Teknik Eksplorasi dan Pengembangan Bakteri Pseudomonas flourescens

ARDIANA KARTIKA B.
(Laboratorium PHP Banyumas)

I. PENDAHULUAN

A. Latar belakang
Iklim Indonesia yang tidak banyak berbeda sepanjang tahun menjadikan

Indonesia diantara negara yang menyimpan keragaman hayati yang sangat berharga dan
perlu dikelola secara benar dan efektif. Salah satu yang perlu menjadi perhatian adalah
mikroorganisme berguna yang dimanfaatkan secara maksimal di dalam sistem PHT.

Secara keseluruhan habitat hidup mikroorganisme berguna terdapat di dalam

tanah sekitar akar tumbuhan (rhizosfer), daun, bunga dan buah (Hasanudin, 2003).

Mikroorganisme yang hidup pada daerah rhizosfer sangat sesuai digunakan sebagai agen
pengendali hayati karena rhizosfer merupakan daerah dimana akar tumbuhan terbuka

terhadap serangan pathogen. Menurut Mulyan (1997) dalam Suryadi, Y., (2009), lama
kolonisasi akar oleh bakteri antagonis merupakan salah satu aspek penting dalam
menentukan

aktifitas

melindungi

daerah

perakaran.

Pseudomonas

flourescens

mempunyai kelebihan yaitu dapat menjadi pengkolonisasi primer bagi akar tanaman

sehingga dengan adanya kolonisasi akar oleh Pseudomonas flourescens dalam waktu yang
lama maka patogen seperti Rhizoctonia solani tidak dapat melakukan penetrasi kedalam
tanaman.

Agensia pengendali hayati umumnya lebih efektif bila diaplikasikan sebagai

perlakuan preventif sebelum penyakit berkembang dan aplikasi lanjutan perlu dilakukan
untuk memperoleh penekanan penyakit yang dapat bertahan lama (Utkhede, 2005 dalam

Suryadi, Y., 2009) namun keefektifan agensia hayati dapat dipengaruhi oleh faktor
lingkungan, baik biotik maupun abiotik (Someya, et al, 2005).

Pemanfaatan agens hayati untuk mengendalikan patogen masih populer dan

sangat berpotensi. Teknik eksplorasi merupakan kegiatan mencari sumberdaya alam

agens hayati yang tersebar di alam. Pada prinsipnya dapat dilakukan untuk berbagai

agens hayati antara lain predator, parasitoid, patogen serangga maupun agens antagonis.

Penentuan suatu agens hayati yang berpotensi dalam mengendalikan patogen tanaman

tidak terjadi dengan sendirinya. Agens hayati yang ada dan sudah terbukti mampu

mengendalikan patogen tanaman diperoleh dengan melalui proses yang panjang.

Menurut Supriadi (2006), diantara kelompok agens hayati, Pseudomonas flourescens dan
Trichoderma spp menempati urutan teratas paling banyak digunakan dan diteliti.

Banyak penelitian yang membuktikan bahwa bakteri rhizosfer yang termasuk

dalam kelompok Pseudomonas flourescens dapat menekan pertumbuhan patogen

tumbuhan baik jamur maupun bakteri, disamping itu ada juga yang menghasilkan zat
tumbuh atau mengimbas tanaman sehingga tahan terhadap patogen tertentu. Koloni
bakteri yang mudah dikenali dan cepat tumbuh dalam waktu singkat pada media buatan
sederhana menjadikan kelompok bakteri ini banyak diteliti.

Berdasarkan hal tersebut maka Laboratorium PHP Banyumas tahun anggaran

2011 melaksanakan kegiatan eksplorasi guna memperoleh bakteri Pseudomonas dari

lapang dengan teknik dan perlakuan yang sederhana, serta mengembangkan sebagai
biakan murni dalam media cair di tingkat laboratorium yang siap aplikasi.

B. Tujuan
Kegiatan eksplorasi agens hayati bertujuan untuk mendapatkan bahan

pengendali OPT yang berwawasan lingkungan dan dapat dimanfaatkan untuk

mengendalikan OPT di tingkat lapangan
C. Keluaran
Tersedianya bahan pengendali OPT berupa agens hayati yang berwawasan

lingkungan dan dapat dimanfaatkan untuk mengendalikan OPT di tingkat lapangan

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Bakteri Pseudomonas spp.

Pseudomonas merupakan salah satu genus dari Famili Pseudomonadaceae.

Bakteri ini berbentuk batang lurus atau lengkung, ukuran tiap sel bakteri 0.5-0.1 1m x

1.5- 4.0 m, tidak membentuk spora dan bereaksi negatif terhadap pewarnaan Gram,

aerob, menggunakan H2 atau karbon sebagai energinya, kebanyakan tidak dapat tumbuh

dalam kondisi masam (pH 4,5) (Holt et al, 1994 dalam Ratna I, 2007). Adapun taksonomi

dari Pseudomonas flourescens sebagai berikut :

Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Class

: Gamma Proteobacteria

Family

: Pseudomonadaceae

Order

Genus

: Pseudomonadales

: Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas flourescens

(sumber: http://www.bacterio.cict.fr/classifphyla.html)
Pseudomonas flourescens termasuk kedalam bakteri yang dapat ditemukan

dimana saja (ubiquitous), seringkali ditemukan pada bagian tanaman (permukaan daun
dan akar) dan sisa tanaman yang membusuk, tanah dan air (Bradbury, 1986 dalam

Supriadi, 2006). Ciri yang mencolok dan mudah dilihat dari Pseudomonas flourescens
adalah kemampuannya menghasilkan pigmen pyoverdin dan atau fenazin pada medium
Kings B sehingga terlihat berpijar bila terkena sinar UV. Pseudomonas flourescens telah

dimanfaatkan sebagai agens hayati untuk beberapa jamur dan bakteri patogen tanaman.

Kemampuan Pseudomonas flourescens menekan populasi patogen diasosiasikan

dengan kemampuan untuk melindungi akar dari infeksi patogen tanah dengan cara
mengkolonisasi permukaan akar, menghasilkan senyawa kimia seperti antijamur dan
antibiotik serta kompetisi dalam penyerapan kation Fe (Supriadi, 2006). Beberapa hasil

penelitian menyatakan bahwa Pseudomonas flourescens dapat mengendalikan : penyakit

layu fusarium pada tanaman pisang (Djatnika I,2003); penyakit virus kuning pada

tanaman cabai (Yulmira Y, 2009); penyakit layu bakteri (Ralstonia solanacearum) pada
tanaman kacang tanah (Suryadi, Y, 2009)

Pseudomonas flourescens yang hidup didaerah perakaran tanaman dapat

berperan sebagai jasad renik pelarut fosfat, mengikat nitrogen dan menghasilkan zat

pengatur tumbuh bagi tanaman (Farvel, 1988 dalam Baharudin, dkk, 2005) sehingga

dengan kemampuan tersebut Pseudomonas flourescens dapat dimanfaatkan sebagai

pupuk biologis yang dapat menyediakan hara untuk pertumbuhan tanaman.

Pseudomonas flourescens juga berperan sebagai pemacu pertumbuhan (PGPR)

karena menghasilkan ZPT dan meningkatkan ketersediaan hara melalui produksi asam
organik (Linderman and Paulizt, 1985 dalam Yulmira, 2009).

B. Media biakan bakteri

Syarat mutlak yang harus dilakukan dan diperlukan untuk mempelajari

mikroorganisme adalah menumbuhkan mikroorganisme tersebut pada media buatan di

laboratorium. Untuk itu, kita perlu mengetahui bahan-bahan/zat-zat yang diperlukan

dan kondisi fisik yang diinginkan oleh setiap mikroorganisme. Khusus untuk bakteri

entomopatogen, media biakan bakteri tidak boleh menurunkan virulensinya untuk

menyerang pathogen. Setiap mikroorganisme mempunyai kebutuhan nutrisi yang

berbeda-beda, meskipun demikian kebanyakan bakteri tumbuh baik pada media dasar,

yaitu media yang terdiri dari: ekstrak daging (beef extract), NaCl, dan aquadest.
(Nursusilawati, 2010).

Penyediaan media biakan meliputi tahap pencampuran media ; pengaturan pH

media sampai batas optimum, umumnya bakteri mempunyai pH optimum 7,5 ; untuk

media cair, larutan dapat langsung disaring sedangkan untuk membuat media padat atau

setengah padat harus ditambah agar sesuai takaran yang diperlukan ; masukkan media

ke dalam tempat yang sesuai dengan keperluan misalnya tabung reaksi atau erlenmeyer

yang kemudian ditutup dengan kapas penyumbat ; kemudian disterilisasi yaitu cara

untuk membebaskan alat-alat atau media dari mikroorganisme. Prinsip sterilisasi adalah
membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme dengan cara mengubah
lingkungan, baik secara fisik maupun secara kimia.

Bakteri juga dapat dikembangkan pada media perbanyakan alternatif. Bakteri

menyukai media dengan kandungan protein tinggi. Menurut Misfit Putrina dan Fardedi
dalam penelitiannya menyebutkan bahwa air rendaman kedelai yang merupakan limbah
tahu dan air kelapa dapat dijadikan sebagai media perbanyakan bakteri Bacillus

thuringiensis yang merupakan bakteri entomopatogen Spodoptera litura karena media

tersebut dinilai lebih murah dan mudah untuk didapatkan daripada Nutrien Broth yang
mahal meskipun dalam perkembangannya Bt lebih cepat tumbuh di Nutrien Broth.

Perbanyakan bakteri skala industri biasanya menggunakan teknik fermentasi dengan

suatu alat yang disebut fermentor yang kemudian menghasilkan bakteri yang siap
dikemas dan dipasarkan.

III. HASIL PELAKSANAAN

A. Bahan dan Alat

Bahan dan alat yang digunakan dalam kegiatan ini, antara lain :

- Media Kings B

- Timbangan digital

- Daging keongmas

- Kapas

- Tanah disekitar perakaran tanaman putri malu

- Terasi

- Lampu Bunsen
- Sendok

- Panci

- Kantong plastik

- Tabung reaksi

- Tusuk gigi steril

- Erlenmeyer

- Centong

- Autoclave

- Jarum ose

- Cawan petri

- Jet sprayer

B. Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Kegiatan ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2011 di Laboratorium PHP

Banyumas

C. Tahap Pelaksanaan
1. Pengambilan sampel di lapang

Sampel yang digunakan pada percobaan ini adalah tanah disekitar perakaran

tanaman putri malu. Tanah sebanyak 100 g dimasukkan kedalam kantong plastik untuk
di bawa ke laboratorium.

2. Pembuatan media Kings B

Media Kings B adalah media pertumbuhan untuk bakteri kelompok

Pseudomonas flourescens, cara pembuatannya sebagai berikut :

a.

Timbang masing-masing bahan penyusun komposisi media Kings B:

- Proteose pepton

: 20 g

- Gliserol
- K2HPO4

: 1,5 g

- Agar

: 15 g

- MgSO4.7H2O

b.
c.

d.
e.
3.

: 10 ml

- Aquades

: 1,5 g
: 1 liter

Rebus bahan-bahan tersebut dalam panci selama kurang lebih 20 menit

Setelah homogen, angkat panci dan pindahkan media kedalam erlenmeyer dan

cawan petri

Sterilkan erlenmeyer dan cawan petri berisi media kings b dengan

menggunakan autoklaf (1200C selama 20 menit)

Inkubasi selama 2 hari, jika tidak terkontaminasi maka media siap digunakan

Isolasi sampel di laboratorium

a.

Timbang tanah rhizosfer dan ambil sebanyak 10 gr, masukkan kedalam

b.

Erlenmeyer tersebut digojok selama 30 menit menggunakan shaker, kemudian

c.

Dari seri pengenceran tersebut, ambil 0,1 ml kemudian tumbuhkan dalam

d.

Inkubasi selama 48 jam pada suhu ruang.

e.

erlenmeyer ukuran 250 ml yang berisi 90 ml air steril.

diamkan selama 10 menit dan dilanjutkan dengan pengenceran berseri.

cawan petri yang berisi media kings b.

Murnikan koloni bakteri yang tumbuh khususnya koloni yang berpendar yang

diduga sebagai Pseudomonas. Jika koloni diletakkan di bawah sinar UV maka

amati apakah berpendar atau tidak, bakteri dengan sifat flourescens akan
berpendar hijau kekuningan.

4.

Perbanyakan bakteri Pseudomonas

Setelah

biakan

murni

Pseudomonas

diperoleh,

dapat

dicoba

untuk

dikembangkan dalam media perbanyakan sehingga bakteri Pseudomonas siap untuk

digunakan di tingkat lapang.

Bahan yang digunakan sebagai media, antara lain :

-

Daging keongmas 400 g,

Air 1 liter

Terasi 2 g

Cara pembuatannya :
-

Didihkan air dalam panci

Masukkan potongan daging keongmas dan terasi kedalam air rebusan

Air saringan dalam keadaan panas langsung dimasukkan kedalam wadah /

Masukkan biakan murni Pseudomonas kedalam jerigen, kocok sesering

Rebus selama 20 menit kemudian saring

jerigen, biarkan hingga dingin

mungkin dan inkubasi selama 1 minggu (jangan terkena sinar matahari).

Pengocokan bertujuan untuk agar sel-sel bakteri lepas dan tumbuh

Bakteri Pesudomonas dalam media cair telah siap digunakan

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Tahap eksplorasi sederhana guna memperoleh bakteri entomopatogen

Pseudomonas telah dilaksanakan dan secara laboratories dikembangkan pada media

perbanyakan alternatif yang diduga mampu menjadi media tumbuh bagi bakteri
Pseudomonas.

Penggunaan tanah disekitar perakaran tanaman putri malu dikarenakan

mikroorganisme yang hidup pada daerah rhizosfer sangat sesuai digunakan sebagai agen
pengendali hayati karena rhizosfer merupakan daerah dimana akar tumbuhan terbuka
terhadap serangan patogen, dan tanaman putri malu merupakan kelompok tanaman

polong-polongan (leguminosa) dimana pada akarnya terdapat bintil yang berkembang

sebagai akibat penetrasi bakteri pengikat nitrogen (spesies rhizobium) sedangkan

rhizobium adalah salah satu contoh kelompok bakteri yang berkemampuan sebagai

penyedia unsur hara bagi tanaman khususnya nitrogen. Kelompok mikroba yang biasa

digunakan untuk pengendalian OPT secara alami adalah mikroba-mikroba yang

menambat N dari udara, melarutkan hara terutama P dan K dan merangsang

pertumbuhan. Hal ini yang menjadi dasar penggunaan rhizosfer tanaman putri malu
dalam percobaan ini.
A.

Isolasi sampel

Proses isolasi sampel yang dilaksanakan di laboratorium dapat dilihat pada

gambar dibawah ini :

A
B

Gambar 1. Bahan dan alat yang digunakan untuk isolasi sampel di laboratorium

Ket : (A) pipet millimeter, pengaduk, (B) media Kings B dalam cawan petri, (C) tanah
perakaran tanaman putri malu, (D) beaker glass, (E) air steril

C
B

Gambar 2. Tahap awal isolasi sampel

Ket : (A) tanah sebanyak 10 g dilarutkan dalam 90 ml air steril, (B) digojog menggunakan
shaker selama 30 menit, (C) didiamkan 10 menit sebelum dilakukan pengenceran
berseri.

Gambar 3. Teknik pengenceran berseri

Ket : (A) tiap beaker glass diisi dengan 90 ml air steril yang akan digunakan dalam
pengenceran berseri, (B) teknik pengenceran dilakukan dengan mengambil 0,1 ml
dari larutan menggunakan pipet millimeter

Gambar 4. Hasil pengenceran berseri

Ket : (A) larutan pada pengenceran terakhir yaitu pada seri ke-4 dan ke-5 ditumbuhkan
pada media Kings B dalam cawan petri kemudian di inkubasi selama 48 jam dalam

ruang kedap cahaya. (B) contoh massa bakteri yang tumbuh di media kings B setelah
diinkubasi.

Setelah tumbuh massa bakteri maka perlu dilakukan identifikasi secara

mikroskopik untuk mengetahui jenis bakteri yang tumbuh tersebut. Berdasarkan hasil

identifikasi diperoleh bahwa jenis bakteri identik dengan bakteri Pseudomonas

flourescens, hal ini diperkuat dengan gambar hasil identifikasi Pseudomonas flourescens
yang diambil dari situs : http://www.microbiologyatlas.kvl.dk sebagai pembanding.

B
1

Gambar 5. Hasil indentifikasi mikroskopik terhadap massa bakteri yang tumbuh

di media KingB

Ket : 1). Mikroskopisk billede (fasekontrast) der viser, at P. fluorescens

(http://www.microbiologyatlas.kvl.dk), 2). Hasil identifikasi mikroskopik dengan

perbesaran 1000x dari bakteri yang ditumbuhkan di media Kings B. Terdapat

persamaan dengan gambar disamping sehingga dugaan bakteri tersebut adalah

Pseudomonas flourescens sudah terarah.

(A,A) stadia awal pertumbuhan bakteri secara vegetatif, (B,B) kemudian bakteri

akan tumbuh dan memanjang, jika nutrisi mencukupi dan sesuai maka bakteri akan
terus tumbuh dan membelah sehingga populasi bakteri semakin banyak.

B. Pengembangan bakteri pada media perbanyakan alternatif

Setelah diperoleh hasil biakan murni dari bakteri Pseudomonas flourescens

kemudian dilakukan pengembangan bakteri dengan cara ditumbuhkan pada media

perbanyakan alternatif sehingga populasi bakteri bertambah dan siap digunakan di

tingkat lapang.

Media alternatif

yang digunakan adalah media yang mengandung protein

tinggi, hal ini didasarkan hasil wawancara dengan Prof. Ir. Loekas Soesanto, Msc, Phd

(dosen Fakultas Pertanian, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto) yang

mengatakan bahwa bakteri cenderung menyukai media dengan kandungan protein
tinggi, oleh karena itu penggunaan ekstrak daging sangat tepat.

Keongmas (Pomacea canaliculata) yang selama ini dikenal sebagai hama

tanaman padi sangat potensial untuk digunakan sebagai kandungan media alternatif

bagi bakteri. Daging keongmas mengandung omega 3, 6 dan 9 serta protein yang
berkisar 16 50%. Tingginya kandungan protein tersebut dapat dipertimbangkan

sebagai bahan baku pembuatan pepton yang merupakan sumber nitrogen utama dalam
media mikrobiologi untuk pertumbuhan bakteri.

Selain keongmas juga digunakan terasi sebagai penyusun komposisi media

perbanyakan bakteri. Terasi dari udang rebon cukup tinggi kandungan proteinnya,

protein pada udang termasuk protein lengkap karena memiliki semua asam amino
esensial sehingga semakin lengkap dan banyak jumlah komposisi asam amino esensial
maka semakin tinggi manfaat protein tersebut (anonim, 2009). Kandungan protein pada

udang rebon sekitar 59,4 g per 100 g sehingga protein mendominasi kandungan gizi
dalam terasi udang rebon (Direktorat Gizi Depkes, 1992)

Proses pembuatan media perbanyakan alternatif bakteri Pseudomonas

flourescens dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

Gambar 6. Bahan utama pembuatan media perbanyakan bakteri

Ket : (A) keongmas yang masih utuh beserta cangkangnya, (B) daging keongmas
yang sudah dipisahkan dari cangkangnya

Gambar 7. Proses pemasakan daging keongmas

Ket : (A) daging keongmas di potong hingga berukuran 2 x 2 cm, (B) masak media

dengan komposisi 1 liter air, 400 g daging keongmas dan 2 g terasi rebon selama 20
menit (insert : terasi rebon)

Gambar 8. Proses penyaringan dan inkubasi media

Ket : (A) Saring media dan dalam keadaan masih panas, masukkan media kedalam
botol tertutup, (B) Setelah dingin, media dalam botol diinokulasi dengan isolate

Pseudomonas flourescens dan dinkubasi dalam ruang kedap cahaya. Kocok botol
setiap hari agar bakteri dapat tumbuh dan berkembang

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. SIMPULAN
-

Tanah perakaran putri malu mengandung bakteri Pseudomonas flourescens

Media yang digunakan dalam isolasi sampel adalah media Kings B yang

yang bermanfaat bagi tanaman,

merupakan media yang tepat untuk pertumbuhan bakteri kelompok

Pseudomonas flourescens,

Perbanyakan populasi bakteri dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada

Bakteri Pseudomonas flourescens yang telah ditumbuhkan pada media alternatif

media alternatif yaitu media dengan kandungan protein tinggi,

perbanyakan membuat bakteri ini siap pakai dan mudah diaplikasikan serta
dapat disimpan lama sehingga dapat tersedia saat dibutuhkan.

B. SARAN
Setelah bakteri Pseudomonas flourescens diperoleh dari hasil eksplorasi

sebaiknya dilakukan beberapa teknik pengujian lain seperti uji bioassay terhadap

patogen dan uji skala green house, untuk menguatkan sifat dan kemampuan
Pseudomonas flourescens sebagai bakteri antagonis tanaman.

Diperlukan pengujian tingkat lapang terhadap kemampuan Pseudomonas

flourescens dalam menekan patogen tanaman, lebih baik bila secara multilokasi

sehingga pada akhirnya Pseudomonas flourescens dapat digunakan secara luas baik

lokasi maupun jenis tanaman.

DAFTAR PUSTAKA

Djatnika I. dkk., 2003. Peranan Pseudomonas flourescens MR 96 Pada Layu Fusarium

Tanaman Pisang. Dalam Jurnal Hortikultura 13 (3) : 212 218, 2003.

Hasanudin, MSc.,Dr., Ir., 2003. Peningkatan Peranan Mikroorganisme dalam Sistem

Pengendalian Penyakit Tumbuhan Secara Terpadu. Jurusan Hama dan Penyakit
Tumbuhan. Fakultas Pertanian. Universitas Sumatera Utara.

Hidayah N, SP., Teknik Eksplorasi Bakteri Kelompok Pseudomonas flourescens. Ditjenbun.

Departemen Pertanian. Diakses pada bulan Oktober 2011 di www.google.com.

Supriadi., 2006. Analisis Resiko Agens Hayati Untuk Pengendalian Patogen Pada
Tanaman. Dalam Jurnal Litbang Pertanian 25 (3), 2006.

Suryadi, Y., 2009. Efektifitas Pseudomonas flourescens Terhadap Layu Bakteri (Ralstonia

solanacearum) Pada Tanaman Kacang Tanah. Dalam Jurnal HPT Tropika. ISSN
1411-7525. Vol. 9 No. 2 ; 174 180, September ,2009.

www.cybermed.cbn.net.id., 2009. Udang Rebon Bikin Tulang Padat. Diakses pada bulan
November 2011.

Yulmira Y., 2009. Aplikasi Agens Hayati Pseudomonas flourescens Sebagai Penginduksi
Ketahanan untuk Meningkatkan Produksi Tanaman Cabai Terhadap Penyakit
Virus Kuning di Kecamatan Kuraji, Kotamadya Padang. Dalam Warta Pengabdian
Andalas Vol. 15 No. 22, 2009.