Anda di halaman 1dari 34

High Performance Liquid

Chromatography (HPLC)
1. Pengertian HPLC
Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC)
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai dengan tekanan
tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap
zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan
fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus
karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak
tertentu. Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram.
Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

1. JENIS- JENIS HPLC


Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar
dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar
dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan
atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas

yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak
yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase
terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling
populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah
fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan
bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena
kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi
lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies
yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu
fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling
luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga
pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi
oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam
dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut
yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekulmolekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini
disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel
fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi
kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik.
Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada
kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai

(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).


Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang
sangat kompleks.
2. Beberapa kegunaan dari HPLC :
HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
kolom butiran berlapis zat berpori.
Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
3. Aplikasi dalam ilmiah
Perkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode HPLC denaturing
(DHPLC). This procedure can separate double-stranded DNA molecules that differ by as little as
one . Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda yang berbeda sekecil satu pasangan
basa .The speed of analysis (approximately 5 minutes per sample) and the size of DNA fragment that
can be analyzed (up to 2.0 kilobytes) has made it a preferred method for a variety of applications in
the field of molecular biology. Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen
DNA yang dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai
untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekuler.Applications of DHPLC include the detection of
single
nucleotide (SNPs). Aplikasi
DHPLC
termasuk
deteksi
tunggal
nukleotida polimorfisme (SNP). These are single base-pair variations in DNA that can give valuable
information on genetic variation within a population. Ini adalah satu dasar pasangan variasi dalam
DNA yang dapat memberikan informasi berharga tentang variasi genetik dalam suatu populasi, They
can also help to identify the genes that cause certain human diseases.dan juga dapat membantu
untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari
kromatrogarafi HPLC adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.

Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:


Analisis Diazepam dalam darah
Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan psikotropika. Senyawa ini berbentuk
kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air, rumus kimiaC23H27N. Diazepam termasuk
obat antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif. Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus,
ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat
penenang. Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses preparasi
selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.

1. Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC


Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut
merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
Kolom dapat digunakan kembali.
Waktu analisa cukup singkat.
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:


Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan
kemurnian larutan harus dijaga.

2. Prinsip kerja
Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi
kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang
lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik
dan efisien.
Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat
sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang
tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan
yang sebaik-baiknya.

Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui yang terjadi
pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan
kromatografi gas.

Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk beberapa
senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
komposisi yang tepat dari pelarut
temperatur pada kolom
Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawasenyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu
Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak


mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang
anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu
mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area
ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang
berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

1. Perawatan HPLC
Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom, namun juga
pada bagaimana kolom digunakan secara umum, kolom yang sering digunakan adalah
Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat permukaan fisikokimia, berbagai ikatan
kimia, dan kompatibel dengan berbagai pelarut organik.

Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien.
Stabilitas pH
kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH, pengukuran
harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC
kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan
sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner didasarkan pada silika gel ultra murni juga
dapat digunakan pada rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat
kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu
menyerang permukaan silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.
Teknik Stabilitas
Fase
stasioner
didasarkan
pada
silika
secara
mekanik
sangat
stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di
lebih dari 40 MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran
dalam kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram

Eluen
Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari
kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan
mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.

Penyimpanan Kolom
Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang digunakan dalam
terakhir analisis.

Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom harus
dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.
Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan dalam pelarut
aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah pelarut Asetonitril.

HPLC
High Performance Liquid Chromatograpy (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography atau HPLC atau biasa juga disebut
dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sampel pada sejumlah bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer, dan industri-industri makanan. Kegunaan umum HPLC antara lain:
pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis;
analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-senyawa tidak mudah
menguap (non-volatil); penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter
ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah
sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri
(Gandjar dan Rohman, 2008). Metode HPLC mempunyai kemajuan dalam teknologi
kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif. Dengan teknologi
ini, kromatografi cair dapat menghasilkan pemisahan yang cepat dalam banyak hal,
dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas dapat
dikromatografi tanpa penguraian atau tanpa perlu membuat derivat yang dapat
menguap (Depkes RI, 1995).

HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk
analisis kualitatif maupun kuantitatif. Keterbatasan metode HPLC adalah untuk
identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektrofotometer
massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka
resolusi yang baik sulit diperoleh (Gandjar dan Rohman, 2008).
Cara Kerja HPLC
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu
kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase
gerak dan fase diam. Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas delapan
komponen pokok yaitu: (1) wadah fase gerak, (2) sistem penghantaran fase gerak,
(3) alat untuk memasukkan sampel, (4) kolom, (5) detektor, (6) wadah penampung

buangan fase gerak, (7) tabung penghubung, dan (8) suatu komputer atau
integrator atau perekam (Gandjar dan Rohman, 2008).
Mekanisme kromatografi terdiri atas 4 tipe yaitu adsorpsi, partisi, penukar ion,
dan eksklusi ukuran. Kromatografi adsorpsi didasarkan pada kondisi antara zat
terlarut dan fase diam padat. Umumnya eluen yang digunakan untuk kromatografi
adsorpsi kurang polar dari fase diam (fase normal). Kromatografi partisi melibatkan
fase diam cair yang bercampur dengan eluen. Sistem partisi dapat berupa fase
normal (fase diam lebih polar daripada eluen) atau kromatografi fase terbalik (fase
diam kurang polar daripada eluen). Kromatografi penukar ion melibatkan fase diam
padat dengan kelompok anionic atau kationik pada permukaan zat yang terlarut.
Kromatografi eksklusi ukuran melibatkan fase diam cair dengan ukuran pori yang
terkontrol. Pemisahan dilakukan berdasarkan ukuran molekul suatu zat, dimana
molekul berukuan besar akan mengalami elusi terlebih dahulu (Moffat dkk, 2011).
Wadah Fase Gerak pada HPLC
Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum
digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase
gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat pembuatan
pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut,
bufer, dan reagen dengan kemurnian yang tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarutpelarut yang akan digunakan untuk HPLC berderajat HPLC (HPLC grade). Adanya
pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada system kromatografi.
Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang
sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung
tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu
untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Gandjar dan Rohman, 2008).
Fase Gerak Pada HPLC
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih

polar dari pada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya
polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari pada
fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan

pelarut yang

terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol (Gandjar dan Rohman,


2008).
Pompa pada HPLC
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20
mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah
untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan (Gandjar dan Rohman, 2008).
Penyuntikan Sampel pada HPLC
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fae gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang
terbuat dari tembaga tahan karat dan katup Teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar
sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke
kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%.
Penyuntik

ini

mudah

digunakan

untuk

otomatisasi

dan

untuk autosampler pada HPLC (Gandjar dan Rohman, 2008).


Kolom pada HPLC

sering

digunakan

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional yakni:
a.

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat (10-100 L/menit)

b.

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektrofotometer massa

c.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat, karenanya


jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Tabel Perbandingan antara kolom HPLC konvensional dan kolom mikrobor (Kealey dan
Haines, 2002)
Parameter
Tabung kolom

Kolom Konvensional
Stainless steel

Kolom Mikrobor
Stainless steel

Panjang 3, 10, 15, 20Panjang 25 dan 50 cm


dan 25 cm.

Diameter luar 0,25 inci

Diameter luar 0,25 inci


Diameter

dalam

Diameter dalam 1 atau 2 mm

4,6

mm.
Fase diam

Porous,

silika

kecil,

silika

ukuranPorous, silika ukuran kecil, silika


yangyang

dimodifikasi
kimiawi

dimodifikasi

secara

secarakimiawi (bonded phase), atau


(bonded polimer-polimer

phase),

atau

polimer

stiren/

stiren/divinil

polimer-benzene.
divinil

benzene.

Rata-rata diameter partikel 3,5


atau 10 m dengan kisaran

Rata-rata diameter 3,5ukuran partikel yang sempit.


atau

10

kisaran sempit.

dengan

Tekanan
operasional
Fase gerak

500-3000 psi

1000-5000 psi

(35-215 bar)

(70-350 bar)

Hidrokarbon + pelarut-Hidrokarbon + pelarut-pelarut


pelarut terklorinasi atauterklorinasi atau alkohol untuk
alcohol

untuk

fasefase normal. Untuk fase terbalik

normal.

Untuk

fase(reversed

terbalik

phase)

digunakan

(reversed metanol atau asetonitril + air

phase)

digunakanatau buffer.

metanol atau asetonitril


+ air atau buffer.
Kecepatan

Kecepatan

alir:

10-100

L/menit.

alir:

1-3

mL/menit

Modifikasi instrument
Sistem

penghantaran

yang

mampu

control

aliran

pelarut

memberikan
dibawah

10

L/menit.
Katup injeksi sampel bervolume
kecil; sel detektor bervolume
kecil
Kinerja

Efisiensi
dengan

meningkatSangat

dan

sensitif,

berkurangnyaakan tetapi lambat.

ukuran

partikel

fase

diam, akan tetapi umur


kolom

efisien

dengan

partikel

ukuran

Konsumsi fase gerak hanya


dari kolom konvensional

lebih

pendek.

Meskipun demikian, dalam prakteknya kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin (Gandjar dan Rohman,
2008).
Fase Diam pada HPLC

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH). Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang
paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek
lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil
(nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan adanya
kandungan air yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2008).
Tabel Berbagai fase diam silika dan alumina yang beredar di pasaran (Munson, 1981)
Diameter
Jenis

Nama

ukuran partikel
(m)

Silika

-Porasil
Lichrosorb-Si-

Bentuk
partikel

Luas
permukaan
(m2/g)00

10

Tak teratur

300

5,10

Tak teratur

500

60

Alumina

Partisil

5,10,20 Tak teratur

400

Micro Pak Si

5,10

Tak teratur

400

Sil-X-1

13 5

Tak teratur

400

Porasil C

37-75

Bundar

50-100

Vydac HS

5,10,15,20

Bundar

300

Hypersil

5-7

Bundar

200

Nucleosil 50

5,10

Bundar

500

Sorbax Sil

6-8

Bundar

300

Spherisorb

5,10

Bundar

220

Tak teratur

70

Lichrosorb ALOX 5,10

Micro Pal AL

5,10,20

Tak teratur

70

Spherisorb AY

5,10,20

Bundar

95

Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu : detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif); dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif.
Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut (Gandjar dan
Rohman, 2008):
a.

Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel

b.

Mempunyai sensitifitas yang tinggi

c.

Stabil dalam pengoperasiannya

d.

Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.

e.

Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solute pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier)

f.

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

menghitung kadar parasetamol dalam obat dg HPLC

A. Tanggal praktikum : 23 Oktober 2009


B. Judul Praktikum : TEKNIK HPLC
C. Tujuan Praktikum :
- Memahami cara kerja instrument HPLC untuk analisis kuantitatif
- Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat serta dapat mengikuti manual pengoprasian HPLC
- Dapat menentukan dan menghitung kadar parasetamol dalam sampel obat

D. Tinjauan Pustaka
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan
pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada
pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan
standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu
standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan;
bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan
sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities);
analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun
zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama;
pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan
dalam skala proses industry, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk
analisis kualitatif maupun kuantitatif.
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping
proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah
untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan
lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya mnyebabkan
senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC
menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol
diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu
jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25%
parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik. Parasetamol :

Skema dan fungsi setiap komponen instrument HPLC :

Keterangan skema :
1. Solvent reservoirs
2. Solvent degasser
3. Gradient valve
4. Mixing vessel
5. Pompa bertekanan tinggi
6. Switching valve dalam"inject position" dan 6. Switching valve dalam "load position"
7. Sample injection loop
8. Pre-column
9. Analytical column
10. Detektor
11. Data acquisition
12. Waste or fraction collector
Keterangan :
a. Solvent ( unit penghantar/ eluen bertekanan tinggi) :
Pada bagian ini prinsipnya meliputi peralatan reservoir sampel beserta sistem penghilangan gas (degassing),
alat pengatur gradien, dan system pompa bertekanan tinggi . Pada peralatan- peralatan HPLC modern
umumnya disertai dengan satu atau lebih bejana sebagai tempat eluen yang terbuat dari gelas atau
stainless stell yang masing- masing berkapasitas 1-2 liter. Biasanya pada reservoir tersebut dilengkapi
dengan sistem penghilangan gas terlarut, seperti gas oksigen atau nitrogen. Adanya gas terlarut ini dapat
menyebabkan gangguan pada sistem pengatur gradien dari eluen.

b. Unit sistem penyuntikan :


Sampel /cuplikan harus dimasukkan kedalam kolom sebagai lapisan setipis mungkin. Ada dua cara untuk

memasukkan cuplikan yaitu dengan cara injeksi dan dengan katup pemasukkan cuplikan makro.
c. Unit kolom:
Ada dua tipe kolom kromatografi cairan yaitu kolom analitik dengan performa tinggi dengan diameter dalam
1-6 mm dan kolom preparatif dengan diameter lebih besar. Tabung kolom dibuat dari kaca dan baja tahan
karat. Kolom yang lebih panjang akan menghasilkan resolusi bertambah baik tetapi perlu tekanan yang lebih
tinggi .

d. Unit detector:
Fungsinya adalah mendeteksi adanya komponen cuplikan dan mengukur banyaknya komponen. Syaratsyarat detector yang baik adalah mempunyai kepekaan tinggi, gangguan sedikit, daerah respon linear cukup
luas, memberikan respon terhadap semua tipe senyawa, dan tidak peka terhadap perubahan kecepatan
aliran dan perubahan suhu. Detektor yang paling banyak digunakan adalah detektor fotometer sinar
tampak/ UV dan detektor indeks bias.

E. Alat dan Bahan

Alat Jumlah
Perangkat HPLC 1 set
Lumpang dan alu 1 set
Spatula 1 buah
Labu ukur 25 mL 6 buah
Labu ukur 10 mL 6 buah
Neraca analitik terkalibrasi 1 set
Corong pendek 1 buah
Pipet tetes 5 buah
Gelas kimia 100 mL 1 buah
Gelas ukur 500 mL 1 buah
Ultrasonic vibrator 1 set
Statif 1 buah
Kertas saring 1 buah

Bahan Jumlah

Parasetamol p.a 20 mg
Methanol 375 mL
Air 125 mL
Sampel obat 5 tablet
Membran PTFE/ selulosa nitrat 1 buah

F. Bagan Alir Prosedur Kerja


a. Pembuatan fasa gerak :

b. Pembuatan larutan induk parasetamol :

c. Pembuatan deret larutan standar parasetamol :

i. Konsentrasi 25 ppm :

ii. Konsentrasi 50 ppm :

iii. Konsentrasi 75 ppm :

iv. Konsentrasi 100 ppm :

v. Konsentrasi 125 ppm :

d. Pembuatan sampel parasetamol :

e. Persiapan instrument HPLC :

G. Cara pembuatan larutan


H. Data Pengamatan
Data Pengamatan
sampel no ppm Area
blanko 0 0
1 25 3750993
2 50 7625221
3 75 10957355
4 100 14450728
5 125 17996025
sampel x 6257688

I. Perhitungan
1. Konsentrasi parasetamol (larutan standar):
Massa parasetamol yang ditimbang: 6.25 mg

2. Konsentrasi deret larutan standar


Konsentrasi larutan parasetamol (labu 1):

Konsentrasi larutan parasetamol (labu 2):

Konsentrasi larutan parasetamol (labu 3):

Konsentrasi larutan parasetamol (labu 4):

Konsentrasi larutan parasetamol (labu 1):

Analisis dan data pengamatan


Data Pengamatan
sampel no ppm Area
blanko 0 0
1 25 3750993
2 50 7625221
3 75 10957355
4 100 14450728
5 125 17996025
sampel x 6257688

Luas area sampel = 6257688


Konsentrasi parasetamol dalam sampel :

Konsentrasi dalam 25 mL larutan sampel:

Massa parasetamol dalam 25mL sampel

Massa tablet obat yang ditimbang =12,5 mg


%parasetamol=
Massa rata-rata tablet =738,2 mg
Massa paracetamol dalam tablet:
massa rata-rata tablet

J. Pembahasan
Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses analisisnya HPLC
memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu larutan obat yang sebelumnya
telah disaring dengan membran PTFE kedalam kolom HPLC dengan injektor khusus / syringe yang
bervolume 20 L, penyaringan sebelum penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam
kolom dan menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan bantuan
pompa bertekanan tinggi. Didalam kolom, komponen- komponen pada sampel dipisahkan berdasarkan pada
perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar
lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang
berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena parasetamol
merupakan senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV. Pengujian ini menggunakan panjang
gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu
190 nm.
Teknik yang dilakukan kali ini merupakan reverse phase atau fasa terbalik karena teknik ini menggunakan
pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan
fasa gerak dan fasa diam yang berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan
fasa diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu
yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati kolom ini disebut
waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur adalah antara 2,19
hingga 2,2 . Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu citra berupa kromatogram.
Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu

retensi . Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang
diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan antara lain oleh
adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa.
Difusi longitudinal itu sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi
transfer massa disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata.
Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit,
ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan
diatas. Parameter- parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti
pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan terjadinya
overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju difusinya maka komponen
dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien.
Dari grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat.
Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar parasetamol
sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg diperoleh massa
parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat disimpulkan bahwa kadar parasetamol
dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per tabletnya

PEMBAHASAN
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik
HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram,
dibandingkan dengan luas atau area larutan standar.
Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa
mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion;
isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir
sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam
jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.

1.
Komponen-Komponen Penting Dari HPLC
Gambar Rangkaian Instrumen HPLC
1.
Pompa (Pump)
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure) dan
pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi
menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating
menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan
peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line)
detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah
ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut,
tetapi reservoirnya terbatas.
Syarat syarat pompa yang ideal:
1.
2.
3.
4.
e.
f.

Mampu membangkitkan tekanan tinggi


Pulse free out put
Control laju alir yang akurat
Tahan korosi
Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak
Bebas pulsa

g. Perlude gasser
h. Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar

i.

Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien

j.

Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)

1.
Detektor (Detector)
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik
memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang
luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah
terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat
diperoleh.
Jenis jenis detector

SpektrofotometerUV Visible
Indeks bias
Spektrofluorimeter( zatberfluoresensi)
Konduktivitaslistrik( zationik)
Spektrometerinfra merah
Spektrometermassa( LC MS )
SpektrometerNMR ( LC NMR )

Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang
gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih
luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi
eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.
1.
Injektor (injector)
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang dibutuhkan
oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu
retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai
sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawasenyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa,
waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
komposisi yang tepat dari pelarut
temperatur pada kolom

1.
Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari

senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh
Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
1.
Kolom (Column)
Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis
sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.
Kolom diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu
cairan yang berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan
fasa gerak yang dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.
Komponen-komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak yang
satu sama lain tidak bercampur.
Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari besarnya partikel fase stasioner. Oleh
karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan berkurang,
sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan efisiensi kolom. Dengan
kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan berjalan dengan cepat. Terdapat banyak
analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat diatur dengan konstan
dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang lebih tinggi dari
suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan viskositas fase
gerak yang agak tinggi.
1.
Pengolahan Data (Data Handling)
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram
padarekorder.waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui atau dihitung. Ini bisa
digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat
dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi
dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.
1.

Prinsip Kerja HPLC

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawasenyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner
(diam). Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase stasionernya
adalah silika gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki
kepolaran yang lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.
Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluat;

Fasa Normal

Fasa gerak nonpolar


Fasa diam polar

Fasa Terbalik

Fasa gerak polar


Fasa diam nonpolar
Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat ditingkatkan
dengan mengoptimasi parameter-parameter HPLC yaitu retensi,selektifitas, dan efisiensi.
Secara praktis parameter-parameter HPLC tersebt dapat dioptimalkan dengan mengubah:
1.
Komposisi dari fase gerak
2.
Laju alir
3. Sifat kimia dari fase gerak
4. Jenis kolom
Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaligus kualitatif. Untuk
analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram baku
pembanding berdasarkan waktu retensinya.
Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
Keterangan :
A = Peak area = Luas puncak
C = Konsentrasi

X = sampel
P = pembanding
Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan dengan
menggunakan kurva kalibrasi larutan standar.
HPLC yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam
( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan
memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan
dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi
kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini
adalah mengetahui kadar asam organik.
Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu
karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan
linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan
chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti
metanol.
HPLC ini digunakan untuk asam organik, seperti asam formiat dan asam asetat. Jika sampel
mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga
berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel
yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.
C. Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC
dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat
kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
1. Parasetamol

Rumus struktur :
Nama Kimia
Rumus Molekul
Berat Molekul
Pemerian
Kelarutan

: 4- Hidroksiasetanilida
: C8H9NO2
: 151,16
: serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.
: larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N,

mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-amino


fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan pengganti
yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan saluran
cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak
menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.
Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya
menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan
fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui
saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu jam dan masa paruh
plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol
terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.
Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses
analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji
yaitu larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom
HPLC dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 L, penyaringan sebelum
penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan
menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan
bantuan pompa bertekanan tinggi. Di dalam kolom, komponen- komponen pada sampel
dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya.
Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut
lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi
oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena parasetamol merupakan
senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV. Pengujian ini menggunakan panjang
gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm
dan air yaitu 190 nm. Teknik yang dilakukan kali ini merupakan reverse phase atau fasa
terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa
diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang
berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya
saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu
yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati
kolom ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi
yang terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini
menghasilkan suatu citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara
intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya
tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang
diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan
antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi
longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri disebabkan oleh
penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh
kecepatan komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam
HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu

15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameterparameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti
pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan
terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju
difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien. Dari
grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam
sampel obat. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg
diperoleh kadar parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat
sebesar 738,2 mg diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg.
Dapat disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg
per tabletnya.
2. Kafein
Rumus struktur :

Rumus Molekul
Berat Molekul
Pemerian

Nama Kimia

: 1,3,7-Trimetil

xantin
: C8H10N4O2
: 194,19
: serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih,biasanya

menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.

Kelarutan

: Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam

kloroform, sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).


Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman berkafein. HPLC
yang digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer, Kolom :
Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 m ). Menggunakan asam asetat 70% dan methanol
30% sebagai fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri dari 2 tahap, yaitu tahap preparasi dan
tahap injection ke HPLC.

ANALISIS KUANTITATIF
Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak
Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif diasumsikan
bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar / konsentrasi

zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau tinggi
Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak
diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi
puncak memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel
berikut:
Peak area
No
1

Kafein standar

Kafein dalam
sampel

2601417,40

2216635,31

Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci )
dapat dianalisis dengan mengunakan persamaan :

Cx = Ax / Ap X Cp
= x 200 ppm
= 170,42 ppm
Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.

Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:


Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap komponen
muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponen-komponen
dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau, terelusi tanpa terdeteksi. Kita harus
mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen
Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.
Kofein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan
mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan
suasana jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan
diuretis. Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan
Parasetamol atau asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya.

Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi diperlukan
untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar 10 g (kirakira 100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein sangat
tidak mungkin. Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin
minumg lebih dari 600 mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak
berhenti. (Mycek, 2001).
1.
1.

Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC


1. Kelebihan
Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan

data
Volume sampel kecil
Daya pisah tinggi
Merupakan metode analitis:

Cepat

Peka

Akurat

Tepat

Reproducible

JugaPreparatif

Dapat digunakan untuk analisis sampel organic dan anorganik, bersifat volatile dan

1.

non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.


Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas
2. Kekurangan
Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
Hanya bisa digunakan untuk asam organic
Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient
elusi
Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan
1.

Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.
2.
Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase
stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase
stasionernya adalah silika gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang
memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat
polar.
3.
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan
farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.
4.
HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu
menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak
mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk
mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen zat
yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi
pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih
dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang
optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga
penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

215 nm
rentang Linear penentuan parasetamol, eine ca dan dipyrone adalah 0,409-400 g / ml,
0,151-200 g / ml dan ,233-600 g / ml
Parasetamol (20,00 mg), ca eine (10,00 mg) dan dipyrone (15,00 mg) secara akurat
ditimbang dalam labu volumetrik 10 ml dan dilarutkan dalam fase gerak dan lled sampai
volume dengan fase gerak.
diperoleh senyawa antara daerah puncak dan konsentrasi 25-400 g / ml dengan r2 =
0,9987, 12,5-200 g / ml dengan r2 = 0,9999 dan 37,5-600 g / ml dengan r2 = 0 9.993 untuk
parasetamol, eine ca dan dipyrone, masing-masing.
Tekanan pompa yang besar dibutuhkan untuk partikel yang sangat kecil, dan sekarang ada
Asetaminofen dosis besar menyebabkan persediaan glutation di hati berkurang

dan N-asetil-benzokuinoneimin bereaksi dengan grup sulfihidril protein hati,


membentuk ikatan kovalen. Dapat terjadi nekrosis hati, suatu kondisi yang sangat
serius dan berpotensi mengancam kehidupan. mengandung tidak lebih dari 110% dan tidak
kurang dari 90% dari jumlah yang tertera pada label Parasetamol dan Kofein.

Asetosal yang mempunyai daya kerja analgenik, antipiretik dan antiradang merupakan obat
yang telah lama digunakan dan semula dimaksudkan sebagai obat antipiretik pengganti
kina.
Berbeda dengan obat-obat golongan opium/narkotik dan turunanya yang digunakan sebagai
obat analgenetik, asetosal tidak mempengaruhi fungsi mental dan diperkirakan bekerja
pada sistem saraf pusat di bagian subkorteks. Asetosal diperkirakan mencegah sintesis dan
pelepasan prostaglandin pada tempat reseptor rasa sakit. Kemampuan mencegah sintesis
prostaglandin, menyebabkan asetosal selain mempunyai daya kerja analgenik juga
mempunyai daya kerja antipiretik dan antiradang. Asetosal juga mempunyai kecenderungan
mengurangi daya beku darah, sehingga digunakan juga sebagai obat antikoagulan,
antitrombotik, dan fibrinolitik.
Daya keja antiradang asetosal, yang mampu mengurangi bengkak dan penggumpalan darah
di bagian tubuh tertentu, menyebabkan asetosal banyak juga digunakan untuk mengatasi
penyakit artritis.
Efek samping asetosal yang tidak dikehendaki, antara lain menyebabkan pendarahan dan
tukak lambung. Hal ini disebabkan oleh iritasi pada selaput mukosa, selain pencegahan
sintesis prostaglandin yang dapat menghentikan sekresi asam lambung, mengakibatkan
pendarahan.
Asetosal juga dapat menyebabkan serangan asma akut pada penderita alergi. Dengan
demikian, bagi penderita asma alergi, sangat peka dan rawan terhadap asetosal.
Sehubungan dengan pencegahansintesis prostaglandin, efek lain dapat merangsang
kontraksi rahim sehingga akan menyebabkan komplikasi dan perpanjangan waktu
persalinan. Mengingat efek samping pada lambung, untukobat-obat yang mengandung
asetosal sebaiknya diminum setelah makan, dengan segalas air putih.

Sedangkan nama lain dari piramidon adalah amidopirin, aminopirin. Piramidon ini sanga t
berkasiat untuk melawan demam yang tinggi dan radang. Dan nama lain antalgin ialah
antalgin, dipiron, sangat berkhasiat sebagai analgenik dan spesmolitik (melawan kejang),
maka sering digunakan untuk nmengobati (mengurangi) rasa sakit pada haid, sakit kepala,
sakit encok dan lain-lain.