Oxidative Phosphorilation

A. Phosphate Estimation
Prinsip
1. Pembentukan ATP dari ADP + Pi melalui ATP-synthase (kompleks V) hanya
dapat terjadi apabila Inner membrane mitokondria tidak dapat ditembus
secara langsung oleh ion H+ yang konsentrasinya lebih tinggi di spatium
intermembran daripada di matriks.
2. Agen uncoupler, seperti 2,4-dinitrophenol, akan meningkatkan permeabilitas
membran dalam lipoid mitokondria terhadap proton. Hal ini akan mengurangi
potensial elektrokimia dan fosforilasi yang terjadi pada ATP-synthase.
Reagen dan Fungsinya
1. Media Inkubasi, mengandung
a. Glukosa (substrat)
b. ATP (substrat)
c. Crude Hexokinase (sebagai enzim/katalisator)
ketiga zat ini akan bereaksi
Glukosa + ATP
glukosa-6-phosphate
Hexokinase
d. KH2PO4 sebagai larutan penyangga
e. EDTA akan menghilangkan logam berat yang mungkin terdapat di dalam
reagen
f. NAD sebagai bahan pembentukan NADH + H+ serta menyediakan NAD
yang mungkin hilang akibat isolasi mitokondria
g. Bovine serum albumin akan menghilangkan uncoupler
2. Sodium/Natrium Hydrogen Glutamat sebagai sumber glutamat yang
nantinya akan mengubah NAD menjadi NADH + H +
3. 2,4-dinitrophenol sebagai agen uncoupler
4. Sukrosa merupakan disakarida yang monosakaridanya dapat digunakan
sebagai sumber pembentukan energi
5. Suspensi mitokondria sebagai sumber mitokondria (tempat berlangsungnya
fosforilasi oksidatif)
6. Trichlor Acetic Acid (TCA) akan mendeproteinasi protein (seperti enzim) yang
terkandung di dalam campuran agar terkoagulasi.
7. Reagen Neumann
a. HNO3 akan menciptakan suasana asam sehingga Pi dapat bereaksi
dengan amonium molibdat
b. Amonium Molibdat akan bereaksi dengan Pi membentuk amonium
fosfomolibdat yang berwarna kuning jernih

KONTEN
TABUNG 1 (mL)
TABUNG 2 (mL)
Media Inkubasi
1,0
1,0
Natrium Hidrogen
0,2
0,2
Glutamat
2,4-dinitrophenol
0,1
Air
0,3
0,2
Sukrosa
0,6
0,6
Suspensi Mitokondria
0,5
0,5
Langkah Kerja
1. Siapkan dua tabung rebus (boiling tube), dua tabung untuk t 0, dan dua
tabung untuk t15
2. Masukkan bahan secara urut dari atas
3. Ambil 0,2 ml dari tabung 1 dan 2. Masing-masing dicampurkan dengan 2,8
ml TCA pada tabung yang dilabeli t0
4. Lakukan sentrifugasi untuk dua tabung t0 selama 15 menit dengan kecepatan
30 x 100 rpm. Sementara itu, lakukan inkubasi sisa campuran tabung 1 dan
2 pada waterbath bersuhu 37o C selama 15 menit.
5. Apabila sudah selesai, lakukan estimasi untuk dua tabung t 0 dengan
mencampurkan
1 ml supernatant + 2 tetes HNO3 pekat + 2 ml amonium molibdat
panaskan amati hasil
6. Setelah waterbath tabung 1 dan 2 selesai, ambil 0,2 ml campuran
tambahkan dengan 2,8 ml TCA pada tabung yang dilabeli t 15.Lakukan
sentrifugasi lalu estimasi Pi.
Hasil dan Pembahasan
Tabung
t0 dari tabung 1
t0 dari tabung 2
t15 dari tabung 1
t15 dari tabung 2

Warna
Kuning Jernih
Kuning Jernih
Kuning lebih Jernih
Kuning Jernih

Pada waktu 0 kedua tabung pertama pada tabel akan menunjukkan warna
kuning jernih. Hal ini dikarenakan masih banyak terdapat kandungan fosfor
inorganik (Pi) yang terdapat di dalam campuran. Selain itu, penambahan TCA
yang mampu mendeproteinasi membuat enzim-enzim mengalami koagulasi.
Akibatnya, akan terbentuk amonium fosfomolibdat dalam jumlah banyak.
Sedangkan, pada waktu 15 tabung 1 akan menunjukkan warna yang lebih
jernih dibandingkan tabung 2. Hal ini dikarenakan terjadinya reaksi fosforilasi
oksidatif pada tabung 1 yang menghasilkan ATP dari ADP + Pi. Pada tabung 2,
penambahan 2,4-dinitrophenol (agen uncoupler) membuat permeabilitas inner
membrane terhadap ion H+ meningkat sehingga ion H+ dapat masuk ke dalam
matriks tanpa melalui ATP-synthase.

B. Oxygen Uptake
Prinsip
1. Pada kompleks IV, elektron akan diangkut menuju akseptor terakhir yakni
oksigen dan akan menghasilkan H2O. Berikut reaksinya,
1/2 O2 + 2H+ + 2eH 2O
2. Sianida sebagai inhibitor akan menghambat transfer elektron pada kompleks
IV, sehingga tidak dihasilkan O2
3. Methylene Blue yang tereduksi dan teroksidasi MB + 2H +
MBH2 memiliki potensial redoks yang setara dengan milik CoQ ; CoQ + 2H +
CoQ.H2, sehingga keduanya dapat bersaing untuk elektron
Reagen dan Fungsi
1. Methylene Blue berfungsi sebagai indikator warna
2. KCN berfungsi sebagai donor sianida
3. Parafin cair berfungsi mengisolasi mitokondria dari udara bebas yang
mengandung O2
KONTEN
TABUNG 3 (mL)
TABUNG 4 (mL)
Media Inkubasi
1,0
1,0
Natrium Hidrogen
0,2
0,2
Glutamat
2,4-dinitrophenol
0,1
Methylene Blue
0,2
0,2
KCN
0,1
Air
Sukrosa
0,6
0,6
Suspensi
0,5
0,5
Mitokondria
Langkah Kerja
1. Siapkan tiga tabung reaksi
2. Isi dengan bahan-bahan secara urut dari atas

TABUNG 5 (mL)
1,0
0,2
0,2
0,1
0,6
0,5

3. Tambahkan parafin cair pada ketiga tabung

4. Inkubasi 3 tabung tersebut dalam waterbath 37 o C, lalu amati warna yang
muncul
Tabung
3 (tiga)
4 (empat)
5 (lima)

Warna
Jernih
Biru kehijauan
Biru muda

Hasil dan Pembahasan