DETEKSI ANTIGEN RABIES PADA JARINGAN OTAK

DENGAN METODE FLUORESCENT ANTIBODY TECHNIQUE (FAT)

1. PRINSIP
Organ target virus penyebab penyakit rabies adalah jaringan sistem syaraf pusat (SSP) otak
(khususnya, cerebellum, hipokampus, brain stem, Ammons horn, thalamus, cerebral cortex dan medulla
oblongata). Hewan yang menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak
ditemukan antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. Dalam otak, antigen virus
rabies terdapat dalam jumlah yang sangat banyak terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ
lain, seperti gld salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. Jaringan yang
direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak dan batang otak (brain stem).
Identifikasi agen infeksi atau diagnosis rabies menggunakan fluorescent antibody test (FAT), yang
direkomendasikan oleh WHO dan OIE, karena sensitif, spesifik, dan akurat. Uji FAT merupakan uji gold
standard yang digunakan secara langsung pada preparat ulas (smear). Immunoglobulin murni terhadap
virus atau protein nukleokapsid rabies yang sudah dilabel dengan fluorescein isothiocyanat (FITC)
ditambahkan ke preparat ulas/tekan dari sampel otak yang sudah difiksasi menggunakan aseton. Agregat
protein nukleokapsid diidentifikasi dengan adanya fluoresens spesifik dari ikatan antara konjugat dan
protein nukleokapsid (antigen /Ag antibody/ Ab) tersebut, saat dilihat di bawah mikroskop FAT berwarna
hijau apel yang berpendar dengan intensitas dan bentuk bervariasi.

2. PERALATAN
2.1 Gunting dan pinset
2.2 Gelas obyek/ gelas slide
2.3 Gelas penutup
2.4 Inkubator 370C
2.5 Mikroskop FAT ( Olympus / Nikon )
2.6 Cawan petri
2.7 Lemari pendingin ( Kulkas )
2.8 Gelas beajer
2.9 Pipet Pasteur Spuit 1 ml
3. BAHAN / REAGENSIA / PEREAKSI
3.1 PBS pH 7,4
3.2 Aseton absolut dingin
3.3 Aquades
3.4 Larutan evans blue 1:2000
3.5 Buffer gliserin 50% (mounting media)
3.6 Konjugat Rabies (Biorad), antibodi spesifik terhadap virus rabies dilabel FITC
3.7 Jaringan otak kontrol positif
3.8 Jaringan otak kontrol negative

4. PROSEDUR KERJA
4.1 Pembuatan preparat/ slide tekan :
4.1.1 Buat lingkaran pada gelas obyek yang akan digunakan untuk membuat preparat tekan dengan
menggunakan grafir intan
4.1.2 Tulis nomor / kode spesimen pada ujung preparat
4.1.3 Letakkan sampel pada cawan petri dan potong bagian otak (hipokampus, medulla, pons) dan
letakkan pada paper towel / kertas minyak
4.1.4 Tempelkan gelas obyek pada potongan otak, dimulai dari lingkaran yang dekat dengan nomor
specimen, lalu tekan yang kuat. Lakukan hal yang sama pada lingkaran yang satunya.
Pindahkan pada kertas towel dan tekan yang sama di atas beberapa kali agar mendapatkan
preparat tekan yang tipis. Preparat dikering-anginkan sejenak
4.1.5 Buat preparat kontrol positif rabies seperti di atas
4.1.6 Preparat difiksasi dalam asetone absolut dingin pada suhu -20oC selama 30 menit dan dikeringanginkan kembali
4.1.7 Susun preparat dalam cawan petri besar yang telah dialasi kertas saring basah (untuk menjaga
kelembaban)
4.1.8 Tetesi preparat (0,1 ml) dengan konjugate rabies yang sudah dilarutkan dengan pelarut
konjugat pada lingkaran yang sudah tersedia.
Rekomendasi : U/ memperoleh hasil yang lebih kontras dan lebih baik Fluorescentnya serta
mendeteksi sample yang positif lemah / Low Positif, dianjurkan konjuget Biorad dicampur
dengan Evans Blue 1 % dengan pernbandingan :
0,1 ml Evans Blue 1 % dicampurkan dengan 2 ml konjuget Biorad.

Cara Pembuatan Evans Blue 1 % ( Stock / 1 : 2000 ) ;

Ambil 1 gram Evans blue dicampur 99 ml Aquadest / Aquabidest steril ( Stock 1 % Evans Blue )
Simpan dilemari es / refrigerator suhu 4 8 C

4.1.9 Inkubasikan dalam inkubator selama 30 menit pada suhu 37OC.

4.1.10 Cuci dan rendam dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit sebanyak 2 (dua) kali lalu dikeringanginkan
4.1.11 Beri 1 tetes buffer gliserin 50% sebagai mounting medium, lalu diberi gelas penutup
4.1. 12 Periksa di bawah mikroskop FAT dg kebesaran 40x

5. PENETAPAN HASIL
5.1 Agregat protein nukleokapsid virus Rabies diidentifikasi dengan adanya fluorescens spesifik dari
ikatan antara protein nukleokapsid virus rabies dan konjugat, maka sampel dinyatakan Positif
Rabies. Agregat akan berwarna hijau apel dan bervariasi intensitas serta bentuknya.
5.2 Protein non antigen terlihat berwarna keputihan dan latar belakang memberikan warna merah.

Uji FAT Positif Rabies Sampel Otak (hipokampus)

(i) Evans Blue

(ii) tanpa Evans Blue

6. DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2010, Procedures for Rabies and Lyssavirus Diagnosis Including Rabies Fluorescent Antibody
Test (FAT) and Virus Isolation, Australian Animal Health Laboratory, CSIRO Livestock Australia, p. 1-18
Anonim, 2011, Rabies, In OIE Terrestrial Manual, Office International des Epizooties (OIE). Pp. 1-20
Anonim, 2010, Manual instruction of anti-rabies nucleocapsid conjugate, Biorad

DETEKSI NEGRI BODIES RABIES PADA JARINGAN OTAK

DENGAN PEWARNAAN SELLERS
1. PRINSIP
Hewan yang menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak ditemukan
antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. Dalam otak, antigen virus rabies terdapat
dalam jumlah yang sangat banyak terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ lain, seperti gld
salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. Jaringan yang direkomendasikan
untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak. Sel neuron yang terinfeksi rabies, pada uji
histologi menunjukkan bentukan agregat material viral yang disebut Negri Bodies dalam sitoplasma
neuron. Meskipun demikian, teknik histologi sangat kurang sensitif dibandingkan dengan metoda
imunologik, khususnya pada spesimen autolisis.
Negri bodies merupakan benda inklusi kecil dengan diameter 0.25 0.27 m intrasitoplasma sel
syaraf hewan yang terinfeksi Rabies. Negri bodies dapat berbentuk bulat (round), ovular, ameboid,
segitiga (triangular), atau oval (oblong). Negri bodies dapat dideteksi dengan pemeriksaan histologi
jaringan otak dengan pewarnaan Sellers. Jumlah Negri bodies dapat lebih dari satu dalam sebuah
neuron. Keberadaan dan konsentrasi Negri Bodies tergantung pada tingkat infeksi hewan yang
bersangkutan. Negri Bodies dengan pengecatan Sellers terlihat merah magenta (asidofilik) dan
mempunyai granula biru gelap di dalamnya (basofilik), serta strukur yang berbeda-beda. Ini dapat dilihat
dibawah mikroskop.
2. PERALATAN
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6

Gunting dan pinset

Gelas objek/ gelas slide
Penutup gelas objek
Coplin jar atau staining dish
Mikroskop, perbesaran 1000X
Minyak emersi

3. BAHAN / REAGENSIA
3.1 Otak hewan
3.2 Minyak emersi
3.3 Pewarnaan Sellers
3.3.1
Larutan A :
Methylen Blue
Methyl Alkohol (Bebas Aceton)

1g
100 ml

3.3.2 Larutan B :
Basic Fuchsin

0,5 g

Methyl Alkohol

50 ml

Pembuatan Pewarnaan Sellers :

3.3.2
Campurkan kedua larutan A dan larutan B dengan perbandingan 2 : 1 dengan baik tanpa
disaring
3.3.3 Diamkan / inkubasikan selama 24 jam sebelum digunakan
3.3.4 Simpan didalam ruang yang gelap / hindari sinar cahaya pada suhu ruangan.

3.4 Air kran yang mengalir (tap water)

4. PROSEDUR KERJA
4.1 Pembuatan preparat/ slide tekan :
4.1.1 Buat preparat tekan/ulas dari otak anjing yang diuji dengan menekan organ pada kertas
menggunakan gelas objek.
4.1.2 Tulis nomor specimen pada ujung preparat.
4.1.3 Buat preparat kontrol positif rabies seperti di atas sebegai kontrol positif
4.1.4 reparat yang masih basah dilakukan pewarnaan/fiksasi dalam larutan yang telah disiapkan
selama 5 detik.
4.1.5 Bilas slide dengan cepat pada air yang mengalir / kran.
4.1.6 Kering anginkan sampai kering tanpa ada noda di preparat tersebut.
4.1.7 Tetesi minyak immersi sebagai mounting.
4.1.8 Periksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000X
5. INTERPRETASI DAN PENETAPAN HASIL
Komponen jaringan akan terwarnai sebagai berikut:
5.1 Sel syaraf
5.1.1 Sitoplasma berwarna biru atau biru keunguan
5.1.2 Nuklei dan nukleoli berwarna biru tua/gelap
5.2 Jaringan interstitial berwarna merah muda
5.3 Serabut syaraf berwarna sangat merah muda
5.4 Sel darah merah berwarna merah tembaga
5.5 Spesimen dinyatakan Positif Rabies jika terlihat Negri Bodies yang berwarna merah magenta dan
adanya granula biru gelap serta mempunyai strukur yang beraneka ragam / berbeda beda (dapat
berbentuk bulat (round), ovular, ameboid, segitiga (triangular), atau oval (oblong).

HASIL LAB
LAB UJI
UJI SELLERS
SELLERS
HASIL
Positif

BerwarnaMagenta Oblong

6. DAFTAR PUSTAKA
Velleca, W.M. dan F.T. Forrester, 1981, Laboratory Methods for Detecting Rabies, U.S Department of
Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, p.
104-107; 148-149.

UJI BIOLOGIS RABIES PADA MENCIT

1. PRINSIP
Rabies adalah penyakit zoonotik infeksius yang ditandai oleh encephalitis yang dapat berhubungan
dengan paralisis, perubahan tingkah laku dan manifestasi neurologik yang dapat berakibat fatal. Rabies
diakibatkan oleh virus neurotropik dari Genus Lyssavirus, family Rhabdoviridae dan dapat menular ke
semua jenis mammalia. Organ target virus penyebab penyakit rabies adalah jaringan sistem syaraf pusat
(SSP) otak (khususnya, cerebellum, hipokampus, brain stem, Ammons horn, thalamus, cerebral cortex
dan medulla oblongata).
Pada hewan yang telah menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak
ditemukan antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. Oleh karena itu jaringan otak
merupakan pilihan jenis specimen/contoh yang harus dikirim untuk diagnosa rabies. Dalam otak, antigen
virus rabies terdapat dalam jumlah yang berlimpah terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ
lain, seperti gld salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. Jaringan yang
direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak dan batang otak (brain stem).

Pada kasus jika uji FAT menunjukkan hasil yang tidak dapat disimpulkan, atau kasus paparan rabies
pada manusia, diperlukan uji lebih lanjut terhadap sampel yang sama dengan mengisolasi virus pada
kultur sel atau uji inokulasi pada mencit. Atau melakukan uji ulang FAT terhadap sampel lain yang
direkomendasikan. Uji inokulasi pada mencit dilakukan pada mencit baru lahir atau umur 3-4 minggu yang
diinokulasikan intracerebral. Sampel yang digunakan adalah pool sampel otak dan diobservasi selama 28
hari. Jika terdapat mencit yang mati antara hari ke-5 sampai dengan hari ke-28 post inokulasi maka
sampel otaknya dikonfirmasi dengan uji FAT.
2. PERALATAN
2.1 Gunting dan pinset steril
2.2 Mortar dan pastel steril
2.3 Spuit 1 ml dengan jarum 28G
2.4 Kandang mencit beserta litter (berupa: sekam)
3. BAHAN
3.1 Mencit umur 3-4 minggu (12-14 g) sebanyak 5 ekor atau 1 koloni / litter mencit baru lahir umur 2 hari
3.2 PBS pH 7,4 steril
3.3 Antibiotik
3.4 Diethyl Eter untuk anastesi
3.5 Larutan antiseptik dan kapas
4. CARA KERJA
4.1 Inokulum disiapkan dengan membuat suspensi 10-20% (w/v) dari homogenate otak termasuk batang
otak (seperti cortex, Ammon;s horn, thalamus, medulla oblongata) dalam larutan buffer isotonik yang
mengandung antibiotika, caranya :
Gerus potongan otak kira-kira 1 gram sampai lembut, lalu tambahkan PBS ph 7,4 steril 10 ml
untuk membuat suspensi 10 %
Lalu sentrifuse selama 10 menit.
Ambil 0,9 supernatan dan tambahkan 0,1 antibiotik
4.2 Mencit dianastesi terlebih dahulu, kemudian diinokulasi dengan menyuntikkan inokulum secara
Intracerebral dengan dosis 0,01 0,03 ml
4.3 Mencit diobservasi selama 28 hari

4.4 Setiap mencit yang mati / menunjukkan gejala-gejala rabies ( lumpuh, gemetar ) diuji terhadap rabies
dengan uji FAT. Jika menggunakan mencit baru lahir maka setiap ekor bayi mencit tersebut diuji FAT
pada hari ke-5, 7, 9, dan 11 post inokulasi.
4.5 Jika terdapat kematian mencit pada empat hari pertama post inouklasi maka dinilai sebagai non
spesifik (kemungkinan akibat stres atau infeksi bakterial, dll)

5. DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2011, Rabies, In OIE Terrestrial Manual, Office International des Epizooties (OIE). Pp. 1-20