absorpsi non-spesifik dari
protein lain ke plate. Selanjutnya 6 sumur tersebut diisi dengan sampel, kontrol
positif, dan kontrol negatif lalu microtiter diinkubasi pada inkubator dengan
suhu 37C selama 60 menit. Kemudian tiap-tiap sumur tersebut ditambahkan
dengan enzim konjugate yang merupakan buffer yang mengandung antibodi
Horseradish-peroksidase terhadap HBsAg agar membentuk reaksi atau ikatan
antibodi-antigen-antibodi (reaksi imun kompleks), lalu diinkubasi pada
inkubator dengan suhu 37C selama 30 menit, tujuan dilakukanya inkubasi
adalah untuk mengoptimasi proses reaksi antigen antibodi yang terbentuk.
Tahap selanjutnya yaitu microtiter dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim
yang tidak terikat dapat dibuang. Pencucian dilakukan pada alat sebanyak 5
kali, fungsi pencucian untuk membuang sisa-sisa antigen/antibodi yang tidak
berikatan. Tahap selanjutnya yaitu ditambahkan color A (larutan hydrogen
peroksidase) dan color B (larutan TMB). Reagen ini dapat diubah oleh enzim
menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi. Kemudian dilakukan diinkubasi pada
inkubator dengan suhu 37C selama 30 menit. Tahap terakhir microtiter
ditambahkan stop solution untuk menghentikan reaksi yang terjadi.
Dari praktikum tersebut didapatkan hasil sebagai berikut :
Blank

Positif

Positif

Negatif

Negatif

Hasil
Hasil
Hasil

0,019
Sampel 1
3,689
Sampel 6
3,69

Cut off Value

Control
2,986
Sampel 2
3,689
Sampel 7
3,532

Control
2,685
Sampel 3
3,715
Sampel1 8
3,548

Control
0,04
Sampel 4
3,66

Control
0,052
Sampel 5
3,726

= Negative Control x 2,1


=

0,04+0,052
2

x 2,1

= 0,046 x 2,1
= 0,0966
Dari pemeriksaan yang dilakukan, semua sampel reaktif karena Nilai
Absorbansi Sampel > Cut-Off Value (COV).
HBsAg positif dijumpai pada : Hepatitis B, Hepatitis B kronis. Kurang
Umum : Hemofilia, sindrom Down, penyakit Hodgkin, leukemia. Pengaruh
obat : ketergantungan obat.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemeriksaan :
1. Reagen yang akan digunakan sebelumnya harus dikocok terlebih dahulu
2. Jangan menggunakan reagen dari lot yang berbeda dan diperhatikan masa
kadaluarsa reagen
3. Sampel yang digunakan adalah serum atau plasma EDTA/citrate.
Penyimpanannya pada suhu 2-8oC apabila tidak segera diperiksa. Untuk
penyimpanan lebih dari 3 hari, sampel dapat dibekukan suhu -15oC
4. Sampel harus disesuaikan dengan suhu ruangan sebelum diperiksa.
5. Wash bufffer harus dibuat pengenceran sebelum digunakan, yaitu 1:19
dengan air distilasi.
6. Pada saat pengerjaan, tip tidak boleh menyentuh dasar microtitier well
karena terdapat antibodi di dasarnya. Apabila sampai tersentuh, dapat
mengganggu ikatan antibodi-anigen-antibodi dan merusak hasil
7. Apabila pencucian dilakukan secara manual, dipastikan sisa-sisa
pencucian benar-benar bersih agar tidak mengganggu reaksi dan merusak
hasil
8. Hasil pembacaan dari Blank harus kurang dari 0,100. Apabila lebih dari
nilai tersebut mungkin blank terkontaminasi

9. Hasil pembacaan Kontrol Positif harus sama atau lebih besar dari 0,5.
Sedangkan pembacaan Kontrol Negatif sama dengan atau kurang dari
0,1. Apabila tidak sesuai, maka test harus diulang dan dengan lot yang
baru.
10. Serum atau plasma ikterik, hemolisis, atau lipemik dapat mempengaruhi
hasil pemeriksaan.
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, diantaranya terdapat banyak molekul
antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding microtiter.
Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detector terhadap antigen
sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik
ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini
pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi
karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis
antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detector. Namun demikian,
teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya
dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta
sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama
pada sisi antigenik yang berbeda (epitopnya harus berbeda).
VIII. Kesimpulan
Dari praktikum yang telah dilakukan, dapat dimpulkan sebagai berikut :
1. Berdasarkan perhitungan yang telah dilakukan, diperoleh nilai Cut Off
Value (COV) sebesar 0,0966.
2. Berdasarkan pemeriksaan yang telah dilakukan, semua sampel reaktif
karena Nilai Absorbansi Sampel > Cut-Off Value (COV).
3.

DAFTAR PUSTAKA
Nurun, Akbar. 2006. Hepatitis B divisi hepatologi. Jakarta : Departemen Ilmu
Penyakit Dalam FKUI / RSCM.
Mustofa S, Kurniawaty E. 2013. Manajemen gangguan saluran serna : Panduan
bagi dokter umum. Bandar Lampung: Aura Printing & Publishing.
Nasronudin. 2007.Penyakit Infeksi Di Indonesia. Surabaya : Universitas
Airlangga.