HPLC

High Performance Liquid Chromatograpy (HPLC)

High Performance Liquid Chromatography atau HPLC atau biasa juga disebut dengan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan yang diterima
secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri
makanan. Kegunaan umum HPLC antara lain: pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawasenyawa tidak mudah menguap (non-volatil); penentuan molekul-molekul netral, ionik,
maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa dalam
jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri
(Gandjar dan Rohman, 2008). Metode HPLC mempunyai kemajuan dalam teknologi kolom,
sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif. Dengan teknologi ini, kromatografi
cair dapat menghasilkan pemisahan yang cepat dalam banyak hal, dengan keunggulan zat-zat
yang tidak menguap atau tidak tahan panas dapat dikromatografi tanpa penguraian atau tanpa
perlu membuat derivat yang dapat menguap (Depkes RI, 1995).

HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif maupun kuantitatif. Keterbatasan metode HPLC adalah untuk identifikasi senyawa,
kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Keterbatasan lainnya
adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Gandjar dan
Rohman, 2008).
Cara Kerja HPLC

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: (1) wadah
fase gerak, (2) sistem penghantaran fase gerak, (3) alat untuk memasukkan sampel, (4)
kolom, (5) detektor, (6) wadah penampung buangan fase gerak, (7) tabung penghubung, dan
(8) suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar dan Rohman, 2008).
Mekanisme kromatografi terdiri atas 4 tipe yaitu adsorpsi, partisi, penukar ion, dan
eksklusi ukuran. Kromatografi adsorpsi didasarkan pada kondisi antara zat terlarut dan fase
diam padat. Umumnya eluen yang digunakan untuk kromatografi adsorpsi kurang polar dari
fase diam (fase normal). Kromatografi partisi melibatkan fase diam cair yang bercampur
dengan eluen. Sistem partisi dapat berupa fase normal (fase diam lebih polar daripada eluen)
atau kromatografi fase terbalik (fase diam kurang polar daripada eluen). Kromatografi
penukar ion melibatkan fase diam padat dengan kelompok anionic atau kationik pada
permukaan zat yang terlarut. Kromatografi eksklusi ukuran melibatkan fase diam cair dengan
ukuran pori yang terkontrol. Pemisahan dilakukan berdasarkan ukuran molekul suatu zat,
dimana molekul berukuan besar akan mengalami elusi terlebih dahulu (Moffat dkk, 2011).
Wadah Fase Gerak pada HPLC
Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus
dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis. Pada saat pembuatan pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan
untuk menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang tinggi, dan lebih

terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk HPLC berderajat HPLC (HPLC
grade). Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada system
kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung
yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung
tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikel-partikel kecil ini (Gandjar dan Rohman, 2008).
Fase Gerak Pada HPLC
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponenkomponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar dari pada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase
terbalik (fase diam kurang polar dari pada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarutpelarut jenis alkohol (Gandjar dan Rohman, 2008).
Pompa pada HPLC
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa
yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau

sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan (Gandjar dan
Rohman, 2008).
Penyuntikan Sampel pada HPLC
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fae gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup Teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.
Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase
gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi
penyuntikan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntik ini mudah
digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada HPLC (Gandjar
dan Rohman, 2008).
Kolom pada HPLC
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional
yakni:
a.

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100
L/menit)

b.

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrofotometer massa

c.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Tabel Perbandingan antara kolom HPLC konvensional dan kolom mikrobor (Kealey dan Haines,
2002)
Parameter
Tabung kolom

Kolom Konvensional
Stainless steel

Kolom Mikrobor
Stainless steel

Panjang 3, 10, 15, 20 dan Panjang 25 dan 50 cm

Fase diam

25 cm.

Diameter luar 0,25 inci

Diameter luar 0,25 inci

Diameter dalam 1 atau 2 mm

Diameter dalam 4,6 mm.

Porous, silika ukuran Porous, silika ukuran kecil, silika
kecil,

silika

yang yang dimodifikasi secara kimiawi

dimodifikasi

secara (bonded phase), atau polimer-

kimiawi (bonded phase), polimer stiren/divinil benzene.

atau

polimer-polimer Rata-rata diameter partikel 3,5

stiren/ divinil benzene.

atau 10 m dengan kisaran ukuran

Rata-rata diameter 3,5 partikel yang sempit.

atau

10

dengan

Tekanan

kisaran sempit.
500-3000 psi

operasional
Fase gerak

(35-215 bar)
(70-350 bar)
Hidrokarbon + pelarut- Hidrokarbon

1000-5000 psi
+

pelarut-pelarut

pelarut terklorinasi atau terklorinasi atau alkohol untuk

alcohol

untuk

fase fase normal. Untuk fase terbalik

normal.

Untuk

fase (reversed

phase)

digunakan

terbalik (reversed phase) metanol atau asetonitril + air atau

digunakan metanol atau buffer.
asetonitril
buffer.

air

atau Kecepatan alir: 10-100 L/menit.

Modifikasi instrument

Kecepatan

alir:

1-3 Sistem penghantaran pelarut yang

mL/menit

mampu memberikan control aliran

dibawah 10 L/menit.
Katup injeksi sampel bervolume

Kinerja

kecil; sel detektor bervolume kecil

meningkat Sangat efisien dan sensitif, akan

Efisiensi
dengan
ukuran

berkurangnya tetapi lambat.

partikel

fase Konsumsi fase gerak hanya dari

diam, akan tetapi umur kolom konvensional

kolom
partikel

dengan
3

ukuran
lebih

pendek.
Meskipun demikian, dalam prakteknya kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional
dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin (Gandjar dan Rohman, 2008).
Fase Diam pada HPLC
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silika
adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Oktadesil silika
(ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau
rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak
dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi
disebabkan adanya kandungan air yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2008).
Tabel Berbagai fase diam silika dan alumina yang beredar di pasaran (Munson, 1981)

Luas
Diameter ukuran
Jenis

Nama

permukaan
partikel (m)

Silika

Alumina

Bentuk

-Porasil
Lichrosorb-Si-60
Partisil
Micro Pak Si
Sil-X-1
Porasil C
Vydac HS
Hypersil
Nucleosil 50
Sorbax Sil
Spherisorb
Lichrosorb ALOX
Micro Pal AL
Spherisorb AY

partikel

10
Tak teratur
5,10
Tak teratur
5,10,20
Tak teratur
5,10
Tak teratur
13 5
Tak teratur
37-75
Bundar
5,10,15,20
Bundar
5-7
Bundar
5,10
Bundar
6-8
Bundar
5,10
Bundar
5,10
Tak teratur
5,10,20
Tak teratur
5,10,20
Bundar

(m2/g)00
300
500
400
400
400
50-100
300
200
500
300
220
70
70
95

Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu : detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif); dan
golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif.
Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut (Gandjar dan Rohman, 2008):
a.

Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel

b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi

c.

Stabil dalam pengoperasiannya

d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
e.

Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solute pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier)

f.

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Komputer, Integrator, atau Rekorder