Anda di halaman 1dari 9

ISOLASI DNA GENOM MANUSIA DARI SAMPEL DARAH (WHOLE BLOOD)

MENGGUNAKAN PROTOKOL KIT PROMEGA


TULISAN MASIH PERLU REVISI dan BELUM RAMPUNG. Silahkan mengisi
komentar dan saran anda di kolom Comment.
ISOLASI DNA GENOM MANUSIA DARI SAMPEL DARAH (WHOLE BLOOD)
MENGGUNAKAN PROTOKOL KIT PROMEGA
Oleh :
HERI SANTOSO (08620061) Student of Biology Departement
Faculty of Science and Technology, Maulana Malik Ibrahim State Islamic
University of Malang
Cp : 085731893986, email : prof_hero89@yahoo.com

BAB I PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada
akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. DNA
adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler
(Jusuf 2001).
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.
Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung.
Teknik melakukan Isolasi DNA Sebenarnya sangat spesifik, terdapat berbagai
macam metode dan protocol yang berbeda. Sampel yang digunakan juga
bervariasi, sehingga diperlukan protocol yang spesifik untuk mengisolasi
DNAnya.Masing masing mempunyai prosedural yang berbeda walaupun
sebenarnya konsep yang dipakai adalah sama, pada praktikum kali ini
dilakukan Isolasi DNA dari sampel darah Manusia (Whole Blood) dengan
menggunakan protocol Kit Promega.
1.2Rumusan Masalah
Dari Latar belakang diatas dapat dikemukakan Rumusan masalah sebagai
berikut:
1.Bagaimana Konsep Teknik isolasi DNA manusia melalui sampel Darah?

2.Bagaimana Reaksi dan perubahan yang terjadi pada Isolasi DNA di setiap
perlakuan dalam isolasi DNA Genom Manusia melalui smapel Darah Manusia
menggunakan Protokol Kit Promega?
1.3Tujuan
1.Mengetahui Konsep dasar teknik Isolasi DNA manusia melalui sampel
darah.
2.Mengetahui reaksi dan perubahan yang terjadi pada Isolasi DNA di setiap
perlakuan dalm Isolasi DNA Genom Manusia Manusia melalui smapel Darah
Manusia menggunakan Protokol Kit Promega.
BAB II Kajian Pustaka
2.1Teknologi Isolasi DNA melalui Sampel Darah Manusia
DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini
sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata. Tetapi DNA dapat
diekstrak dari ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang
sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel,
keluarnya DNA dari nukleus dan pengendapan/presipitasi DNA.
DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas
plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan
hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah
terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan
trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel
darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA
di dalamnya (Allexperts, 2008).
2.2 Konsep Dasar Isolasi DNA
Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein,
mengendapkan DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA
yang diperoleh dan menilai kemurnian DNA. Selanjutnya dengan presitasi
garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan inti. Akhirnya DNA
genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan kembali
endapan yang terbentuk dari larutan dapar yang mengandung suatu bahan
pengawet DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baikapabila didapatkan DNA yang
murni dan utuh.
Langkah pertama adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat
dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan
bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat
seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot
langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel
mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya

pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang


tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti
kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis
dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel
masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk
membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut
kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol
atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (Albert et al 2002).
2.3 Metode dan Protokol dalam Isolasi DNA Manusia
DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu DNA
genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel
berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang
paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut
beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh.
Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya dari 35 g DNA per mL
darah. Dari 150 L sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 2,5
sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel
darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih
dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 106/ mL darah. Setiap
sel rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin
lebih rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau
penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari
sebelum digunakan dalam prosedur isolasi DNA ini.
Pada dasarnya isolasi dan ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk
memisahkan DNA dari komponen sel lainnya. Proses tersebut meliputi tiga
tahapan, yaitu: penghancuran sel, penghilangan protein dan RNA serta
pemurnian DNA.
BAB III METODE PRAKTIKUM
3.1 Alat dan bahan
3.1.1 Alat-alat
1.Tabung sampel
2.Tabung mikrosentrifuse steril spesifikasi 1,5ml (untuk 3l sampel darah)
3.Tabung mikrosentrifuse steril spesifikasi 15 ml (untuk 3ml sampel darah)
4.Sentrifuse
5.Water Bath, 37oC
6.Vortex
7.Rak Tabung
8.Wadah limbah cair
9.Mikropipet

10.Glove dan alat sterilisasi


3.1.2 Bahan-bahan
1.Sampel darah 3 ml
2.Isopropanol suhu ruang
3.Etanol 70% suhu ruang
4.Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution)
5.Larutan pelisis bahan inti (Nuclei Lysis Solution)
6.Larutan RNase (RNase Solution)
7.Larutan Pengendap Protein (Protein precipitation)
8.Larutan Penghidrasi DNA (DNA Rehydration)
3.2 Metode
1)Diambil 3 ml sampel Darah (whole blood).
2)Dimasukkan kedalam tabung sampe 15 ml dan diinvert 5-6kali secara
lembut agar mix.
3)Ditambahkan 9 ml Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution).
4)Dihomogenkan campuran dengan diinvert 2-3 kali agar mix.
5)Diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dalam incubator.
6)Disentrifuse darah yang telah lisis dengan 2.000 rpm selama 10 menit
pada suhu ruang.
7)Dibuang supernatan dengan tidak mengganggu pellet putih yang terlihat.
8)Divortex tabung 10-15 detik sampai sel darah putih terendapkan.
9.Ditambahkan 3 ml Larutan pelisis bahan inti (Nuclei Lysis Solution).
10.Optional, ditambahkan Larutan 15 l RNase.
9)Ditambahkan larutan 1 ml Larutan Pengendap Protein (Protein
precipitation).
10)Divorteks Larutan selama 10-20 detik.
11)Disentrifuse 2.000 rpm selama 10 menit dengan suhu ruang.
12)Diambil supernatant dan dipindahkan kedalam tabung sentrifuse steril
spesifikasi 15 ml yang berisikan 3 ml isopropanol bersuhu ruang.
13)Dibuang campuran larutan secara pelan hingga terlihat endapan DNA
14)Disentrifuse 2.000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang.
15)Ditambahkan etanol 70% bersuhu ruang. Dan diinvert perlahan-lahan
dengan memastikan endapan pellet berada di sisi tabung sentrifuse.
16)Diambil larutan diatas Pelet DNA secara perlahan-lahan dan dikeringkan
menggunakan hair-dryer selama 10-15 menit.
17)Ditambahkan 250 l Larutan Penghidrasi DNA (DNA Rehydration)
18)Diinkubasi DNA semalaman pada suhu ruang atau suhu 4oC.
19)Disimpan DNA pada suhu 2-8oC.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan

Diambil 3 ml sampel Darah (whole blood).


Darah berwarna merah membentuk system koloid
Dimasukkan kedalam tabung sampe 15 ml dan diinvert 5-6kali secara lembut
agar mix.
Darah terlihat lebih homogen dan tidak terjadi stratifikasi.
Ditambahkan 9 ml Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution).
Darah masih bewarna merah dan terjadi stratifikasi kasar
Dihomogenkan campuran dengan diinvert 2-3 kali agar mix.
Darah terlihat lebih homogen dan stratifikasi tidak jelas
Diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dalam incubator.
Darah berwarna lebih pucat dan lebih kental
Disentrifuse darah yang telah lisis dengan 2.000 rpm selama 10 menit pada
suhu ruang.
Terjadi system koloid dengan statifikasi yang angat jelas. Larutan terpisah
menjadi supernatant dan pelet
Dibuang supernatan dengan tidak mengganggu pellet putih yang terlihat.
Didapat hanya bagian pellet yang jumlahnya sedikit dan kental
Divortex tabung 10-15 detik sampai sel darah putih terendapkan.
Sampel darah tidak berwarna merah sekali tetapi lebih terang
Ditambahkan 3 ml Larutan pelisis bahan inti (Nuclei Lysis Solution).
Sampel lebih bening dan sedikit lebih viscous
Optional, ditambahkan Larutan 15 l RNase.
Ditambahkan larutan 1 ml Larutan Pengendap Protein (Protein precipitation).
Sampel masih terlihat lebih bening terjadi stratifikasi kasar
Divorteks Larutan selama 10-20 detik.
Stratifikasi semakin jelas dan bening
Disentrifuse 2.000 rpm selama 10 menit dengan suhu ruang.

Terbentuk supernatant dan pelet


Diambil supernatan dan dipindahkan kedalam tabung sentrifuse steril
spesifikasi 15 ml yang berisikan 3 ml isopropanol bersuhu ruang.
Supernatant semakin liquid dan semakin bening
Dibuang campuran larutan secara pelan hingga terlihat endapan DNA
Endapan yang lebih viscous dalam jumlah sedikit
Disentrifuse 2.000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang.
Terpisahkan sisa-sisa larutan dengan DNA
Ditambahkan etanol 70% bersuhu ruang. Dan diinvert perlahan-lahan
dengan memastikan endapan pellet berada di sisi tabung sentrifuse.
Tidak terjadi perubahan yang signifikan
Diambil larutan diatas Pelet DNA secara perlahan-lahan dan dikeringkan
menggunakan hair-dryer selama 10-15 menit.
Terpisahkan campuran dan tersisakan DNA dan bersifat kental
Ditambahkan 250 l Larutan Penghidrasi DNA (DNA Rehydration)
Tidak terjadi perubahan dalam hal warna. DNA terisolasi
Diinkubasi DNA semalaman pada suhu ruang atau suhu 4oC.

4.2 Pembahasan
Dari penjelasan pada Tinjauan Pustaka diatas maka, dibawah ini akan
dibahas persub bagian untuk menggambarkan secara umum
4.2.1Tahap Penghancuran Sel
Pada Praktikum kali ini dilakukan isolasi DNA genom Manusia dari sampel
Darah menggunakan Protokol instan berupa Kit Promega. Untuk mengisolasi
DNA dari darah, sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom harus
dilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Sel-sel darah
putih yang sudah dipisahkan kemudian ditambahkan Larutan pelisis sel (Cell
Lysis Solution). Tatapi dalam Praktikum kali ini tidak diawali dengan
pemisahan sel darah merah dan darah putih. Hal ini karena Buffer sudah
bekerja langsung pada kedua jenis sel tersebut.
Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution) sebenarnya bersifat sama sebagai
bahan pengawet DNA yaitu, deterjen anionik yang dapat melarutkan

komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga dapat mengurangi aktivitas


Dnase yang terdapat di dalam sel. Menurut Muladno (2002) Secara kimiawi
penghancuran sel tersebut dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia
seperti lisozim, EDTA (etilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil
sulfat). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion
magnesium yang mempertahankan integritas sel. Sedangkan SDS berfungsi
untuk merusak membran sel. Sedangkan Proses selanjutnya dilakukan
Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan kotoran yang ditimbulkan akibat
pengrusakan sel, sehingga yang tertinggal hanya nukleotida (DNA dan
RNA).
Hasil yang didapat dari proses ini adalah materi genetik yang tidak murni.
masih bercampur dengan sisa-sisa organel sel, protein dan senyawasenyawa metabolit lain.
4.2.2Penghilangan Protein dan RNA
Larutan RNase (RNase Solution) dan Larutan Pengendap Protein (Protein
precipitation) ditambahkan dalam rangka proses Penghilangan protein dan
RNA. Untuk menghilangkan protein dari larutan digunakan Larutan
Pengendap Protein (Protein precipitation), yang secara kimiawi teridiri dari
senyawa fenol berfungsi mengikat protein dan sebagian kecil RNA dan
kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Sedangkan
RNA digunakan RNase. Penambahan RNase merupakan opsi. bisa dilakukan
tetapi juga bias tidak perlu dilakukan. Hal ini terkait karena kadar RNA salam
sel relative sesuai kebutuhan. RNA bias jadi hanya sebagian kecil dan tidak
ditranskripsikan. Sehingga tidak perlu. Namun jika sampel yang digunakan
adalah berasal dari sampel kelenjar maka perlu dilakukan penambahan
RNase. RNase tersebut bekerja menghentikan aktivitas RNA dan
menghancurkan molekulnya.
Protein juga dapat dihilangkan dengan bantuan enzim proteinase, sedangkan
RNA yang tertinggal dapat dibersihkan dengan bantuan enzim RNase hingga
tinggal DNA yang terdapat di dalam larutan. Selanjutnya DNA dicampur
dengan etanol dan NaCl yang berfungsi untuk memekatkan dan memisahkan
DNA dari larutan dan mengendapkannya. Endapan DNA yang tampak
seperti tepung berwarna putih tersebut selanjutnya dimurnikan lagi sebelum
kemudian dilarutkan dengan penambahan air atau larutan TE (Tris-EDTA).
DNA yang diperoleh ini kemudian digunakan untuk berbagai analisis
molekuler (Muladno, 2002).
Hasil yang didapat dari proses ini adalah materi genetik yang belum murni.
masih bercampur dengan protein dan senyawa-senyawa metabolit meski
dalam jumalah kecil.
4.2.3Pemurnian DNA

Pemurnian DNA merupakan metode yang harus dilakukan untuk memastikan


bahwa DNA yang diisolasi tidak tercampur dengan molekul lain yang bersifat
kontaminan. Pada praktikum kali ini dilakukan sentrifuse berulangserta
ditambahkan larutan penghidrasi DNA
Salah satu metode yang digunakan untuk isolasi DNA adalah salting out.
Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein
yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada
pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam
diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang
berbeda dari protein satu ke protein yang lainya (Profchm, 2008).
Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 g DNA per mL
darah. Dari 150 L sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 2,5
sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel
darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih
dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 106/ mL darah. Setiap
sel rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin
lebih rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau
penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari
sebelum digunakan dalam prosedur isolasi DNA ini.
Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein,
mengendapkan DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA
yang diperoleh dan menilai kemurnian DNA.
BAB V PENUTUP
5.1 KESIMPULAN
Pada dasarnya isolasi dan ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk
memisahkan DNA dari komponen sel lainnya. Proses tersebut meliputi tiga
tahapan, yaitu: penghancuran sel, penghilangan protein dan RNA serta
pemurnian DNA.
DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas
plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan
hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah
terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan
trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel
darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA
di dalamnya (Allexperts, 2008).
Penggunaan Protokol Kit Promega dalam isolasi DNA Manusia terbukti lebih
praktis dan menghasilkan molekul DNA dlam jumalah yang banyak.
DAFTAR PUSTAKA
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2002.

Molecular Biology of the Cell. Edisi ke-4. Garland Science: New York. ISBN 08153-3218-1 (versi online di NCBI Bookshelf).
Allexperts. 2008. Biologi Molekuler.http://en.allexperts.com/q/ MolecularBiology-1353/DNA-extraction-using-salting. htm
[Anonim]. 2010. Biologi Molekuler. [terhubung berkala]. http:// www.
Wikimedia.org/file: biologi molekuler.[31 Mei 2010]
Budowle et al. J. Human Genetics 48:137-144 (1991).
Jusuf M. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bogor : Sagung Seto.
Kasai et al. J. Forensic Science 35:1196-1200 (1990).
Morell. Science 260:1422-1423 (4 June 1993).