Anda di halaman 1dari 13

ELEKTROFORESIS

A. Pengertian Elektroforesis
Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport
atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara
analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein
bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam
medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari
molekul (Titrawani, 1996). Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau
migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai
contoh jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul
dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode. (David G.
Watson, 2007). Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang
telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan
mulai bermigrasi (Ricardson dkk. 1986).
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan
untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Separasi adalah
pemisahan komponen-komponen dari suatu campuran sehingga menjadi fraksifraksi individual. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan
pewarnaan

atau

autoradiografi,

ataupun

dilakukan

kuantifikasi

dengan

densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga


untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang
digunakan.
Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau
gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan
mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk
identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa
yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi
konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan.

Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel


bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub
positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings, 1994: A 6). Prinsip
inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul
berdasarkan muatannya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu
fase diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh
karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam
medan listrik. Kemampuan perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut
menuju ke arah kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan
dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik.
Mobilitas elektroforetik merupakan laju perpindahan partikel bermuatan dalam
cm per detik yang disebabkan karena pengaruh medan listrik 1 V per cm,
dinyatakan dalam cm2V-1s-1. Mobilitas elektroforetik dapat ditetapkan hanya untuk
elektrolit tertentu pada kondisi pengujian yang tepat.
Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat
dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary
electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik
elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul
ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi
dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari
molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis
daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media
penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa
dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose
poliasetat. Adapun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah
disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan
vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena
mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat
sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan
pemisahan yang lebih baik.

Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat


bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam
tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang
sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan
gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak
dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein
yakni: (Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi
molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat
daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
3. Bufer (penyangga)
dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa
protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan
meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini
dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam
bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal
4.

dan migrasi molekul protein sangat lambat.


Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert
yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap
yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran
molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).
Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul,
maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam
medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam
migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi

penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.


5. Kekuatan voltase

Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul


sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.
Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat
secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM
rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak
balik).
6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung.
Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein
dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan
bermigrasinya protein.
B. Jenis-Jenis Elektroforesis
Jenis elektroforesis:
1. Elektroforesis kertas
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari
kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase
gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat
adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan
partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas
penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan
ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Alat untuk elektroforesis kertas


2. Elektroforesis gel
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel
sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya
elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam)

untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein.


Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan
poliakrilamida sebagai gel media.
Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat
kemurnian DNA atau protein yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain
seperti gradient sentrifugasi. Media yang banyak dipakai dalam proses
pemisahan ini adalah agarose atau akrilamid. Agarose digunakan untuk
memisahkan molekul-molekul yang lebih besar karena memiliki ukuran
partikel yang lebih besar. Sehingga daya pisah dari agarose (resolusi) lebih
kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid. Akrilamid memiliki ukuran
partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya lebih baik.
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan
sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular.
Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan
campuran

bahan-bahan

berdasarkan

perbedaan

sifatnya.

Dalam

elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan


muatan

listrik

yang

berbeda-beda

(menggunakan

prinsip

dalam

elektroforesis).

Perangkat elektroforesis gel


Cara kerja:
Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut
fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring"
objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa
objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada
fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda

positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat


elektroforesis gel.
Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom-kolom (disebut
well atau "sumur") pada sisi elektrode negatif. Apabila aliran listrik
diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak dari elektrode
negatif ke arah sisi elektrode positif. Kecepatan pergerakan ini berbedabeda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel
berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan
lebih lambat berpindah.

Jenis-jenis Elektroforesis Gel


a.

Elektroforesis gel agarosa


Metode standar yang

digunakan

untuk

memisahkan,

mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis


gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu
memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara
akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. (Maniatis T. et
al, 1982).
Agarosa yang disari dari ganggang laut merupakan polimer dengan
dasar struktur D-alaktosa dan 3,6 anhidro L-galaktosa. DNA dari 200
basa sampai 50 kilo basa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan
berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam
konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap.
(David G. Watson, 2007)
Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dengan buffer dan
kemudian dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah
mengeras, agarosa membentuk matriks dengan kerapatan yang
ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan
antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral,
bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan oleh ukuran

(panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran


tegangan yang digunakan. (David G. Watson, 2007)
Molekul DNA untai ganda linear, yanag diletakkan pada salah satu
ujung gel, bergerak melalui matriks gel pada kecepatan yang
berbanding terbalik terhadap log jumlah asam basa. Molekul yang lebih
besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih besar. (David G.
Watson, 2007)
Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga
kurang efisien lajunya daripada molekul yang lebih kecil.Fragmen DNA
linear dengan panjang tertentu bermigrasi dengan kecepatan yang
berbeda pada gel yang mengandung konsentrasi agarosa berbeda.
Cara yang paling mudah untuk mendeteksi adanya DNA dengan
menggunakan etidium bromide, suatu senyawa berfluoresensi yang
biasanya digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel agarosa atau
poliakrilamid. (David G. Watson, 2007).
b. Elektroforesis Gel Poliakrilamid
Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas,
biasanya diberikan oleh ammonium persulfat dan distabilkan oleh
TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer terpolimerisasi
menjadi rantai panjang.
Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antar dua
lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan
tertentu. Gel poliakrilamid berukuran dari 5 cm sampai 50 cm
panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan elektroforesis
dengan cara vertikal. (David G. Watson, 2007)
c. Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS ( SDS-PAGE)
Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan
elektroforesis gel poliakrilamid dengan system gerak. Sebelumnya,
campuran protein dipanasi dengan natrium dedosil suldat (SDS), suatu
detergen anionik untuk menyelubungi molekul protein. Penyelubungan
ini menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu sehingga molekul
protein dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai

utama dengan rasio satu molekul SDS untuk dua residu asam amino. .
(David G. Watson, 2007).
Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditambahkan untuk mereduksi
ikatan disulfida. Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi
mempunyai jumlah muatan negatif yang sebanding dengan ukuran
protein. Muatan negatif yuang terdapat pada ikatan SDS ini jauh lebih
besar daripada muatan pada protein asli. Kompleks protein SDS
kemudian dielektroforesis, sehingga semua molekul protein bergerak
menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dalam gel
dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak atau zat warna seperti
Coonassie biru, yang akan menampakkan beberapa pita. (David G.
Watson, 2007).

3. Elektroforesis kapiler
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan
untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida
dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi
buffer.Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940
untuk aplikasi dalam berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia,
lingkungan, dan analisis farmasi.Elektroforesis kapiler menggunakan
listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion atau
molekul netral bergerak ke katode.Deteksi dapat dilakukan dengan teknik
pendeteksian spektrometri atau elektrokimia.Teknik pemisahan ini
dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter
pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan
selektivitas yang baik namun boros listrik karena menggunakan tegangan
tinggi dan alatnya juga mahal.

Skema elektroforesis kapiler


4. Elektroforesis dua dimensi (2-DE atau elektroforesis 2-D)
Elektroforesis dua dimensi (2-DE atau elektroforesis 2-D) adalah
suatu teknik analisis protein dengan melakukan pemisahan protein
menggunakan dua dimensi.Teknik ini sering digunakan untuk studi
proteomika (analisis molekular terhadap keseluruhan protein yang
dihasilkan dari ekspresi gen dalam sel), deteksi marker penyakit,
penelitian kanker dan obat, pemeriksaan kemurnian, dan juga purifikasi
(pemurnian) protein skala mikro. Hal ini dikarenakan, elektroforesis 2-D
mampu memisahkan hingga ribuan protein secara bersamaan.

Skema pemisahakan menggunakan elektroforesis 2-D

Prinsip dasar:
Dalam elektroforesis 2-D, dimensi pertama dalam pemisahan protein
dilakukan berdasarkan titik isoelektrik protein tersebut. Sedangkan, pada
dimensi kedua, protein akan dipisahkan berdasarkan berat molekulernya.
Pemisahan

protein

dengan

teknik

ini

dilakukan

dalam

kondisi

terdenaturasi.
Pada dimensi pertama, protein yang akan dianalisis dilarutkan dalam urea
untuk memutuskan ikatan hidrogen pada protein (agen pendenaturasi).
Urea umum digunakan karena senyawa ini tidak mengubah dalam muatan
protein sehingga pemisahan protein dapat dilakukan berdasarkan
muatannya. Dengan menggunakan medan listrik, protein dipisahkan
melalui gel yang memiliki gradien pH. Protein akan bergerak hingga
berhenti pada titik (pH) dimana muatan protein tersebut netral (titik
isoelektriknya).
Setelah melalui dimensi pertama, protein dipisahkan kembali melalui
dimensi kedua. Biasanya tahap ini dilakukan dengan gel poliakrilamida
dan sodium dodesil sulfat (SDS). SDS akan membuat seluruh protein
bermuatan negatif sehingga pemisahan bisa dilakukan hanya berdasarkan
bobot molekulernya.
Teknik elektroforesis 2-D yang sering digunakan adalah: untuk dimensi
pertama dapat menggunakan elektroforesis pemfokusan isoelektrik
(isoelectric

focusing,

IEF)

dan

nonequilibrium

pH

gradient

electrophoresis (NEPHGE). Sedangkan untuk dimensi kedua, biasanya


digunakan elektroforesis gel poliakrilamida SDS (SDS-PAGE).
Visualisasi dan Evaluasi Hasil:
Untuk melihat hasil pemisahan protein menggunakan elektroforesis 2-D,
dapat dilakukan pewarnaan gel dengan coomasie atau pewarnaan perak.
Teknik visualisasi lain yang dapat digunakan adalah fluorografi dan

autoradiografi (penggunaan radioaktif). Di dalam satu gel, bisa terdapat


ribuan titik protein yang dapat dianalisis atau diambil (dipisahkan)
menggunakan perangkat lunak tertentu. Setelah dilakukan pemilihan dan
pemisahan protein (berupa titik pada gel), analisis lebih lanjut biasanya
dilakukan dengan melakukan digesti protein dan kemudian melalui tahap
analisis menggunakan spektofotometer massa (MALDI-TOF).

Hasil elektroforesis 2-D dengan pewarna Coomasie.

C. Contoh Aplikasi Elektroforesis


1. Pemisahan ion Li+ dan Na+
Kedua kation ini, Li+ dan Na+ sama-sama memiliki muatan +1, namun
memiliki ukuran berbeda. Ion Li+ memiliki ukuran yang lebih kecil dari
Na+. Ion Li+ akan lebih tersolvasi dengan air sehingga akan mengikat
banyak molekul air. Akibatnya mobilitas Li+ akan menjadi kecil dan ion
Na+ akan lebih dahulu keluar dari kapiler.
2. Pemisahan NO2- dan NO3- menggunakan EOF
HNO3 merupakan asam kuat, dalam air akan terurai sempurna menjadi H+
dan NO3-, sedangkan HNO2 merupakan asam lemah, dalam air akan
terdisosiasi sebagian. Pada pH 7, HNO2 akan terdisosiasi sebagian,
menyisakan spesi HNO2. Hal ini tidak baik untuk pemisahan karena tidak
semua HNO2 berada dalam spesi NO2-. Untuk melakukan pemisahan
dengan baik, kita harus menggunakan pH yang tinggi sehingga kedua
spesi tersebut dapat berada dalam bentuk anionnya. Namun ketika pH
sudah diatur tinggi, hanya akan terbentuk satu puncak pada

elektroforegram. Hal ini disebabkan karena kedua spesi akan menuju pada
kutub yang sama. Pemisahan dapat tetap dilakukan dengan baik asalkan
muatan detektor diatur menjadi positif dan muatan injektor diatur menjadi
negatif.

Sistem yang berdasarkan pada skema (a) hanya akan menghasilkan satu
puncak, artinya pemisahan tidak berlangsung dengan baik. Pada skema (b)
akan muncul dua puncak, artinya pemisahan NO3- dan NO2- terjadi dengan
baik. Hal ini disebabkan karena nilai mobilitas elektroforetik (ep) NO3lebih kecil dibanding ep NO2-, akibatnya mobilitas total (t) NO2- menjadi

lebih besar dari t NO3-. Hal ini akan berakibat NO2- akan keluar terlebih
dahulu dibanding NO3-.