LAPORAN GENETIKA (BI-2105)

ISOLASI DNA PLASMID pET-32b(+) DAN AMPLIFIKASI

GEN phoR
Tanggal Praktikum : 30 Oktober 2015 13 November 2015
Tanggal Pengumpulan : 20 November 2015

disusun oleh :
Dhia Shofi S
10614032
Kelompok 9

Asisten :
Annisa Rizkia

10613016

Muh. Agung Saputra 10613040

PROGRAM STUDI BIOLOGI

SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
BANDUNG
2015

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Isolasi DNA merupakan proses pemurnian DNA dari sampel
menggunakan kombinasi metode fisik dan kimiawi. Tujuan dilakukannya
isolasi DNA adalah untuk mendapatkan DNA yang benar-benar murni
untuk kemudian dilakukan investigasi lebih lanjut. DNA sendiri
merupakan materi genetik yang diwariskan dan bersifat spesifik pada
setiap individu dan dapat diaplikasikan pada kepentingan identifikasi
pelaku kejadian (kepentingan forensik), identifikasi penyakit, dan
penyisipan gene of interest untuk diamplifikasi (Dahm, 2008).
Salah satu DNA yang banyak digunakan untuk kepentingan ini
adalah DNA plasmid pada bakteri. DNA genom tidak digunakan untuk
proses amplifikasi dengan mesin PCR karena ukuran DNA genom lebih
besar dibanding DNA Plasmid. Selain itu, DNA plasmid juga bersifat
independen yang artinya bisa menduplikasi dirinya sendiri terlepas dari
kegiatan DNA genom. Selain itu, DNA plasmid lebih mudah ditransfer
dengan proses transformasi yang memungkinkan penyisipan gen ke
organisme lain seperti ke tanaman karena berukuran lebih kecil (Lipps,
2008).
Amplifikasi gen merupakan metode perbanyakan suatu gen dengan
cara polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi gen dengan metode
PCR bekerja spesifik yang bisa segera mengenali daerah sampel DNA
yang terkena translokasi. Amplifikasi gen dilakukan untuk menganalisis
suatu sampel gen dengan jumlah yang sangat sedikit. Amplifikasi gen
dapat digunakan untuk mengetahui agen penginfeksi dan diskriminasi
strain patogen dan non-patogen, diagnosis awal penyakit malignant seperti

leukemia dan limfoma, perbanyakan gen yang diinginkan, serta untuk

mengidentifikasi sampel DNA berumur ribuan tahun.
Elektroforesis adalah perpindahan materi dari katoda menuju anoda
didalam daerah elektrik. Faktor-faktor yang mempengaruhi perpindahan
partikel saat elektroforesis adalah ukuran DNA, konformasi DNA,
konsentrasi gel, dan jumlah muatan diberikan. Elektroforesis dilakukan
untuk memisahkan DNA dan protein. Contoh aplikasi dari elektroforesis
adalah untuk mengidentifikasi korban dan pelaku berdasarkan hasil band
DNA, melihat kecocokan DNA orang sehat dengan yang mengalami
mutasi. Selain itu, elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui
apakah gene of interest yang diisolasi berhasil diamplifikasi atau tidak
(Robyt & White, 1990).

1.2 Tujuan
Tujuan dari praktikum kali ini adalah :
1. Mengisolasi DNA plasmid pET 32 dengan metode alkali lisis
2. Mengamplifikasi Gen phoR dari DNA plasmid pET 32 yang diisolasi
dengan metode PCR
1. A1.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Plasmid
Plasmid merupakan molekul DNA kecil di dalam sel yang secara fisik
terpisah dari DNA kromosom dan bisa bereplikasi secara independen. Plasmid
biasanya ditemukan pada bakteri sebagai bentuk yang kecil, sirkular, double
stranded. Plasmid juga kadang ditemukan pada archaea dan organisme
eukariot. Plasmid bisa memiliki panjang dari 1 hingga 1000 kbp (Lederberg,
1952).
Plasmid digunakan sebagai vektor perbanyakan/ekspresi suatu gen. Gen
yang akan diamplifikasi disisipkan ke dalam plasmid. Setelah itu, plasmid
dimasukkan ke dalam bakteri melalui proses transformasi dan bakteri dikultur.
Selain untuk mengekspresikan gen tertentu, plasmid juga digunakan untuk
membuat protein dalam jumlah besar (Lederberg, 1952).
Perbedaan DNA plasmid dengan DNA genom ada pada ukuran, bentuk,
organisasi konformasi, dan kandungan yang dibawa. DNA plasmid memiliki
ukuran sekitar 1-1000 kbp, sementara DNA genom memiliki panjang 16012.200 kbp pada prokaryot. DNA plasmid berbentuk sirkular, sementara DNA
genom berbentuk linear pada eukaryot, namun bisa sirkular pada bakteri.
Organisasi dari DNA plasmid kebanyakan memiliki organisasi konformasi
supercoiled, sedangkan DNA genom memiliki organisasi konformasi
melingkar di sekitar histon. DNA genom mengandung informasi penting bagi
kehidupan organisme, sementara DNA plasmid mengandung informasi
tambahan bagi organisme tersebut (Tranbichler & Shapiro, 2006).
Pada percobaan isolasi DNA digunakan DNA plasmid pET-32b(+). DNA
plasmid pET-32b(+) memiliki panjang 5899 bp. Vektor ini memiliki peta
seperti pada gambar 2.1.

Gambar 2.1 Peta DNA Plasmid pET-32b(+) (LaVallie, et al., 1993)

Vektor ini memiliki beberapa sequence landmarks, yaitu T7 promoter

764-780 bp, T7 transcription start 763 bp, TrxTag coding sequence 366-692
bp, HisTag coding sequence 327-344 bp, STag coding sequence 249-293
bp, Multiple cloning sites, (Nco I - Xho I) 158-217 bp, HisTag coding
sequence 140-157 bp, T7 terminator 26-72 bp, lacI coding sequence 11712250 bp, pBR322 origin 3684 bp, bla coding sequence 4445-5302 bp, f1
origin 5434-5889 bp (LaVallie, et al., 1993).
DNA Plasmid bisa muncul dalam bentuk - bentuk tertentu yang disebut
konformasi. Ada 5 tipe konformasi pada DNA plasmid yakni:
1. Nicked open-circular DNA yang memiliki satu strand yang dipotong
(Kroll, et al., 2010)

2. Relaxed circular DNA yang memiliki bentuk sirkular utuh, tidak terpotong
sama sekali kedua strandnya, namun telah direlaksasi secara enzimatik
(tidak supercoiled) (Kroll, et al., 2010)
3. Linear DNA yang memiliki ujung bebas, bisa jadi karena kedua strand
telah dipotong atau karena DNA linear in vivo (Kroll, et al., 2010)
4. Supercoiled (covalently closed-circular) dimana DNA memiliki kedua
strand yang tidak terpotong sama sekali dengan pilinan yang terintegrasi,
yang menghasilkan bentuk yang kompak (Kroll, et al., 2010)
5. Supercoiled denatured DNA, memiliki bentuk seperti supercoiled namun
memiliki area yang tidak berpasangan yang membuatnya jadi kurang
kompak yang bisa jadi terjadi karena suasana yang terlalu basa saat
preparasi plasmid (Kroll, et al., 2010)

Gambar 2.2 Konformasi Plasmid (Focosi, 2014)

2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Polymerase Chain Reaction atau PCR merupakan suatu teknik untuk
mengamplifikasi satu atau beberapa copy dari sebuah DNA dengan prinsip
thermal cycling (Bartlett & Stirling, 2003). Thermal cycling merupakan siklus
pengulangan pemanasan dan pendinginan untuk reaksi pelelehan DNA dan
replikasi enzimatik DNA. Prinsip kerjanya adalah DNA dipanaskan atau
didinginkan pada temperature tertentu yang merupakan temperature efektif
untuk setiap proses enzimatiknya. Proses enzimatik itu terdiri dari beberapa
tahapan yakni: inisiasi, denaturasi, annealing, ekstensi, dan penyimpanan.
Tahap denaturasi, annealing, dan ekstensi dilakukan secara berulang kali
dalam suatu siklus dimana 1 siklus = elongasi + denaturasi + annealing +
elongasi sehingga dengan demikian jumlah gen yang akan diamplifikasi
meningkat berdasar deret eksponensial 2n dengan n merupakan jumlah siklus
(Logan, et al., 2009)

Gambar 2.3 Siklus PCR dengan Suhu Optimum (Viljoen, et al., 2005)

2.3 Elektroforesis
Elektroforesis merupakan metode pemisahan partikel-partikel bermuatan
di dalam medan listrik yang homogen. Pada elektroforesis terdapat beberapa
komponen yakni chamber elektroforesis, sumber tegangan, gel, dan materi
yang akan dielektroforesis (protein, RNA, DNA). Materi yang akan
dielektroforesis seperti DNA ditaruh pada well di gel elektroforesis (agarosa /
polyacrilamide gel) yang berada dalam chamber berisi buffer. Kemudian
chamber dihubungkan dengan sumber tegangan. Prinsip kerja dari
elektroforesis ini adalah sumber tegangan akan menghasilkan suatu medan
listrik homogen, di dalam medan listrik ini, DNA akan mengalami gaya gerak
listrik (ggl) karena muatan yang dimilikinya dan tempatnya yang berada di
dalam medan listrik. DNA akan bergerak ke arah kutub medan yang memiliki
muatan berlawanan dengannya (Robyt & White, 1990).
Elektroforesis bisa memisahkan partikel-partikel karena perbedaan
kecepatan partikel tersebut dalam menempuh matriks elektroforesis (gel). Ada
beberapa hal yang dapat mempengaruhi kecepatan suatu partikel menempuh
gel elektroforesis yakni:
a. Ukuran DNA
Ukuran DNA menentukan kecepatan pergerakan pada gel. Molekul
DNA yang lebih besar akan lebih tertahan pada gel, sementara molekul
yang lebih kecil lebih tidak tertahan sehingga akan menempuh gel lebih
cepat (Lucotte & Baneyx, 1993).
b. Konformasi DNA
DNA yang memiliki konformasi supercoiled akan bergerak lebih
cepat daripada DNA relaxed. Hal ini dapat terjadi karena DNA
supercoiled tergulung secara ketat sehingga lebih kompak dan
memudahkan untuk bergerak lebih cepat (Lucotte & Baneyx, 1993).
c. Konsentrasi gel
Konsentrasi gel menentukan ukuran pori gel yang mempengaruhi
migrasi DNA. Jika konsentrasi gel semakin besar, pori pada gel akan

semakin kecil sehingga lebih menahan DNA dan mengurangi kecepatan

migrasinya. Agarose dengan konsentrasi tinggi baik untuk memisahkan
partikel DNA kecil, sementara agarose dengan konsentrasi tinggi untuk
memisahkan DNA berukuran besar (Lucotte & Baneyx, 1993).
d. Medan listrik yang diberikan
Pada voltase rendah, migrasi DNA proporsional dengan besarnya
tegangan yang diberikan, yakni semakin besar tegangan, semakin cepat
DNA bergerak. Namun, pada medan listrik yang meningkat, mobilitas
fragmen DNA berat akan meningkat secara diferensial, dan keefektifan
pemisahan menuruh dan resolusinya kemudian lebih rendah pada voltase
tinggi (Lucotte & Baneyx, 1993).

BAB III
METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA, PCR, dan
elektroforesis terdapat dalam Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Alat dan bahan praktikum isolasi DNA, PCR, dan elektroforesis

Alat

Bahan

Mikropipet

Kultur Bakteru E. coli

Alat Sentrifugasi

Microtube

Alat Vortex

Tips

Timbangan analitik (ketelitian minimal

0.001 gram)

Larutan I, II, dan III

Mesin PCR

Et-OH 95%

Tabung Eppendorf

Et-OH 70%

Alat Pemanas

TE Buffer/Air Deion

Alat Elektroforesis Horizontal

DNA Hasil Isolasi

Sumber Arus

PCR Mix
Primer
Agarosa
Buffer TAE
Etidium Bromida

3.2 Cara Kerja

3.2.1

Isolasi DNA Plasmid

Kultur bakteri E.coli diambil sebanyak 1000 L dengan mikropipet.

Kemudian kultur dimasukkan ke dalam microtube 1.5 mL. Setelah itu

microtube disentrifugasi dengan kecepatan maksimum selama 1 menit. Dari
hasil sentrifugasi akan didapatkan supernatan dan pellet. Bagian supernatant

dibuang kemudian pellet dikeringkan. Setelah itu, pelet ditambahkan 200 l

solution I. Setelah itu microtube divortex, lalu ditambahkan 200 L solution
II. Micortube kemudian dibolak-balik hingga larutan homogen. Setelah itu
ditambahkan 150 L solution III dan dibolak-balik lagi hingga larutan
homogen. Berikutnya microtube kembali disentrifuga dengan kecepatan
maksimum selama 5 menit. Didapatkan kembali pellet dan supernatan dari
hasil sentrifuga. Supernatan hasil sentrifuga dipisahkan ke dalam microtube
baru. Setelah itu supernatan ditambahkan ethanol absolut bervolume dua kali
lebih banyak dengan volume larutan plasmid, kemudian divortex dan
didiamkan dua menit. Kemudian microtube disentrifugasi dengan kecepatan
maksimum selama 15 menit pada suhu ruang. Kembali didapatkan supernatan
dan pellet. Supernatan dibuang dan pellet ditambahkan 0.5 mL alkohol 70%
kemudian dibolak-balik hingga homogen dan disentrifugasi lagi dengan
kecepatan maksimum selama 5 menit pada suhu ruang. Setelah itu kembali
didapatkan supernatan dan pellet. Supernatan dibuang sementara pellet
disimpan sampai alkohol menguap. Setelah itu pellet ditambahkan 30 L
nuclease free water kemudian divortex dan diinkubasi pada temperatur -20oC.
3.2.2

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Mula-mula DNA target diambil sebanyak 1 L. Kemudian dimasukkan ke

dalam microtube dan diencerkan dengan air deion sampai total larutan 25 L.
Setelah itu larutan ditambahkan PCR mix sebanyak 10 L. Lalu larutan
dihomogenisasi

dan

kemudian

disentrifuga.

Setelah

itu,

microtube

dimasukkan ke dalam mesin PCR kemudian didenaturasi awal pada suhu 95oC
selama 5 menit. Setelah itu DNA memasuki siklus denaturasi pada suhu 95 oC
selama 30 detik, annealing pada suhu 65oC selama 30 detik, dan pemanjangan
primer pada suhu 72oC selama 7 menit 45 detik. Siklus dilakukan sebanyak
25x.
3.2.3

Elektroforesis
Agarosa dicampurkan dengan buffer TAE dengan volume sama dengan

agarosa hingga konsentrasi akhir 0.3%. Setelah itu agarosa dididihkan di atas
pemanas kemudian didinginkan. Selanjutnya campuran agarosa ini dituangkan

pada cetakan gel yang telah diletakkan comb di atasnya. Kemudian agarosa
didiamkan hingga mengeras. Sebelum mendingin, ditambahkan etidium
bromide kedalam agarosa. Setelah agarosa mengeras, comb dilepaskan dari
cetakan gel. Setelah itu cetakan gel diletakkan pada tangki elektroforesis.
Selanjutnya tangki elektroforesis ditambahkan buffer TAE sampai 1 mm di
atas gel. Kemudian, DNA target diambil sebanyak 10 L kemudian diletakkan
pada parafilm dengan mikropipet. Setelah itu, loading buffer diambil dengan
mikropipet sebanyak 2 L kemudian diletakkan di parafilm tepat di atas DNA
target yang diambil. Selanjutnya kedua larutan diresuspensi dengan cara
menarik dan mengeluarkan kembali kedua cairan dengan mikropipet hingga
homogen. Setelah larutan homogen, larutan dimasukkan ke dalam well
agarosa pada tangki elektroforesis dengan mikropipet. Setelah itu, tangki
elektroforesis dihubungkan dengan generator 100V dan DNA dielektroforesis
selama + 25 menit. Selanjutnya, generator dimatikan dan pencetak gel
dikeluarkan dari tangki elektroforesis. Terakhir, hasil elektroforesis gen dapat
dilihat di bawah sinar UV.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Hasil pengamatan untuk isolasi DNA plasmid pET-32b(+) ditunjukkan
pada gambar 4.1. Untuk hasil elektroforesis gen phoR yang telah di-PCR
ditunjukkan pada gambar 4.2.

Kelompok 9

Gambar 4.1 Hasil Foto Elektroforesis DNA Plasmid pET-32b(+) (dokumentasi pribadi,
2015)

Kel 9

Gambar 4.2 Hasil Foto Elektroforesis Amplifikasi Gen phoR (dokumentasi pribadi,
2015)

Gambar 4.3 Ukuran DNA Ladder 1 kb

4.2 Pembahasan
4.2.1

Metode Isolasi dengan Alkali Lisis

Dalam percobaan kali ini, digunakan metode alkali lisis untuk mengisolasi

DNA plasmid. Metode alkali lisis adalah metode pemisahan menggunakan

tiga larutan, yaitu larutan I, II, dan III yang masing-masing memiliki fungsi di
tiap tahap penambahan. Metode alkali lisis meliputi beberapa tahapan sebagai
berikut:
1. Sentrifugasi
Kultur bakteri yang telah dipanen dimasukkan ke dalam microtube kemudian
disentrifugasi. Dari hasil sentrifugasi akan didapatkan bagian pellet (bagian
padat) dan supernatan (bagian cair). Bagian pellet merupakan sel bakteri yang
akan diisolasi plasmidnya, sementara bagian supernatan adalah media tumbuh

bakteri tersebut. Supernatan dibuang sementara bagian pelletnya diambil agar

tersisa bagian sel bakterinya saja (Oswald, 2014).
2. Resuspensi
Pada tahap ini, pellet hasil sentrifugasi diresuspensi dengan larutan I yang
berisi Tris, EDTA, glukosa, dan RNase A. Fungsi dari EDTA adalah untuk
menangkap kation divalent seperti Mg2+ dan Ca2+ yang berfungsi dalam
aktivitas DNase dan mengintegrasikan sel bakteri. Dengan adanya EDTA,
aktivitas DNase untuk menghancurkan plasmid dapat dihambat serta dinding
sel diganggu kestabilannya. Glukosa berfungsi untuk menjaga tekanan
osmotik

sehingga

sel

tidak

meledak.

Tris

atau

lengkapnya

tris(hydroxymethyl)aminomethane merupakan buffer pH dengan rumus

molekul (HOCH2)3CNH2. Tris memiliki pKa 8.07 pada suhu 25 oC dan
memiliki range pH efektif antara 7.07 dan 9.07. Sementara RNase A berfungsi
untuk mendegradasi RNA tepat setelah sel lisis. Setelah itu, pellet divortex.
Tujuan dari proses ini adalah untuk menghomogenisasi pellet dengan larutan I
(Oswald, 2014).
3. Lisis
Pada tahap ini, ditambahkan larutan II ke dalam pellet. Larutan II berisi
basa natrium hidroksida (NaOH) dan detergent natrium dodecyl sulfat (SDS).
SDS berfungsi untuk melarutkan membran sel serta mendenaturasi proteinprotein dalam sel yang berfungsi kemudian untuk pemisahan protein dengan
DNA. Sementara itu, NaOH berfungsi untuk menghancurkan dinding sel,
namun fungsi utamanya adalah untuk mengganggu ikatan hidrogen diantara
basa-basa nitrogen DNA sehingga mengubah DNA double stranded menjadi
DNA single stranded. Setelah itu, microtube dibolak-balik untuk dibuat
homogen. Pada tahap ini, untuk menghomogenisasi larutan tidak digunakan
metode vortex karena jika microtube diguncang terlalu kuat, maka DNA
kromosomal yang sudah berada di luar sel bisa terpecah menjadi fragmenfragmen kecil sehingga bisa mengkontaminasi hasil plasmid (Oswald, 2014).

4. Netralisasi
Pada tahap ini larutan ditambahkan larutan III yang berisi potassium
(kalium) asetat (CH3COOK). Tujuan dari penambahan larutan II ini adalah
untuk mengurangi alkalinitas dari larutan karena potassium asetat bersifat
asam dalam air. Dalam kondisi ini, hubungan antara basa-basa DNA single
stranded bisa terbentuk kembali sehingga ssDNA bisa berenaturasi menjadi
dsDNA. Bagian ini merupakan bagian yang selektif. DNA plasmid akan
mudah untuk merenaturasi karena ukurannya yang kecil, sementara DNA
kromosomal akan sulit terenaturasi karena ukurannya yang sangat besar. Pada
bagian ini untuk menghomogenisasi tidak boleh digunakan metode vortex,
sehingga microtube hanya dibolak-balik saja secara manual. Tujuannya adalah
untuk mencegah putusnya DNA kromosomal menjadi fragmen-fragmen kecil
yang bisa terenaturasi. Selain berfungsi untuk mengasamkan larutan, K+ dalam
potassium asetat berfungsi untuk menangkap ion dodecyl sulphate pada
larutan (Oswald, 2014).
dsPlasmid mudah larut dalam larutan, sementara DNA kromosomal, SDS,
protein terdenaturasi akan berinteraksi secara hidrofobik membentuk endapan.
Untuk mempermudah terbentuknya endapan, dilakukan sentrifugasi pada
larutan. Hasilnya adalah supernatan yang mengandung DNA genom dan pellet
yang mengandung DNA kromosom, SDS, dan protein terdenaturasi. Setelah
itu, supernatant dipisah dengan pellet dan diambil supernatannya (Oswald,
2014).
5. Pencucian
Bagian supernatant yang telah didapat dari proses netralisasi masih belum
mengandung DNA plasmid saja, tetapi masih mengandung garam-garam,
EDTA, RNase dan protein residual selular sehingga masih perlu dibersihkan.
Cara pembersihannya yaitu pertama-tama supernatan hasil sentrifugasi
ditambahkan isopropanol. Tujuan dari tahapan ini adalah untuk melarutkan
protein-protein sisa yang bersifat nonpolar, sementara DNA yang bersifat
polar akan tertinggal di bawah. Setelah itu, diinkubasi pada suhu -80oC,
tujuannya adalah untuk mempercepat reaksi isopropanol dengan campuran.

Setelah itu, campuran disentrifugasi untuk mempercepat pemisahan DNA

dengan protein-protein sisa tersebut. Selanjutnya DNA dibersihkan dengan
etanol yang teruji efektif meningkatkan konsentrasi DNA dari 0.1 menjadi 0.5
M. Etanol mengubah struktur DNA sehingga molekul DNA beragregasi dan
mengendap dari larutan, sementara itu molekul-molekul organik dan garamgaram terlarut pada etanol sehingga tetap berada pada fasa cair. Campuran ini
bisa dipisahkan dengan cara sentrifugasi dimana kemudian terdapat
supernatan dan pellet. Pellet inilah yang mengandung DNA sementara
supernatan hanya mengandung molekul-molekul organik lain dan garamgaram. Pellet dipisahkan dengan supernatan (Oswald, 2014).
6. Penyimpanan
Pellet DNA yang telah didapatkan disentrifugasi quick spin pada tahap ini.
Tujuan dilakukan quick spin adalah untuk mengeringkan DNA. DNA yang
telah benar-benar kering kemudian dicampurkan dengan larutan TE pH 8.0.
TE atau tris-EDTA merupakan buffer pH yang komposisinya terdiri dari
10mM tris pH 8.0 dengan HCl, dan 1mM EDTA. Menurut penelitian, pada pH
8.0 ini DNA menjadi kurang aktif, sehingga pH ini efektif untuk penyimpanan
DNA. SEmentara itu EDTA berfungsi untuk mengikat kation metal seperti
magnesium dan kalsium yang mungkin masih tertinggal di larutan untuk
mencegah aktivitas enzimatis. Setelah itu, larutan disimpan pada temperatur 20oC dengan tujuan untuk mengurangi aktivitas DNA sehingga DNA tidak
terdegradasi dan lebih tahan lama (Oswald, 2014).
Pada hasil percobaan, hasil elektroforesis isolasi DNA Plasmid pET32b(+) menyatakan bahwa DNA Plasmid berhasil diisolasi. Tetapi, panjang
dari DNA Plasmid pET-32b(+) tidak dapat dibaca karena tidak adanya gene
ladder yang dapat dijadikan acuan pembacaan panjang DNA. Dari literatur,
panjang dari DNA Plasmid pET-32b(+) adalah 5899 bp (LaVallie, et al.,
1993). Terlihat pula dari gambar, panjang dari DNA yang dielektroforesis
tidak sepanjang kelompok lain. Hal ini bisa disebabkan saat DNA dipipet,
DNA tidak seluruhnya terambil karena jumlahnya yang sangat sedikit. Saat
DNA ditaruh pada gel bisa saja masih terdapat DNA yang tertinggal pada tips

mikropipet ataupun gel tidak seluruhnya masuk ke dalam well namun ada
yang terlepas ke larutan buffer karena kurang berhati-hati dalam prosedur.

4.2.2

Amplifikasi PCR

Pada percobaan PCR digunakan beberapa reagen sebagai berikut beserta

fungsinya:
1. DNA target
DNA target merupakan DNA yang mengandung area yang akan
diamplifikasi atau dengan kata lain rantai DNA yang mengandung gene of
interest (Stock, et al., 2009).
2. Primer
Primer merupakan rantai nukleotida yang berfungsi sebagai starting point
untuk sintesis DNA yang komplemen dengan ujung 3 dari sense dan
antisense DNA target. Primer digunakan untuk replikasi DNA sebab enzyme
yang mengkatalisis proses ini, DNA polymerase hanya bisa menambahkan
nukleotida baru pada strand DNA yang telah ada. Polymerase memulai
replikasi pada ujung 3 dari primer. Primer yang digunakan untuk amplifikasi
gen biasanya memiliki panjang tidak lebih dari 30 nukleotida dan memiliki
ujung yang sama dari awal dan akhir fragmen DNA yang akan diamplifikasi
(Stock, et al., 2009).
3. Dream Taq polymerase
Dream Taq polymerase adalah DNA polymerase yang termostabil yang
diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus. Thermus aquaticus merupakan
bakteri yang hidup di air panas dan pintu-pintu hidrotermal sehingga DNA
polymerasenya tahan terhadap denaturasi pada suhu tinggi. DNA polymerase
ini digunakan untuk menambahkan nukleotida pada rantai DNA yang akan
direplikasi. Temperatur optimum untuk Taq ini adalah 75-80oC dan bisa
mereplikasi 1000 bp DNA dalam waktu kurang dari 10 detik pada temperatur
72oC (Chien, et al., 1976).

4. dNTPs (deoxy-Nucleotide Tri-Phospates)

dNTPs merupakan suatu molekul yang mengandung suatu nukleosida
yang terikat pada 3 fosfat. Nukleosida merupakan suatu kompleks gula
pentose yang terikat pada satu basa nitrogen. Gula pentosa pada dNTPS
merupakan gula deoxyribosa yang merupakan gula ribosa yang kehilangan 1
atom oksigennya. dNTPs terdiri atas dATP (deoxyadenosine triphospate),
dTTP (deoxytimine triphopate), dGTP (deoxyguanine triphospate), dan dCTP
(deoxycytocine triphospate). dNTPs ini berfungsi sebagai building blocks
dalam replikasi DNA. dNTPs akan direkatkan ke ujung 3 primer oleh DNA
polymerase dan saat proses tersebut berlangsung, dNTPs akan kehilangan 2
gugus fosfatnya (Alberts, et al., 2002).
5. Larutan buffer
Larutan buffer merupakan larutan yang mengandung campuran dari asam
lemah dan basa konjugasinya atau basa lemah dan asam konjugasinya. Larutan
buffer akan bergeser sangat sedikit pHnya ketika sejumlah asam atau basa
kuat ditambahkan ke dalamnya sehingga digunakan untuk mencegah
perubahan pH pada larutan. Larutan buffer digunakan untuk menjaga pH pada
suatu nilai yang hampir konstan. Pada percobaan digunakan tris-HCl yang
memiliki pKa 8.06 dan memiliki buffer range 7.5-9.0, pH larutan = 8.0
(Oswald, 2014).
6. MgCl2
Magnesium klorida (MgCl2) adalah suatu garam yang akan terurai menjadi
ion magnesium (Mg2+) dan ion klorida (Cl-) dalam air. Ion magnesium
berfungsi sebagai kofaktor enzim DNA polymerase (Oswald, 2014).
Pada amplifikasi gen, dilakukan tahapan-tahapan tertentu dalam suatu
siklus yang dinamakan siklus termal. Siklus termal untuk PCR terdiri dari
beberapa tahapan yakni:
1. Tahap inisiasi
Tahap ini diatur pada temperatur 94-96oC atau 98oC jika polymerase yang
sangat termostabil digunakan selama 1-9 menit (Logan, et al., 2009).

2. Tahap denaturasi
Tahap ini merupakan tahap siklus pertama yang terjadi pada temperatur
94-98oC selama 20-30 detik. Pada tahap ini terjadi DNA melting dimana
template DNA diganggu ikatan hidrogennya sehingga menghasilkan DNA
single stranded (Logan, et al., 2009).
3. Tahap annealing
Tahap ini terjadi pada temperatur 50-65oC selama 20-40 detik. Pada tahap
ini terjadi penempelan primer pada ssDNA template. Tahap annealing harus
berada pada temperatur yang cukup rendah untuk memungkinan hibridisasi
primer pada strand DNA, namun cukup tinggi agar hibridisasi bisa berjalan
secara spesifik, yakni primer hanya menempel pada area template yang
komplemen dengan primer. Jika temperatur terlalu rendah, primer tidak dapat
menempel dengan sempurna, namun jika terlalu tinggi, primer tidak dapat
menempel sama sekali. Biasanya temperatur untuk proses annealing adalah
sekitar 3-5oC dibawah titik leleh primer yang digunakan (Logan, et al., 2009).
4. Tahap ekstensi / elongasi
Temperatur tahap ini bergantung pada DNA polymerase yang digunakan,
Taq polymerase memiliki aktivitas optimum pada temperatur 75-80oC dan
biasanya temperatur yang digunakan adalah 72oC. Pada tahap ini, DNA
polymerase mensintesis strand DNA baru yang komplemen dengan template
DNA dengan menambahkan dNTPs dari arah 5 ke 3. Waktu ekstensi
berganung pada DNA polymerase yang digunakan dan panjang fragmen DNA
yang diamplifikasi (Logan, et al., 2009).
5. Elongasi final
Tahap ini biasanya dilakukan pada temperature 70-74oC selama 5-15 menit
setelah siklus PCR terakhir untuk memastikan setiap single stranded DNA
yang tersisa diekstensi secara utuh (Logan, et al., 2009).

6. Tahap penyimpanan
Temperatur tahap ini adalah 4-15oC untuk waktu yang tak terhingga. Tujuan
dari tahap ini adalah penyimpanan jangka pendek dari DNA yang telah
direaksikan (Logan, et al., 2009).
Gambar 4.4 menunjukkan proses molekuler yang terjadi pada siklus termal
PCR, sementara gambar 4.5 menunjukkan diagram siklus termal PCR.

Gambar 4.4 Proses molekuler siklus termal PCR (NIH History, 2010)

Gambar 4.5 Siklus PCR dengan Suhu Optimum (Viljoen, et al., 2005)

Pada hasil percobaan, didapatkan bahwa hasil elektroforesis PCR dari gen
phoR berada di sekitar 500bp. Selain itu, terlihat bahwa tidak ada zat lain yang
berada di bawah DNA yang dielektroforesis. Ini tidak sesuai dengan literatur
yang menunjukkan bahwa panjang protein dari gen phoR adalah 1740 bp
(Seki, et al., 1988). Hal ini bisa disebabkan karena DNA tidak seluruhnya
terambil ataupun masih tertinggal dalam microtube. Lalu, saat DNA ditaruh
pada gel bisa saja masih terdapat DNA yang tertinggal pada tips mikropipet
ataupun gel tidak seluruhnya masuk ke dalam well namun ada yang terlepas ke
larutan buffer karena kurang berhati-hati dalam prosedur. Selain itu, dapat
pula terjadi karena konsentrasi primer yang diberikan tidak terlalu tepat
sehingga DNA tidak tertranslasi secara benar.

BAB V
KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari percobaan ini adalah:
1.

Vektor DNA Plasmid pET-32b(+) berhasil diisolasi. Hasil elektroforesis

tidak dapat dibaca karena tidak adanya gene ladder yang dapat dijadikan
acuan pembacaan panjang DNA. Seharusnya didapatkan panjang 5899 bp.

2.

Pada percobaan dapat dilihat bahwa gen phoR berhasil diamplifikasi. Hasil
elektroforesis menunjukkan band yang didapat adalah 500 bp, sementara
jika berhasil seharusnya didapatkan panjang basa 1740 bp.

DAFTAR PUSTAKA
Alberts, B. et al., 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York: Garland
Science.
Bartlett, J. & Stirling, D., 2003. A Short History of the Polymerase Chain
Reaction. Methods in Molecular Biology, Volume 226, pp. 3-6.
Chien, A., Edgar, D. & Trella, J., 1976. "Deoxyribonucleic Acid Polymerase from
the Extreme Thermophile Thermus aquaticus". Journal of Bacterium, 127(3),
pp. 1550-1557.
Dahm, R., 2008. "Discovering DNA: Friedrich Miescher and the Early Years of
Nucleic Acid Research". Human Genetics, 122(6), pp. 565-581.
Focosi,
D.,
2014.
NUCLEIC
ACID
ANALYSIS
IN
VITRO.
http://www.ufrgs.br/imunovet/molecular_immunology/invitrocellfree_nucleic
acid.html. Diakses tanggal 16 November 2015.
Kroll, J., Klinter, S., Schneider, C. & Steinbuchel, A., 2010. "Plasmid Addiction
Systems: Perspectives and Applications in Biotechnology". Microbial
Biotechnology, 3(6), pp. 634-657.
LaVallie, E. et al., 1993. "pET-32a-c(+) Vectors". Bio/Technology, Volume 11, p.
187193.
Lederberg, J., 1952. "Cell Genetics and Hereditary Symbiosis". Physiol, 32(4), p.
403 430.
Lipps, G., 2008. Plasmids: Current Research and Future Trends.. Norfolk:
Caister Academic Press.
Logan, J., Edwards, K. & Saunders, N., 2009. Real-Time PCR: Current
Technology and Applications.. Norfolk: Caister Academic Press.
Lucotte, G. & Baneyx, F., 1993. Introduction to Molecular Cloning Techniques.
New York: Willey-Blackwell.
NIH
History,
2010.
Polymerase
Chain
Reaction
Test.
https://history.nih.gov/nihinownwords/assets/images/archive/polymerasechai
n_lg.jpg. Diakses tanggal 16 November 2015].
Oswald, N., 2014.
The
Basics: how Alkaline
Lysis Works.
http://bitesizebio.com/180/the-basics-how-alkaline-lysis-works/.
Diakses
tanggal 16 November 2015.
Robyt, J. F. & White, B. J., 1990. Biochemical Techniques Theory and Practice.
Waveland: Waveland Press.
Seki, T., Yoshikawa, H., Takahashi, H. & Saito, H., 1988. "Nucleotide Sequence
of the Bacillus subtilis phoR Gene". Journal of Bacteriology, 170(12), pp.
5935-5938.
Stock, S. P., Vandenberg, J., Glazer, I. & Boemare, N., 2009. Insect Pathogens:
Molecular Approaches and Techniques. Oxfordshire: MPG Books Group.
Tranbichler, M. & Shapiro, L., 2006. Chromosome Organization and Segregation
in Bacterial. Journal of Structural, 156(2), p. 292 303.
Viljoen, G. J., Nel, L. H. & Crowther, J. R., 2005. Molecular Diagnostic PCR
Handbook. USA: Springer.