Anda di halaman 1dari 7

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

(KI3061)
PERCOBAAN 5
UJI AKTIVITAS ENZIM SUKSINAT DEHIDROGENASE

Nama
NIM
Kelompok
Tanggal Percobaan
Tanggal Laporan
Asisten

: Muhamad Gidry Abdurrazak


: 11213016
:4
: 17 April 2015
: 30 April 2015
: Hasti

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2015
1. Tujuan

a. Menentukan pengaruh konsentrasi enzim suksinat dehidrogenase terhadap laju


awal reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat.
b. Menentukan pengaruh konsentrasi suksinat terhadap laju awal reaksi oksidasi
suksinat menjadi fumarat.
c. Menentukan pengaruh inhibitor kompetitif malonat terhadap aktivitas suksinat
dehidrogenase.
2. Data Pengamatan
Tabel 2.1 Volume reagen dan suspensi mitokondria yang ditambahkan pada tiap tabung

Tabung
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Buffer
Uji
(mL)
4
3,5
3,7
3,2
3,4
2,9
2,7
3,4
3,4

Azida
(mL)

DCIP
(mL)

Malonat
(mL)

Suksinat
(mL)

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

0,2
-

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
-

Suspensi
Mitokondria
(mL)
0,0
0,0
0,3
0,3
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6

Tabel 2.2 Absorbansi larutan tiap tabung per 9 menit


Tabung

Lap 1

Lap 2

Lap 3

Lap 4

Menit ke-

18

27

36

Absorbans
i
Menit ke-

10

19

28

37

1,405

1,380

1,345

1,353

Absorbans
i
Menit ke-

11

20

29

38

Absorbans
i
Menit ke-

12

21

30

39

1,354

1,285

1,282

1,285

Absorbans
i
Menit ke-

13

22

31

40

Absorbans
i
Menit ke-

14

23

32

41

1,351

1,337

1,322

1,327

Absorbans
i
Menit ke-

15

24

33

42

Absorbans
i
Menit keAbsorbans
i
Menit keAbsorbans
i

1,220

1,084

1,191

1,182

16

25

34

43

1,351

1,363

1,363

1,345

8
-

17
1,382

26
1,398

35
1,364

44
1,382

3. Pengolahan Data
1.42
1.4

Tabung 2
Absorbansi

Tabung 6

1.38
1.36
1.34 Linear (Tabung 2)

Tabung 4

Linear (Tabung 4)

1.32
1.3
1.28
1.26
1.24 Linear (Tabung 6)
1.22
5

10

15

20

25

30

35

40

Menit ke-

Gambar 3.1 Kurva absorbansi larutan pada tabung 2, 4, dan 6 terhadap waktu
0
0
Laju Awal (Vo)

f(x) = - 0x + 0
R = 0.62

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
[Enzim]

Gambar 3.2 Kurva hubungan laju awal reaksi terhadap konsentrasi enzim suksinat dehidrogenase

1.45
1.4
1.35
Tabung 7
1.3

f(x) = - 0x + 1.39
Linear
(Tabung 7)
f(x)
- 0x
+ 1.36
R ==0.1
R = 0.07

1.25
Absorbansi

1.2
Tabung
1.158
1.1

Linear (Tabung 8)
f(x) = - 0x + 1.17
R = 0

1.05
1
Tabung 9
5

10

15

Linear (Tabung 9)
20 25 30 35

40

Menit ke-

Gambar 3.3 Kurva absorbansi larutan pada tabung 2, 4, dan 6 terhadap waktu

4. Pembahasan
Enzim dehidrogenase adalah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi transfer hidrogen
(atau elektron) dari suatu substrat kepada senyawa akseptor. Senyawa senyawa akseptor
ini meliputi NAD+ (Nicotinamide Adenine Dinucleotide), NADP (Nicotinamide Adenine
Dinucleotide Phosphate), atau senyawa flavoprotein. Salah satu enzim dengan gugus
prostetik flavoprotein yang termasuk enzim dehidrogenase adalah suksinat dehidrogenase
(Nelson dan Cox, 2008:628). Enzim ini berfungsi untuk mengkatalisis reaksi oksidasi
reversibel asam suksinat menjadi asam fumarat dalam siklus TCA (Raven dkk.,
2011:133). Enzim ini juga satu-satunya enzim dalam siklus TCA atau siklus Krebs yang
mengkatalisis transfer elektron langsung ke senyawa flavoprotein, yakni FAD. Reaksi
enzimatik dari asam suksinat-suksinat dehidrogenase ditunjukkan pada Gambar 2.1
(Nelson dan Cox, 2008:628). Senyawa malonat merupakan salah satu inhibitor kompetitif
dari reaksi ini. Struktur senyawa malonat mirip dengan suksinat, sehingga dapat berikatan
dengan sisi aktif enzim suksinat dehidrogenase dan dapat menghambat siklus TCA atau
disebut juga siklus Krebs. Adapun struktur kimia dari malonat ditunjukkan pada Gambar
2.2 (Nelson dan Cox, 2008:628).

Gambar 4.1 Reaksi oksidasi asam suksinat menjadi asam fumarat

Gambar 4.2 Struktur kimia malonat

Reaksi perubahan suksinat menjadi fumarat diukur dengan melakukan pengamatan


terhadap senyawa buatan penerima elektron buatan yang tereduksi. Agar dapat tereduksi,
jalur perpindahan elektron pada mitokondria harus dihalangi dengan menambahkan
senyawa yang dapat menghambat transfer elektron dari sitokrom a3 ke akseptor terakhir,
oksigen, hinggan koenzim Q. Senyawa yang memiliki kemampuan ini diantaranya
natrium azida dan kalium sianida (Nelson dan Cox, 2008:714). Hal ini bertujuan agar
elektron dari SDH-FADH2 dapat diambil oleh akseptor elektron buatan seperti 2,6dichlorophenolindophenol (DCIP). Senyawa DCIP yang mendapatkan elektron dari
SDH-FADH2 akan berubah warna dari biru menjadi bening. Adapun persamaan reaksinya
ditunjukkan pada Gambar 4.3.
SDH-FADH2 + DCIPoksidasi SDH-FADH + DCIPreduksi + 2H+
Biru

Bening

Gambar 4.3 Reaksi redoks antara SDH-FADH2 dan DCIP


Pada percobaan ini, digunakan kembang kol sebagai sumber suspensi mitokondria.
Suspensi mitokondria sendiri adalah sumber dari enzim suksinat dehidrogenase karena
reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat yang dikatalisis enzim ini merupakan bagian dari
siklus Krebs yang terjadi di matriks mitokondria (Raven dkk., 2011:133). Kembang kol
dipotong dan digerus dalam mortar dingin dersama mannitol grinding buffer dingin.
Mannitol grinding buffer berfungsi untuk melarutkan sel yang mengandung mitokondria.
Pasir juga digunakan saat penggerusan untuk menambah kekuatan mekanik sehingga
dinding sel dan jaringan kembang kol dapat rusak dengan mudah. Setelah digerus,
kembang kol diperas dan filtratnya disentrifuga. Supernatan hasil sentrifuga kemudian
difilter dengan cara dekantasi. Kemudian, supernatan hasil dekantasi disentrifuga kembali
agar menghasilkan pellet. Pellet kemudian diresuspensi dengan buffer uji mannitol agar
mitokondria yang ada pada pellet larut.
Penentuan pengaruh konsentrasi enzim suksinat dehidrogenase terhadap reaksi
oksidasi suksinat menjadi fumarat ditunjukkan pada Gambar 3.1 dan Gambar 3.2.
Absorbansi dari larutan pada tabung 2, 4, dan 6 pada Gambar 3.1 menunjukkan
konsentrasi DCIP yang tereduksi. Konsentrasi DCIP yang tereduksi ini secara tidak
langsung menunjukkan konsentrasi suksinat, karena elektron yang mereduksi DCIP
datang dari suksinat yang teroksidasi. Adapun perubahannya terhadap satuan waktu
menunjukkan laju awal reaksi enzimatik oksidasi suksinat menjadi fumarat (Vo).
Perubahan konsentrasi suksinat per satuan waktu ini ditunjukkan dengan nilai mutlak dari

gradien persamaan kurva hasil regresi. Tabung 2, 4, dan 6 sendiri diberikan konsentrasi
suspensi mitokondria yang berbeda seperti ditunjukkan pada Tabel 2.1. Konsentrasi
suspensi mitokondria sendiri merepresentasikan konsentrasi enzim suksinat dehidrogenase
yang ditambahkan. Kemudian hasil yang didapat dari Gambar 3.1 dan data penambahan
suspensi mitokondria dari Gambar 2.1 dihubungkan dengan Gambar 3.2.
Pada Gambar 3.2, didapat bahwa laju awal (Vo) akan berkurang dengan bertambahnya
konsentrasi enzim. Menurut Tahir (2013:3), konsentrasi enzim total berbanding lurus
dengan laju awal. Persamaan yang menghubungkan konsentrasi enzim dengan laju awal
reaksi ditunjukkan pada Gambar 4.3.

Gambar 4.3 Persamaan laju awal reaksi enzimatik (Tahir, 2013:3)


Perbedaan hasil percobaan dengan literatur ini dapat disebabkan oleh kontaminasi
senyawa-senyawa pengotor yang datang dari bagian-bagian sel kembang kol selain
mitokondria yang tidak berhasil terpisahkan dengan filtrasi dan sentrifugasi. Senyawa
senyawa pengotor ini dapat mengacaukan hasil absorbansi dengan ikut bereaksi redoks
dengan DCIP.
Pengaruh inhibitor kompetitif malonat dapat dilihat dari Gambar 3.3. Pada Gambar
3.3, tabung 7 merupakan larutan suspensi mitokondria yang ditambahkan senyawa
malonat. Sebagai perbandingan, digunakan absorbansi tabung 6 yang memiliki
konsentrasi suspensi mitokondria yang sama dengan tabung 7 (Gambar 3.1). Hasil
percobaan menunjukkan bahwa laju awal reaksi pada tabung 7 yang diberi malonat lebih
lambat dibandingkan dengan tabung 6 yang tidak diberi malonat. Hal ini sesuai dengan
literatur, karena inhibitor kompetitif akan mengurangi laju awal reaksi.
Tabung 8 menunjukkan pengaruh natrium azida pada percobaan ini. Pada tabung 8,
natrium azida tidak ditambahkan seperti pada tabung-tabung lain. Sebagai kontrol,
digunakan tabung 6. Hasilnya adalah kurva yang terbentuk memiliki nilai gradien mutlak
yang sangat kecil. Hal ini terjadi disebabkan tidak adanya senyawa penghalang dari jalur
transfer elektron pada mitokondria, sehingga elektron dari senyawa SDH-FADH 2 akan
mengalir dari sitokrom a3 ke akseptor terakhir, oksigen, hingga koenzim Q dan tidak
mengalir ke DCIP. Sehingga DCIP tidak akan tereduksi dan berubah warna dari biru
menjadi bening. Hal ini akan membuat spektrofotometer yang membaca DCIP yang
tereduksi akan menghasilkan pembacaan yang relatif statis dan seolah-olah laju awal
reaksi suksinat-fumarat pada tabung ini sangat kecil.
Tabung 9 menunjukkan pengaruh dari suksinat sebagai substrat dari reaksi oksidasi
suksinat-fumarat. Tabung 9 ditambahkan semua senyawa reagen dan suspensi mitokondria
kecuali suksinat. Sebagai kontrol, digunakan tabung 6. Pada Gambar 3.3, didapat hasil
bahwa kurva dari absorbansi tabung 9 terhadap waktu memiliki nilai gradien mutlak yang
sangat kecil, terutama bila dibandingkan dengan tabung 6. Hal ini menandakan bahwa laju
awal reaksi oksidasi suksinat pada tabung 9 relatif kecil. Hal ini terjadi karena suksinat

yang menjadi donor elektron pada FAD tidak ditambahkan pada tabung 9. Dengan
demikian, senyawa SDH-FADH2 yang menjadi sumber elektron untuk reduksi DCIP
hanya dapat menerima elektron dari suksinat yang sudah ada di mitokondria sebelumnya.
Karena suksinat pada tabung 9 hanya berasal dari mitokondria, maka konsentrasi suksinat
sebagai substrat reaksi menjadi sangat kecil. Konsentrasi substrat sendiri sebanding
dengan laju awal reaksi enzimatik, sehingga konsentrasi substrat yang rendah akan
menghasilkan laju awal reaksi yang rendah pula (Tahir, 2013:3). Hal ini juga ditunjukkan
dalam persamaan laju awal reaksi pada Gambar 4.3.
5. Kesimpulan
a. Hasil percobaan menunjukkan terdapat hubungan antara konsentrasi enzim suksinat
dehidrogenase dan laju awal reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat. Hubungan ini
ditunjukkan pada Gambar 3.2 sebagai berikut:
0
f(x) = - 0x + 0
R = 0.62

0
0
Laju Awal (Vo) 0
0
0
0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7


[Enzim]

b. Hasil percobaan menunjukkan terdapat hubungan antara konsentrasi suksinat dan


laju awal reaksi suksinat menjadi fumarat. Konsentrasi suksinat sebagai substrat
berbanding lurus dengan laju awal reaksi, seperti yang ditunjukkan pada persamaan
pada Gambar 4.3 sebagai berikut:

c. Hasil percobaan menunjukkan inhibitor kompetitif malonat mempengaruhi reaksi


enzimatik oksidasi suksinat yang dikatalisis enzim suksinat dehidrogenase. Pengaruh
inhibitor ini adalah menurunkan laju awal reaksi suksinat menjadi fumarat.
6. Daftar Pustaka
Tahir, Iqmal. 2013.Kinetika Kimia: Kinetika Reaksi Enzimatis [PDF Document].Slide
presentasi pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Gadjah Mada.
Nelson, David L. dan Michael M. Cox.2008. Lehninger: Principles of Biochemistry. New
York: W.H. Freeman Company.
Raven, Peter H. dkk. 2011. Biology (9th edition). New York: McGraw & Hill Companies

Anda mungkin juga menyukai