Anda di halaman 1dari 16

BAB I

PENDAHULUAN
1.1. Latar belakang
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan
kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen
komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat
komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal.
Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Kromatografi juga merupakan pemisahan camuran senyawa menjadi senyawa
murninya dan mengetahui kuantitasnya. Untuk itu, kemurnian bahan atau komposisi
campuran dengan kandungan yang berbeda dapat dianalisis dengan benar. Tidak hanya
kontrol kualitas, analisis bahan makanan dan lingkungan, tetapi juga kontrol dan optimasi
reaksi kimia dan proses berdasarkan penentuan analitik dari kuantitasmaterial. Teknologi
yang penting untuk analisis dan pemisahan preparatif pada campuran bahan adalah prinsip
dasar kromatografi. Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik
kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan
senyawa yang akan dipisahkan.
Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di
laboratorium kimia. Karena pemanfaatannya, metode kromatografi dipakai secara luas untuk
pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap
permulaan untuk semua sampel, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan juka diperlukan
fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara
mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul.
Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan dilakukan dengan menggunakan
salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik
kromatografi itu adalah : Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT),
Kromatografi Gas Cair (GC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Pemilihan
teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa
yang akan dipisah. KKt dapat digunakan terutama bagi kandungan tumbuhan yang mudah
larut dalam air (karbohidrat, asam amino dan senyawa fenolat), KLT merupakan metode
pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut lipid (lipid, steroid, karotenoid, kinon
sederhana dan klorofil), GC penggunannya terutama untuk senyawa atsiri (asam lemak,
mono- dan seskuiterpen, hidrokarbon dan senyawa belerang), cara lain yaitu HPLC, dapat
1

memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. HPLC adalah suatu metode yang
menggabungkan keefisienan kolom dan kecepatan analisis. Untuk lebih memahami mengenai
metode pemisahan menggunakan HPLC maka akan dijelaskan dibagian pembahasan dalam
makalah ini.
1.2. Rumusan masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah dijelaskan diatas, maka penulis dapat
merumuskan beberapa masalah yang ingin diselesaikan, diantaranya adalah:
1.2.1................................................................................................................................................
Apa definisi dari High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)?
1.2.2................................................................................................................................................
Apa Jenis- Jenis High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)?
1.2.3................................................................................................................................................
Apa saja komponen instrummentasi High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)?
1.2.4................................................................................................................................................
Bagaimana prinsip kerja dari High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)?
1.2.5................................................................................................................................................
Bagaimana aplikasi dan kegunaan High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)?
1.2.6................................................................................................................................................
Apa Kelebihan dan Kekurangan High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)?
1.3. Tujuan pembahasan
Adapun tujuan dari pembahasan makalah ini adalah agar mahasiswa mampu:
1.3.1.
Menjelaskan tentang High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
1.3.2.
Menjelaskan Jenis- Jenis High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
1.3.3.
Menjelaskan komponen High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
1.3.4.
Menjelaskan prinsip kerja High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
1.3.5.
Menjelaskan tentang aplikasi dan kegunaan High Performance Liquid
Chromatografi (HPLC)
1.3.6.
Menjelaskan Kelebihan

dan

Kekurangan

High

Performance

Liquid

Chromatografi (HPLC)?
1.4. Batasan masalah
Agar pembahasan makalah ini sesuai dengan tujuan yang diinginkan maka penulis
akan membatasi pembahasan tentang mrtode teknik pemisahan High Performance Liquid
Chromatografi (HPLC).
1.5. Metode pembahasan
Dalam penulisan makalah ini untuk mendapatkan data-data pembahasan maka penulis
menggunakan beberapa metode diantaranya adalah mengambil dari beberapa sumber dimedia
online dan dari jurnal-jurnal yang berkaitan dengan judul pembahasan.
2

BAB II
PEMBAHASAN
2.1. Teori Dasar High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi
untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC (Hight Performance
Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an.
HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya
(kecenderungan suatu unsur atau senyawa untuk membentuk ikatan kimia dengan
unsur atau senyawa lain) terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan

merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat
berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai
afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detector
serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram.
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC
dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Saat ini HPLC merupakan teknik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel
dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri-industri
makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem HPLC,
penggunaan HPLC untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat
dan analisisi senyawa-senyawa kiral.
Prinsip dasar dari HPLC, adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk
selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing
komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial
point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua
adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan
proses analisa.

Gambar 2.1. Instrument HPLC


Sumber : http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
2.2. Jenis- Jenis High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non
polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali
HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. itu, HPLC juga
dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan berdasarkan pada mekanisme
sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
2.1.1................................................................................................................................................
Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase
normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar
90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat
gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai
reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.
2.1.2................................................................................................................................................
Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan
fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
5

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat
krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase
diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi
karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
2.1.3................................................................................................................................................
Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya airalkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi
puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh
penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion
pada resin.
2.1.4................................................................................................................................................
Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel
ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
2.1.5................................................................................................................................................
Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam.
Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu,
kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh
lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi
lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi

ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi
yang lain.
2.1.6................................................................................................................................................
Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel
jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini
dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
2.3. Komponen Instrumentasi High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
Komponen instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak
(Reservoir) , pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah
penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram
skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

Gambar 2.2. Komponen HPLC


Sumber : http://miminsalmiatiakfarkaltara2010.blogspot.co.id/2012_09_01_archive.html
2.3.1. Wadah fase gerak (Reservoir)
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus
dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam
fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak
biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase
normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan

meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut.

Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju


detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam
HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fase gerak HPLC:


1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
3.
4.
5.
6.

mengganggu interpretasi kromatografi.


Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
Zat cair tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
Sesuai dengan detector.

Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:


a) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak
non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang
dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana
atau i-propileter.
b) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase
gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.
2.3.2................................................................................................................................................
Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat

sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert (senyawa atau zat tahan

terhadap reaksi kimia). terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa
adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan,
dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan
konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
1) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara
gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan
berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah
terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup
saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam
kolom.
2) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang
cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
3) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini
murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang
dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan
takanan balik kolom.
2.3.3................................................................................................................................................
Tempat Injeksi (Injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom
secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai
sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 500 L).
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
1) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup,
dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil
clan resolusi tidak dipengaruhi

2) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi
septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil
dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
3) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang
sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD,
sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel
akan masuk ke dalam kolom.
Syarat- syarat injektor yang baik :
a)
b)
c)
d)

Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin


Mudah digunakan
Keberulangan tinggi
Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
2.3.4................................................................................................................................................
Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses
pemisahan solut/analit. Kolom diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi
secara kimia oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen
sample dibawa oleh cairan fasa gerak yang dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati
kolom fasa diam. Komponen-komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan
fasa gerak yang satu sama lain tidak bercampur.
Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari besarnya partikel fase stasioner.
Oleh karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan
berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan efisiensi
kolom. Dengan kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan berjalan dengan cepat.
Terdapat banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat diatur
dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang lebih
tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan
viskositas fase gerak yang agak tinggi.
2.3.5................................................................................................................................................
Detektor
10

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal


(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UVVis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a) mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b) mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil;
c) stabil dalam pengopersiannya;
d) mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
e) signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier);
f) tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Karakteristik detector HPLC:
Dasar
Pendeteksian

Jenis

Maksimum

Peka terhadap

Sensitivitas

sensitifitas

kecepatan alir

suhu

Absorbsi UV

Spesifik

2 x 10-16

Tidak

Rendah

Absorbsi IR

Spesifik

10-6

Tidak

Rendah

Flourometri

Spesifik

10-11

Tidak

Rendah

Indek bias

Umum

1 x 10-7

Tidak

+ 10-4 0 C

Konduktometri

Spesifik

10-8

Ya

2% 0C

Umum

10-10

Tidak

Tidak ada

Spesifik

10-12

Ya

1,5% 0C

Spektometri
massa
elektrokimia

Tabel 2.1. Karakteristik detector HPLC


Sumber : http://materi-kimia-lengkap.blogspot.co.id/2014/07/kromatografi-cair-kinerjatinggi-kckt.html
Sumber : http://materi-kimia-lengkap.blogspot.co.id/2014/07/kromatografi-cair-kinerjatinggi-kckt.html
2.3.6................................................................................................................................................
Pengolahan Data (Data Handling/Data System)
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram
pada rekorder.waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui atau dihitung. Ini bisa
digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat

11

dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi
dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.
2.4. Prinsip Kerja HPLC High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa
geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC,
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya)
akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara
yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention Time (RT). Peak
yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat.
Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram.
Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D
antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan,
meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis
di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom.
Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat
digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga
kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat
(Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida).
Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa
mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen
dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap).
Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu
biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar
sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi
biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini
umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
12

Gambar 2.3. Diagram alir HPLC


Sumber : YELMIDA A. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
2.5. Aplikasi dan kegunaan High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
a) HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas
campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan
campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan
senyawa menjadi komponen-komponennya.
b) HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala
senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula.
c) HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau
d)
e)
f)
g)

spectrum sinar tampak.


Banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
Dapat memisahkan dan menganalisis vitamin-vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
Untuk analisis anion nitrat (NO3-)
2.6. Kelebihan dan Kekurangan High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
HPLC dapat dipandang sebagai pelengkap Gas chromatography (GC). Dalam banyak

hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama
membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada Gas chromatography (GC), namun pada
HPLC zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada
pemanasan atau tidak menguap, HPLC adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti
HPLC menggantikan Gas chromatography (GC), tetapi akan memainkan peranan yang lebih
besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada HPLC karena
teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya
digunakan.

13

Ada beberapa kelebihan dan kekurangan pada High Performance Liquid


Chromatografi (HPLC), antara lain :
2.6.1................................................................................................................................................
Kelebihan High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
a) Kerja lebih mudah dengan automasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data.
b) Volume sampel kecil (dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya).
c) Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya pisah tinggi.
d) Merupakan metode analitis: cepat, peka, akurat, tepat, reproducible, preparatif.
e) Dapat digunakan untuk sampel organik dan anorganik, bersifat volatile dan non
f)
g)
h)
i)
j)
k)

volatil, stabil dan tidak stabil secara termal.


Pilihan fase gerak dan fase diamnya luas.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
Kolom dapat digunakan kembali.
Waktu analisa cukup singkat.
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
tidak stabil.

2.6.2................................................................................................................................................
Kekurangan High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
a) Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu.
b) Hanya bisa digunakan untuk asam organik.
c) Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit dan gradient elusi.
d) Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas.
e) Sering ada larutan standar yang tertinggal di injektor.
f) Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 3 mikrometer
dan 5 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus
seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

14

BAB III
PENUTUP
3.1. Kesimpulan
Dari pembahasan makalah ini maka penulis dapat mengambil kesimpulan,
diantaranya adalah sebagai berikut :
1) Karakteristik dari High Performance Liquid Chromatografi (HPLC) yang membedaknnya
dengan kromatografi lainnya yaitu pada High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)
digunakan pompa yang dapa diatur pada tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
2) Jenis-jenis High Performance Liquid Chromatografi (HPLC) antara lain kromatografi
padatan cair, kromatografi partisi, kromatografi penukar ion (IEC), kromatografi eksklusi,
kromatografi pasangan ion (IPC)
3) Instrumentasi pada High Performance Liquid Chromatografi (HPLC) terdiri atas : pompa,
injector, kolom, detector, system penyuntik, tendon pelarut.
4) Prinsip kerja High Performance Liquid Chromatografi (HPLC) adalah pemisahan analitanalit

berdasarkan

kepolarannya.

Campuran

analit

akan

terpisah

berdasarkan

kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan


berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
5) menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain:
Cepat, Resolusi, Sensitivitas detector, Kolom yang dapat digunakan kembali, Ideal untuk
zat bermolekul besar dan berionik, Mudah rekoveri sampel

15

DAFTAR PUSTAKA
Khrismala Surya Ningsih., dkk. 2010. Makalah Metode Pemisahan Kimia HIGH
PERFORMANCE

LIQUID

CHROMATOGRAPHY

(HPLC).

UNVERSITAS

HALUOLEO. Kendari.
Hazin Ilmi. Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. University Padjadjaran (UNPAD)
https://www.academia.edu/7765761/Makalah_Kromatografi_Cair_Kinerja_Tinggi
(diakses pada 28 Desember 2015)
Anita Tamu Ina. 2013. HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
https://anitamuina.wordpress.com/2013/02/11/hplc-high-performance-liquidchromatography/ (diakses pada 28 Desember 2015)
Ramazona Nababan. 2014. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
http://materi-kimia-lengkap.blogspot.co.id/2014/07/kromatografi-cair-kinerja-tinggikckt.html (diakses pada 28 Desember 2015)
Anonim. 2012. Prinsip dan Instrumentasi High Performance Liquid Chromatography
(HPLC).
https://arycho.wordpress.com/2012/04/08/53/ (diakses pada 28 Desember 2015)
Anonim. 2011. High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
http://indonesiakimia.blogspot.co.id/2011/05/high-performance-liquidchromatography.html (diakses pada 28 Desember 2015)
Eka Andrian. 2013. HPLC
http://ekaandrians.blogspot.co.id/2013/04/hplc.html (diakses pada 28 Desember 2015)
Donny Iqbal Rasyid Elmustafad. 2013. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
http://rasyidel.blogspot.co.id/2013/03/hplc-high-performance-liquid.html

(diakses

pada 28 Desember 2015)

16