PERBEDAAN ISOLASI DNA PLASMID DAN ISOLASI DNA

KROMOSOM
1. Sumber DNA
Sumber DNA untuk isolasi DNA kromosom; bisa dari tanaman,
kultur mikroorganise, atau sel manusia.
Sumber DNA untuk isolasi DNA plasmid;hanya ditemukan pada
beberapa bakteri
2. Prinsip isolasi DNA
Prinsip isolasi DNA kromosom yaitu memisahkan DNA kromosom
atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.
Prinsip isolasi DNA Plasmid yaitu DNA plasmid merupakan wadah
yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di
pisahkan dari DNA kromosom.
3. Prosedur kerja Isolasi DNA
Prosedur kerja isolasi DNA kromosom
Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk
membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut
ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan
RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang
tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan
sampai suhu 90C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi
DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol
dan bisa dilarutkan lagi dengan air
Prosedur kerja isolasi DNA Plasmid
DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA
kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur isolasi DNA
kromosom. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan
detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid,
RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein
diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein +
potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi.
Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang
tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk
mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat
dipresipitasi menggunakan etanol
4. Produk yang dihasilkan
Pada isolasi kromosomal produk DNA berupa pelet atau presipitat
sedangkan pada plasmid berupa supernatan, karena perbedaan
berat molekul (ukuran plasmid < kromosom).

5. Tabel Perbedaan
Tabel 3.1. Hasil isolasi DNA kromosomal bakteri E.coli berdasarkan
prosedur kerja manual
Tahap
Kultivasi
Resuspe

Bahan
Media Luria-Bertani broth
60 L EDTA 50 mM

Hasil
Kultur sel bakteri E.coli
DNA tersuspensi

nsi
Lisis sel

Tahap awal pelisisan (dinding sel): Supernatan

DNA,

40 L sukrosa 25%, 10,5 L EDTA natan

kontaminan

berisi

dan

0,5 M pH 8, 1,5 L lisozim 10 mg/mL (penyusun sel) dan zat-zat

Tahap pelisisan kedua (membran sel)
sisa larutan pelisisan sel
: 18 L NaCl 0,5 M, 10,5 L EDTA
0,5 M, 22,5 L SDS 20%, 1,5 L
Purifikasi

Proteinase-K 5 mg/mL
Kloroform

Tiga fasa:
Fasa Atas : DNA murni
dan air (supernatan)
Interfasa : protein dan
zat-zat sisa atau sampah
Fasa organik : kloroform
dan

Pemekat

Etanol

an DNA

senyawa-senyawa

organik terikat
Pelet atau presipitat DNA
kromosomal murni

Tabel 3.2 . Hasil isolasi DNA plasmid bakteri E.coli berdasarkan prosedur
kerja dengan menggunakan spin column
Tahap
Kultivasi

Bahan
Media Luria-Bertani broth

Hasil
Kultur sel bakteri E.coli

(harvesting)
Resuspensi

200 L bufer PD 1 dan RNAse

DNA tersuspensi

(resuspenson)
Lisis (lysis)

200 L bufer PD 2

Supernatan

DNA,

natan

kontaminan

berisi

dan

(penyusun sel) dan zat-zat

sisa larutan pelisisan sel

Netralisasi

300 L bufer PD 3

Supernatan

DNA,

dan

(neutralizatio

natan berisi zat-zat sisa

n)

larutan

pelisisan sel

(PD

2)
Purifikasi
Supernatan DNA elusion dan PD Tiga fasa:
Fasa Atas : DNA murni
(DNA binding column dalam 2 mL collection tube
dan air (supernatan)

DNA
Interfasa : protein dan
elusion)
zat-zat sisa atau sampah
Fasa organik : kloroform
dan
Pemekatan

600 L bufer wash dan etanol

DNA (Wash)

Isolasi DNA Kromosomal Bakteri

senyawa-senyawa

organik terikat
supernatan DNA
murni

plasmid

Kultur bakteri sebanyak 1,5 mL disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu
4C selama 40 menit, lalu disuspensikan kembali pelet yang didapat dengan 60 L EDTA 50
mM, dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4C selama 15
menit. 40 L arutan sukrosa 25% dan 10,5 L EDTA 0,5 M p H 8 ditambahkan pada pelet
yang diperoleh, lalu ditambahkan dengan 1,5 L lisozim 10 mg/mL dan diinkubasi pada suhu
37C selama 1 jam. Ditambahkan 18 L NaCl 5 M, 10,5 L EDTA 0,5 M, 22,5 L SDS 20%,
dn 1,5 L proteinase-K 5 mg/mL dan divortex. Sediaan kemudian diinkubasi pada suhu 50C
selama 1 jam dan ditambahkan kloroform (1:1) lalu dikocok perlahan selama 20 menit.
Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4C selama 30 menit.
Supernatan dipindahkan (larutan yang terlihat bening) ke tabung baru yang berisi 2x volume
etanol dingin, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit dan kemudian
ditambahka pelet dengan 30 L buffer TE.
Isolasi DNA Plasmid dengan Metode Spin Column
Tahap I. Harvesting
1,5 mL kultur sel bakteri disiapkan dalam tabung mikro 1,5 mL lalu disentrifuga pada
14.000 16.000 x g selama 1 menit kemudian dibuang supernatan.
Tahap II. Resuspensi
200 L buffer PD1 (pastikan RNAse A telah ditambahkan) ditambahkan kedalam
tabung mikro kemudian divortex.
Tahap III. Lysis
Tahap III. Neutralization
Ditambahkan 300 L buffer PD3 kemudian dibolak-balik tabung 10 x (tanpa
menggunakan vortex), kemudian disentrifug pada 14.000 16.000 x g selama 3 menit.
Tahap V. DNA Binding
PD column ditempatkan dalam 2 mL collection tube, lalu dituang supernatan dari
tahap 7 dan selanjutnya disentrifuga pada 14.000-16.000 x g selama 30 detik. Cairan pada
collection tube 2 mL dibuang lalu dipasang kembali PD column pada collection tube 2 mL.
Tahap VI. Wash
600 L wash buffer (dipastikan etanol telah ditambahkan) ditambahkan kedalam PD column
kemudian disentrifuga pada 14.000-16.000 x g selama 30 detik. Dibuang cairan dalam
collection tube 2 mL, lalu disentrifuga pada 14.000-16.000 x g selama 3 menit untuk
mengeringkan PD column.
Tahap VII. DNA elution
50 L buffer elusi ditambahkan ke bagian tengah PD column matrix, lalu dibiarkan
selama minimal 2 menit agar buffer elusi terserap dengan sempurna. Setelah itu disentrifuga
pada 14.000-16.000 x g selama 2 menit untuk mendapatkan DNA murni. Dituangkan kembali
cairan dalam collection tube 2 m L ke bagian tengah PD column matrix. Kemudian
disentrifuga pada 14.000-16.000 x g selama 2 menit untuk mendapatkan DNA murni.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Kromosomal DNA Bakteri E.Coli
Tahap pertama setelah dilakukannya kultivasi yaitu resuspensi sel bakteri. Setelah
disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4C selama 20 menit, pelet yang didapat
Kemudian disuspensikan kembali dengan menambahkan 60 L EDTA 50 Mm, lalu
disentrifugasi kembali. Penambahan EDTA ini untuk mencegah koagulasi DNA sehingga
DNA didapat sebagai supernatan dan dapat dipisahkan dengan natannya.
Tahap selanjutnya pada isolasi DNA kromosomal ditambahkan sukrosa 25% dan 10,5 L
EDTA 0,5 M p H 8. Fungsi penambahan EDTA pada tahap ini yaitu untuk mengikat kationkation divalen seperti Mg2+ dan Ca2+. Kedua ion ini berfungsi sebagai kofaktor yang esensial
bagi aktivitas Dnase dalam mencacah molekul DNA. Selain itu, ion Mg dan Ca diketahui
berperan penting dalam memelihara integritas dan kestabilan membrane plasma bakteri
sehingga kerja EDTA juga berfungsi membantu destabilisasi membran. Sedangkan Menurut
Triana, dkk. (2012) penambahan sukrosa berperan dalam melisiskan dinding sel bakteri.
Selanjutnya dtambahkan dengan lisozim 10 mg/mL dan diinkubasi pada suhu 37C selama 1
jam. Pemberian lisozim berfungsi untuk merusak dinding sel bakteri secara enzimatis.
Sedangkan inkubasi dan pengaturan suhu bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim
lisozim.
Tahap lisis sel pada isolasi DNA kromosom bakteri yaitu dengan ditambahkan NaCl,
EDTA dan SDS serta proteinase-K. Penambahan NaCl ini yaitu untuk menghilangkan
polisakarida yang mungkin terdapat pada sel bakteri. EDTA berfungsi untuk mencegah
koagulasi DNA dan menjaga struktur DNA sehingga tidak rusak. Proteinase-K berfungsi
untuk mendenaturasikan protein secara enzimatis, sehingga protein terpresipitasi. SDS
merupakan salah satu jenis deterjen yang dapat mengikat atau menyelimuti protein membran
sehingga terpisah dari bilayer lipid. Deterjen memiliki kemampuan melarutkan lipid sebagai
komponen membran sel, karena memiliki sifat amfipatik (Lubis dan Melviana, 2013). Proses
melarutkan atau memecah komponen membran sel tersebut dikenal dengan istilah solubilisasi
membran sel (Prasetyo, 2009).
Tahap selanjutnya yaitu tahap purifikasi atau pemurnian DNA yang diisolasi. Pada
tahap ini ditambahkan kloroform yaitu agar pelarut organik ini secara signifikan dapat
mendenaturasi protein dan melarutkan komponen lipid, selain itu kloroform juga
menstabilkan zona interfase yang berisi kontaminan DNA. Pada penambahan kloroform ini
akan menghasilkan tiga fasa yaitu paling atas adalah DNA dan air, fasa kedua protein dan
sisa-sisa kontaminan atau sampah dari sel yang disebut juga zona interfase, dan fasa ketiga

adalah kloroform seta senyawa-senyawa organik yang diikatnya sehingga disebut juga fasa
organik. Fase ini memisahkan DNA dengan kontaminannya sehingga DNA yang didapat
merupakan DNA murni, selain itu juga memudahkan pengambilan DNA yang terdapat di fasa
paling atas akibat adanya penambahan kloroform.
Tahap berikutnya adalah pemekatan DNA. Cara sederhana dan murah untuk
memisahkan DNA dari larutan dapat dilakukan dengan presipitasi etanol. Prosedur dasarnya
adalah etanol absolut ditambahkan ke larutan DNA. Proses presipitasi etanol umumnya dapat
dibantu dengan penambahan garam. Setelah perlakuan itu, DNA akan terpresipitasi dan dapat
dipeletkan dengan sentrifugasi. Selanjutnya pelet DNA dicuci dengan etanol 70%. Kemudian
pelet dikeringkan dan setelah itu dilarutkan kembali ke dalam air atau buffer tris EDTA (TE).
Lalu disimpan pada suhu -20C, suhu ini mendukung DNA dalam bentuk presipitat.
Isolasi DNA Plasmid Bakteri E.coli
Metode yang digunakan dalam isolasi DNA plasmid E.coli yaitumetode spin column.
Metode ini merupakan metode yang lebih mudah dilakukan karena larutan-larutan yang
digunakan sudah tersedia dalam bentuk campuran PD column sehingga pengerjaan pun lebih
cepat, akan tetapi metode ini relatif mahal. Pada metode ini terdiri dari 7 tahap yaitu
harvesting, resuspension, lysis, neutralization, DNA binding, Wash, dan DNA elution.
Metode spin column merupakan modifikasi dari metode alkalin lisis dan penggunaan RNAse
untuk memperoleh sel yang terlisiskan dengan sempurna dan meminimalisir kontaminan
genomik (www.geneaid.com).
Pada tahap pertama yaitu harvesting step, ini sama dengan metode kultivasi sel
bakteri pada metode manual. Karenanya disebut tahap pemanenan atau harvesting. Pada
tahap ini kultur sel bakteri yang dibutuhkan yaitu 1,5 mL karena merupakan prosedur standar
dalam pengerjaan metode spin column.
Tahap selanjutnya yaitu tahap resuspension, dengan menambahkan PD 1, dan
sebelumnya telah ditambahkan RNAse. Tahap in sama dengan tahap resuspensi pada metode
manual dengan komposisi Tris-EDTA dan glukosa, sebagai tahap awal perusakan dinding sel
bakteri.
Tahap ketiga yaitu tahap Lysis, dengan menambahkan bufer PD 2. Tahap ini sama
dengan tahap manual pelisisan sel bakteri, yang biasanya menggunakan SDS dan NaOH.
Pada tahap ini berbeda dengan tahap lisis pada isolasi kromosom. Dimana terdapat perusakan
DNAse, yang dikhawatirkan dapat merusak DNA plasmid. SDS merupakan garam deterjen
anionik, yang ketika dilarutkan dalam air akan berdisosiasi menjadi ion Na + dan dan dodesil
sulfat. Dodesil sulfat adalah molekul deterjen berantai hidrofobik panjang dengan gugus
sulfat bermuatan negatif pada salah satu ujungnya. Dodesil sulfat akan berikatan dengan

bagian interior lipid bilayer pada membran sehingga mengakibatkan lisis sel. Komponen
selular bakteri termasuk DNA dan RNA akan keluar dan larut dalam. Ion deterjen dodesil
sulfat juga mendenaturasi protein yang ada dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatankatan non kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga kembali ke struktur
primernya, sebagai rantai linier polipeptida. Hal ini membuat protein-protein enzim
kehilangan aktivitas enzimatiknya, termasuk enzim Dnase yang dikhawatirkan merusak DNA
plasmid. Pada tahap ini larutan akan berisi asam nukleat (DNA dan RNA) dan debris sel yang
terdapat dalam kompleks dodesil sulfat-lipid-protein. Sementara itu, NaOH yang bersifat basa
membuat seluruh molekul DNA berutas ganda baik DNA kromosomal maupun plasmid
mengalami denaturasi menjadi utas-utas tunggal. Itulah mengapa metode ini disebut sebagai
metode lisis basa (alkaline lysis). Pada tahapan ini, DNA kromosomal terpisah sempurna
menjadi utas-utas tunggal terpisah; sedangkan utas tunggal plasmid yang berbentuk lingkaran
tetap terhubung, seperti dua cincin yang saling bertautan. Karakter ukuran dan struktur kedua
jenis DNA inilah yang menjadi dasar pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosomal.
Tahap selanjutnya adalah tahap neutralization atau netralisasi. Pada tahap ini
ditambahkan bufer PD 3, sedangkan pada metode manual tahap netralisasi ini dilakukan
dengan menambahkan sodium asetat pH 5,5. Ion K + bebas yang berasal dari potasium asetat
pada larutan III akan menetralkan muatan negatif dari kompleks kompleks dodesil sulfatlipid-protein terdenaturasi, membentuk potasium dodesil sulfat (KDS) yang tidak larut dan
terpresipitasi bersama lipid membran dan protein yang terdenaturasi. Laju presipitasi KDS
dapat ditingkatkan dengan inkubasi pada suhu es (4oC).
Asam asetat pada sodium asetat ini berfungsi menetralkan suasana basa yang
diciptakan oleh ion hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya.
Ketika pH larutan kembali netral, ikatan-ikatan hidrogen antar basa utas tunggal DNA
terbentuk kembali, sehingga molekul tersebut dapat berenaturasi menjadi DNA berutas
ganda. Proses renaturasi inilah yang menjadi tahap seleksi bagi plasmid. Utas-utas tunggal
sirkular DNA plasmid yang yang berukuran kecil dan tetap saling bertautan dapat
berenaturasi sempurna membentuk utas ganda yang tetap berada dalam larutan; sedangkan
DNA kromosomal yang berukuran jauh lebih besar dari plasmid tidak dapat berenaturasi
sempurna, membentuk struktur kusut tak beraturan yang terperangkap dan ikut terpresipitasi
bersama kompleks KDS-lipid-protein. Oleh karena itu, pencampuran pada tahap lisis sel
harus dilakukan dengan perlahan. Pengocokan yang kuat (misalnya vortex) akan

mengakibatkan molekul DNA kromosom akan terpotong menjadi fragmen-fragmen yang

kecil yang dapat ikut berenaturasi seperti halnya DNA plasmid, dan mengkontaminasi DNA
plasmid.
Tahap kelima yaitu tahap DNA binding, dimana pada tahap ini PD column
ditempatkan pada collection tube 2 mL, dan supernatan pada tahap DNA elution dituangkan
kedalamnya. Sedangkan pada metode manual tahap ini merupakan tahap purifikasi atau
pemurnian DNA plasmid yang diisolasi. Biasanya dilakukan dengan penambahan kloroformalkohol

seperti kloroform-fenol. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan isolat dari

kontaminasi bahan selain DNA. Pada tahap ini, kontaminan yang umum terdapat dalam
larutan adalah protein dan komponen buffer yang digunakan dalam tahap sebelumnya seperti
garam potasium asetat, SDS, dan EDTA. Campuran pelarut organik (kloroform-fenol) ini
secara signifikan dapat mendenaturasi protein dan melarutkan komponen lipid. Jumlah fenolkloroform yang ditambahkan umumnya satu kali volume larutan yang akan dipurifikasi.
Umumnya fenol-kloroform disiapkan dalam bentuk campuran fenol kloroform - isoamil
alkohol dengan perbandingan volume 25:24:1. Campuran fenol-kloroform adalah campuran
yang homogen. Fenol-kloroform dan air tidak dapat bersatu sehingga akan terbentuk dua fase
yakni fase air (fase aqueous) dan fase fenol-kloroform. Fenol-kloroform lebih berat
daripada air sehingga fasenya berada di bawah fase air. Kedua fase kemudian dicampur
dengan cara vorteks. Pencampuran akan membuat fenol masuk ke dalam lapisan air dan
membentuk emulsi droplet. Protein akan terdenaturasi dan terperangkap dalam fase fenolkloroform, sedangkan DNA tetap berada di air. Kedua fase kemudian dapat dipisahkan
dengan baik dengan sentrifugasi. Fase atas yang berisi DNA akan dapat dengan mudah
diambil dengan pemipetan, dan fase fenol-kloroform dapat dibuang.
Tahap selanjutnya yaitu tahap Wash pada tahap ini ditambahkan bufer wash dan
sebelumnya telah ditambahkan etanol. Tahap ini sama dengan tahap pemekatan DNA pada
metode manual. Pemekatan DNA bertujuan memisahkan DNA dari larutan sehingga
diperoleh konsentrasi yang lebih tinggi. Cara sederhana dan murah untuk memisahkan DNA
dari larutan dapat dilakukan dengan presipitasi etanol. Prosedur dasarnya adalah etanol
absolut ditambahkan ke larutan DNA. Proses presipitasi etanol umumnya dapat dibantu
dengan penambahan garam. Setelah perlakuan itu, DNA akan terpresipitasi dan dapat
dipeletkan dengan sentrifugasi. Selanjutnya pelet DNA dicuci dengan etanol 70%. Kemudian
pelet dikeringkan dan setelah itu dilarutkan kembali ke dalam air atau buffer tris EDTA (TE).

Tahap terakhir yaitu tahap DNA elusion, pada tahap ini ditambahkan bufer elusi lalu
disentrifugasi untuk mendapatkan DNA murni yang akan digunakan pada tahap purifikasi
DNA di tahap kelima. Agar didapat DNA plasmid yang benar2 murni maka sebelum
dipurifikasi, DNA telah dimurnikan pada tahap ini. tahap ini lah yang membedakan dengan
metode manual. Pada metode manual, purifikasi langsung dilakukan setelah tahap netralisasi
tanpa sebelumnya ada perlakuan khusus untuk mempersiapkan DNA sebelum memasuki
tahap purifikasi.
I.

KESIMPULAN
Kesimpulan dari praktikum isolasi DNA kromosomal dan lasmid dari bakteri

Escherechia coli yaitu telah dilakukan isolasi DNA kromosomal dan plasmid dari bakteri
E.coli, dengan hasil sebagai berikut:
1.
Pada isolasi kromosomal produk DNA berupa pelet atau presipitat sedangkan pada
plasmid berupa spernatan, karena perbedaan berat molekul (ukuran plasmid <
2.

kromosom).
Penggunaan spin column pada isolasi DNA plasmid lebih efesien waktu dan tenaga
dibandingkan dengan metode manual isolasi DNA kromosomal bakteri E.coli.

DAFTAR PUSTAKA
Gaffar, Sabrani. 2007. Bioteknologi Molekul. Kimia FMIPA universitas Padjadjaran.
Bandung.
Mader,S.S. 1993. Biology. Wm. C Brown Publishers. Lowa
Triana, Rian, Farris Fathin dan Deffy Paradithya. 2012. Laporan Praktikum: Isolasi dan
Pemurnian DNA Plasmid. IPB, bogor.
Hadioetomo. 1993. Media kultur bakteri. Erlangga. Jakarta.
Lubis, D.M. dan Melviana. 2013. Isolasi Dna, Isolasi Protein Darah, Serta Pemeriksaan
Dengan Teknik Pcr, Elektroforesis Agarose Dan Sds-Page. UI. Jakarta.
Prasetyo, A.A. 2009. Materi Asistensi Biomedik FK UNS. Universitas Negeri Surakarta, Solo.
www.geneaid.com (diakses pada 27 Oktober 2014)