Friesta Ade Monita

Risnawati
KELO
MPO
K1

Ole
h

Rahmansyah
Normita Elprianti

Widayanti
Dewi Fitriani

HPLC
(High Performance
Liquid
Chromatography)

POKOK BAHASAN
Pengertian HPLC
Prinsip kerja HPLC
Jenis-jenis HPLC
Instrumen Alat HPLC
Aplikasi Penggunaan HPLC
Kelebihan dan Kekurangan
HPLC
Perawatan Alat HPLC

Pengertian HPLC
Disebut juga dengan kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT) adalah teknik dalam
kimia analitik yang digunakan untuk
memisahkan komponen-komponen dalam
campuran, mengidentifikasi dan mengukur
masing-masing komponen.
Teknik kromatografi ini biasanya disertai
dengan tekanan tinggi seperti teknik
kromatografi pada umumnya, HPLC
berupaya untuk memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan afinitasnya
terhadap zat tertentu.

Prinsip dasar dari KCKT, dan semua

metode kromatografi lainnya adalah
memisahkan setiap komponen dalam
sampel untuk selanjutnya diidentifikasi
(kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing
komponen tersebut (kuantitatif).
Ada dua hal utama yang menjadi krusial
point dalam metode KCKT. Yang pertama
adalah proses separasi/pemisahan dan
yang kedua adalah proses identifikasi.

Prinsip Kerja HPLC

Prinsip kerja alatnya adalah memisahkan
analit-analit berdasarkan kepolarannya.
Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa
diam) dan larutan tertentu sebagai fasa
geraknya.
Hal yang membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah
digunakannya tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak sehingga
campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan
kecepatannya untuk sampai ke detektor

KCKT dapat menganalisa secara kualitatif

dan kuantitatif.
Pada proses kualitatif cara yang paling
umum untuk mengidentifikasi adalah
dengan melihat Retention time (RT).
Selain melihat RT hal lain yang perlu
dilihat adalah spektrum 3D dari signal
kromatogram. Zat yang sama akan
mempunyai spektrum 3D yang juga sama.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat
berbeda, maka kedua zat tersebut juga
dipastikan adalah zat yang berlainan,
meskipun memiliki RT yang sama

Kemudian melalui analisa kuantitatif

dapat diketahui kadar komponen
yang dianalisis di dalam sampel.
Setelah komponen dalam sample
berhasil dipisahkan, tahap
selanjutnya adalah proses identifikasi.
Hasil analisa HPLC diperoleh dalam
bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peakpeak yang menggambarkan
banyaknya jenis komponen dalam
sample.

Kolom merupakan hal yang paling berperan

dalam proses separasi pada sistem HPLC.
Keberhasilan proses separasi sangat
dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan
juga fasa mobil
Biasanya sample yang mengandung banyak
komponen akan mempunyai kromatogram
dengan banyak peak dan bahkan bisa saling
bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan
dalam identifikasi dan perhitungan
konsentrasi. Untuk itu pada sample jenis ini
perlu dilakukan tahapan preparasi yang lebih
rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke
HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.

Jenis-Jenis HPLC
1. Kromatografi
Adsorbsi

4. Kromatografi
Pasangan ion

2. Kromatografi
fase terikat
(Kromatografi
Partisi)

5. Kromatografi
Eksklusi Ukuran

3. Kromatografi
penukar ion

Kromatografi
Afinitas

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah
diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi
lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan
fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika
sebagai fase diamnya

2. Kromatografi fase terikat

(Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini
adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Fase diam yang
paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan pemisahannya adalah fase
terbalik. Fase gerak kromatografi ini
biasanya campuran metanol atau
asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase
diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak.
Kebanyakan pemisahan kromatografi
ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya.
Kromatografi penukar ion dengan fase
gerak air, retensi puncaknya
dipengaruhi oleh kadar garam total atau
kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga
dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi
masalah-masalah yang melekat pada
metode penukaran ion. Sampel ionik
ditutup dengan ion yang mempunyai
muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi
Ukuran
Disebut juga dengan kromatografi
permiasi gel yang digunakan untuk
memisahkan dan menganalisis
senyawa dengan berat molekul > 2000
dalton. Fase diam yang digunakan
dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat
melewati porus (lewat diantara
partikel), atau berdifusi lewat fase
diam.

6. Kromatografi Afinitas
Kromatografi jenis ini dapat
digunakan untuk mengisolasi protein
(enzim) dari campuran yang sangat
kompleks. Fase diam mengandung
gugus-gugus molekul yang hanya
dapat menyerap sampel jika ada
kondisi-kondisi yang terkait dengan
muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana
dalam interaksi antara antigen dan

Instrumen HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas:
Wadah fase gerak (Reservoir)
Pompa
Alat untuk memasukkan sampel (tempat
injeksi),
Kolom
Detektor
Wadah penampung buangan fase gerak
Suatu komputer atau integrator atau perekam.

Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat

dilihat pada gambar di bawah ini :

Aplikasi Penggunaan
HPLC
HPLC cocok digunakan untuk
memisahkan minyak atsiri. Minyak
atsiri terdiri atas campuran yang
sangat rumit dan oleh karena itu
HPLC berguna untuk memisahkan
campuran rumit menjadi golongangolongan senyawa atau memisahkan
golongan senyawa menjadi
komponen-komponennya.

 HPLC juga digunakan untuk memisahkan

golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi,
segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan
gula.
HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat
dideteksi didaerah spektrum UV atau spektrum
sinar tampak
HPLC banyak digunakan dalam industri Farmasi
dan pestisida
HPLC dapat memisahkan dan menganalisis
vitamin-vitamin yang larut dalam air
HPLC digunakan untuk menentukan BM polimer
dan masalah-masalah biokimia
HPLC digunakan untuk analisis anion nitrat
(NO3-)

Kelebihan dan kekurangan HPLC

KCKT menawarkan beberapa keuntungan
dibanding dengan kromatografi cair klasik,
antara lain diantaranya:
Cepat
Resolusi
Sensitivitas detektor.
Kolom yang dapat digunakan kembali
Ideal untuk zat bermolekul besar dan
berionik
Mudah rekoveri sampel

Untuk kelebihan dari alat HPLC antara lain:

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu
campuran dengan daya memisah yang tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi /
kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor
dengan kepekaan yang tinggi.
Kolom dapat digunakan kembali.
Waktu analisa cukup singkat.
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang
tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
Dapat menganalisis sampel yang kecil
kuantitasnya.
Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Untuk kelemahan dari alat HPLC antara

lain:
o Harga sebuah alat HPLC cukup
mahal.
o Sering ada larutan standar yang
tertinggal diinjektor.
o Pada kolom dengan diameter ratarata partikel fase diam dengan
ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela
partikel lebih mudah tertutup oleh
kotoran, jadi harus seringkali dicuci
dan kemurnian larutan harus dijaga.

Perawatan HPLC
Stabilitas pH
Kolom HPLC yang stabil yaitu dalam
rentang pH 2 sampai dengan 8. Jika
mengukur nilai pH, pengukuran
harus dilakukan dalam media air
sebelum mencampur eluen dengan
pelarut organik.

Teknik Stabilitas
Fase stasioner didasarkan pada silika
yang secara mekanik sangat stabil,
dikemas dalam kolom yang
menunjukkan tidak ada batas
tekanan, dan dapat digunakan di
lebih dari 40 MPa (6000 psi) tanpa
masalah. Tekanan menyebabkan
guncangan penyaluran dalam kolom,
yang menghasilkan puncak
membelah pada kromatogram.

Eluen
Penggunaan pelarut murni non HPLC
menyebabkan adsorpsi ireversibel
dari kotoran pada kolom. Kotoran ini
memblokir situs adsorpsi, mengubah
selektivitas kolom dan mengarah ke
puncak memisahkan di kromatogram
tersebut.

Penyimpanan Kolom
Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom
dapat disimpan dalam eluen yang
digunakan dalam terakhiranalisis.
Untuk penyimpanan jangka menengah,
yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom
harus dibilas dengan air yang murni untuk
mencegah pertumbuhan mikroba.
Untuk penyimpanan jangka panjang, silika
kolom tersebut harus dapat disimpan dalam
pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh
lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah
pelarut Asetonitril.

TERIMA KASIH. . . .