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Instituto Politcnico Nacional

Prctica 4: Precipitacin, separacin y punto


isoelctrico de protenas.
Introduccin
La multiplicidad de grupos cidos y bsicos de una
protena hace que su solubilidad dependa de las
concentraciones de las sales disueltas, la constante
dielctrica del disolvente, pH y temperatura. Algunas
protenas precipitan en condiciones en que otras an
estn bastante solubles. Este efecto debe usarse como
base para la purificacin proteica.
Efecto de la solubilidad de una protena.
La solubilidad de una protena en solucin acuosa es
sensible a las concentraciones de sales disueltas. La
concentracin salina se puede expresar en trminos de
fuerza inica, esta ultima se define como:

Conentracionmolar (cargai nica)


de una especie i nica
I=
2

La solubilidad de una protena a una determinada fuerza


inica vara con las clases de iones en solucin. El
orden de eficacia de los distintos iones en cuanto a su
influencia sobre la solubilidad proteica es bastante
similar para las diferentes protenas y parece deberse en
primer trmino al tamao y la hidratacin del in.
La solubilidad de una protena a baja fuerza inica se
incrementa por lo general con la concentracin salina.
La explicacin del fenmeno salting in (incremento de
la solubilidad por sales), es que a medida que se
incrementa la concentracin salina de la solucin
proteica, los contraiones adicionales recubren con
mayor eficacia las numerosas cargas inicas de la
molcula de protena. Con lo que se incrementa la
solubilidad de la protena. A fuerzas inicas elevadas se
reduce la solubilidad de las protenas, como la mayora
de las sustancias. Este efecto conocido como Salting
out (reduccin de solubilidad por sales) Es por la
competencia por las molculas que interactan entre los
iones salinos agregados y los otros solutos disueltos. A
concentraciones salinas elevadas el solvente se torna
insuficiente para disolver tantos solutos por lo que se
reduce la actividad del solvente. Las interacciones entre
solutos se vuelve mas fuertes que los que hay entre el
soluto y el solvente. Lo que propicia la precipitacin de
este.
Efectos de los solvente orgnicos

Los solventes miscibles con el agua, como la acetona y


el etanol, suelen ser buenos precipitantes de protenas
porque sus bajas constantes dielctricas reducen el
poder de solvatacin de sus soluciones acuosas hacia
los iones disueltos, como las protenas. La reduccin de
la constante dielctrica por los solventes orgnicos
tambin aumenta las diferencias entre las protenas
respecto a su comportamiento en el salting out.
Objetivos
Analizar el efecto que produce la modificacin de
factores fisicoqumicos sobre la solubilidad de las
protenas.
Determinar el punto isoelctrico de la insulina,
basndose en sus propiedades de solubilidad a
diferentes valores de pH.
Resultados
Clculos
Para

el

punto

isoelctrico

de

la

insulina:

pH = pka+log
pH=4.74 +log

[0.20]
[0.05]

pH =5.34
Para cuando nicamente hay concentracin de sal:

1
1
pH =7+ 4.74+ log[0.25]
2
2
pH =9.06
Determinacin del punto isoelctrico de la insulina
Tubo Ac.
Acetato Insulina pH
Observacione
Actico de
40U/ml
s
0.2 M
sodio
(ml)
0.2 M
(ml)
1
0.23
0.02
0.06ml
3.67 No precipito
2
0.15
0.10
0.06ml
4.56 Precipito
3
0.05
0.20
0.06ml
5.34 Precipito
4
0.01
0.24
0.06ml
5.42 No precipito
5
0.00
.025
0.06ml
9.06 No precipito

Precipitacin por metales pesados


Tubo
Clara de
Solucin

Observaciones

huevo
1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

Cloruro
mercrico 5%
(0.25ml)
Nitrato de
plata 2%
(0.25ml)
Acetato de
plomo 2%
(0.25ml)
Cloruro de
bario 5%
(0.25ml)
Cloruro de
sodio 5%
(0.25ml)
Agua (0.25ml)

Precipito

Precipito

Precipito

Precipito en
menor cantidad
Solubilizo la
protena
Solubilizo la
protena

Precipitacin por efecto del pH y disolventes


Tubo
1
2
Clara de
3.0 ml
3.0 ml
huevo filtrada
HCl 0.1 ml
1ml
NaOH 0.1 ml
1ml
Regulador de
acetatos 0.1M
(4.7ml)
Observaciones Precipitacin Precipitacin
media
menor
Etanol
3ml
3ml
Observaciones Precipitacin Precipitacin
media
menor

3
3.0 ml
1ml

Precipitacin
mayor
3ml
Precipitacin
mayor

Salting Out
Filtrado
1
(sobrenadante)
Precipitado 1

Biuret
+
+

Filtrado
2
(sobrenadante)

Precipitado 2

Interpretacin
Positiva porque
hay protenas
Positiva porque
hay protenas
Las
protenas
precipitaron,
estn
en
el
precipitado 2
Positiva porque
hay protenas.

Discusin
1.Separacin de protenas por precipitacin con sales.
Al adicionar 6 mL de la solucin saturada de (NH 4)2SO4
esta provoc la precipitacin de ciertas protenas, esto
fue causado por la competencia que se da por las
molculas de agua solubilizando a la protena y las que
solubilizan a los iones NH 4+ y SO42-, acaparando los
iones las molculas de agua, y causando que la protena
se coagule por las interacciones hidrofbicas que hay
entre los residuos de aminocidos de la misma. Para

comprobar que haba protenas en cada fase se realiz


a una muestra de 1ml de cada una de ellas, la reaccin
de Biuret. De las cuales se obtuvo un resultado positivo
para ambas. Posteriormente el sobrenadante se volvi a
saturar con con (NH4)2SO4 en estado slido para hacer
ms efectiva la saturacin debido a que este no est
diluido en agua. Se agito y se llevo a centrifugar bajo las
mismas condiciones. Finalmente se volvieron a obtener
2 fases un sobrenadante y un precipitado. Se hizo la
transferencia del sobrenadante en otro tubo de ensaye,
el precipitado se disolvi en un mililitro de agua y se
realizo la reaccin de Biuret a ambas fases. Los
resultados que se obtuvieron fueron: positivo para
precipitado y negativo para sobrenadante. Esto sucedi
porque al momento de saturar la solucin lo que paso es
que se hizo precipitar las protenas acelerando el
proceso con la centrifugacin. Al momento de hacer la
prueba de Biuret, las protenas en realidad estn en el
precipitado y no en la fase acuosa de la mezcla
2. Precipitacin por efecto de pH y solventes.
El pH al que la cantidad de precipitado fue mayor, ya
que la composicin de la clara de huevo es:
Ovalbmina 54%, Ovotransferrina 12%, Ovomucoide
11%, Ovoglobulina G2 4%, Ovoglobulina G3 4%,
Ovomucina 3.5%, Lisozima 3.4%, Ovoinhibidor
1%, Ovoglicoprotena 1%, Flavoprotena - 0.8%,
Ovomacroglobulina 0.5%, Avidina 0.05%, Cistatina
0.05%. Debido al alto contenido de ovalbmina,siendo
el punto isoelctrico de dicha protena 4.6 y el regulador
de acetatos de pH=4.7, esto caus que dicha protena
se encontrase en su estado sin carga, precipitando en
mayor cantidad que en los tubos a los que se adicion
HCl y NaOH.
Conclusiones
Las variaciones de pH, presencia de sales y metales
pesados afecta a las protenas de manera directa ya que
provoca cambios en la carga de sus grupos R, alterando
su conformacin estructural, coagulndolas y facilitando
su separacin de acuerdo a la secuencia de
aminocidos y la carga que estas posean, dichas
tcnicas son tiles para el aislamiento e identificacin de
protenas de inters mdico y en investigacin para su
caracterizacin y secuenciacin.
Bibliografa
Zumdahl, Steven S. (2009). Chemical Principles 6th Ed.
Houghton Mifflin Company. p. A21.
Nelson, D. Cox, M. 2013. Lehninger Principles of
biochemistry. W.H. and Freeman. Pp. 147-151.
Voet. 2006. Bioqumica. 3ra edicin. Panamericana. Pp
139-141