Anda di halaman 1dari 21

1.

Laboratorium Kultur Jaringan


Fasilitas ruang laboratorium kultur jaringan anggrek secara sederhana dibagi
menjadi beberapa bagian, masing-masing mempunyai fungsi yang berbeda. Laboratorium
Kultur jaringan harus dirancang secara khusus, karena ada bagian atau ruang yang harus
dalam suasana steril atau bebas mikroba.
Ruang laboratorium kultur jaringan anggek secara sederhana dikelompokan
menurut kegiatanya yaitu :
1.1.

Ruang Tidak Steril


a. Ruang Tamu
Dalam laborsatorium kultur jaringan sebaiknya di lengkapi dengan ruang

tamu, karena biasanya laboratorium kultur jaringan selalu di datangi tamu baik tamu yang
ingin melihat sarana dan suasana laboratorium maupun tamu ingin membeli hasil biakan
kultur jaringan.
b. Ruang Administrasi
Segala surat-menyurat tentang pembelian alat-alatlboratorium, pembelian
media kultur jringan, penjualan bibit-bibit hasil biakan kultur jaringan, dan transaksitransaksi ataupun perjanjian-perjanjian kerja sama tentang penelitian dilaksanakan di dalam
ruangan administrasi.
c. Ruang Staf
Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf peneliti dalam jumlah banyak,
tujuan nya adalah agar dapat di adakan pembagian kerja sesuai dengan spesialisasi
nya masing-masing. Di dalam ruang staf ini dapat pula di lakasanakan diskusi antar staf pada
waktu berkumpul bersama.
d. Kamar Mandi dan WC
Ruang

kultur

jaringan

harus

dalam

suasana

bersih

untuk

menghindari kontaminasi oleh mikroba. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau
ruang inkubator, tubuh dan pakaiannya harus bersih, tidak berkeringat dan tidak berdebu.
Untuk inilah kamar mandi dan wc perlu diadakan.
e. Ruang Ganti Pakaian

Untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba, maka para karyawan


di dalam laboratorium kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih, dalam arti baru di
cuci. Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di adakan ruang ganti pakaian.
f. Ruang Penyimpanan Bahan Kimia
Komponen bahan kimia penyusun media kultur jaringan sangat banyak
macamna. Oleh karena itu, penyimpanannya memerlukan pengaturn yang khusus supaya
mudah mecarinya. Penyimpanan yang tidak teratur akan mempelambat dalam pekerjaan,
misalnya dalam mencari salah sau komponen media saja membutuhkan waktu yang lama.
Bahan kimia yang mahal harganya seperti hormon tumbuh dan enzim untuk
isolasi protoplas harus disimpan dala ruangan yang sejuk.
g. Ruang Penyimpanan Alat-Alat Gelas
Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer, gelas ukurdan alat gelas lainnya perlu
disimpan dalam almari tersendiri.
a. Ruang Preparasi
Diruang ini disediakan peralatan dan tempat untuk mencuci alat-alat
laboratorium yang akan digunakan. Diruangan ini juga bisa dipakai untuk mempersiapkan
membuat media kultur jaringan dan mensterilkan media kultur jaringan dengan menggunakan
autoklaf bakar atau listrik. Peralatan yang ada antara lain keranjang-keranjang plastik untuk
tempat peralatan yang baru dicuci.
b. Ruang Penimbangan dan Sterilisasi
Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam bentuk kemasan dengan
harga yang relatif mahal. Oleh karena itu, staf labolatorium lebih senang meramu sendiri
medum tanam yang dibutuhkannya.dengan demikian dibutuhkan lat untuk menimbang semua
komponen bahan kimia tersebut. Misalnya menimbang bahan kimia makro dan mikro.
c. Rumah Kaca (Green House)
Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan sekeliling dinding bagian
atasnya terbuat dari kaca. Tujuan penyediaan rumah kaca adalah untuk tempat meletakkan
pot-pot bibit tanaman, baik bibit yang akan dijadikan bahan kultur jarinang maupun bibit
hasil dari kultur jaringan yang sudah siap djual atau dipelihara sendiri (Andini. 2001).

1.2.

Ruang Tidak Mutlak Steril


a. Ruang Planlet

Ruang planlet untuk eksplan biasanya berisi botol botol bibit dari berbagai
varietas dan hasil silangan. Oleh karena itu dalam ruangan ini harus disediakan rak-rak botol
bertingkat untuk meletakan botol secara teratur. Kebutuhan sinar untuk pertumbuhan planlet
bisa memanfaatkan bias matahari, terutama matahari pagi. Bila sinar terlalu banyak bisa
dikurangi dengan shading net atau paranet. Ruangan ini menggunakan alat pendingi (AC),
maka

temperatur

ruangan

dapat

mencapai

sekitar

25OC

sehingga

ideal

bagi

pertumbuhan planlet. Botol-botol yang berisi planlet jumlahnya dapat mencapai ratusan. Oleh
sebab itu, dalam ruangan ini perlu disediakan rak-rak alumuniaum yang dasrnya berlobanglobang untuk meletakkan botol-botol tersebut secara teratur dan rapi.
b. Ruang Inkubator

Untuk mempercepat pertumbuhan eksplan yang sudah ditanam atau


menumbuhkan biji anggrek di media kultur jaringan dibutuhkan ruang steril dengan
pendingin AC dengan suhu 25 C dan harus dilengkapi dengan lampu-lampu neon
karena eksplan yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi membutuhkan temperatru dan
cahaya yang dapat diatur dan disesuaikan dengan jenis eksplannya. Untuk menghemat
tempat, ruang inkubator ini dapat dilengkapi dengan rak alumunium atau rak kayu bertingkat
yang alasnya berlobang supaya aerasi dapat berjalan dengan baik. Setiap rak dilengkapi
dengan day-light neon Lamp 20 watt yang jaraknya 40 60 cm diatas permukaan tutup botol.
Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur jringan perlu dipantau pertumbuhannya
setiap hari. Untuk pemantauan ini perlu ruangan khusus yang keadaannya lebih steril dari
ruang planlet, yaitu ruang incubator (Gunawan. 1992).

c. Ruang Shaker dan Entkas

Eksplan yang sudah keluar kalus di ruang inkubator dapat diperlakukan


suspensi sel, yaitu menumbuhkan suatu eksplan atau kalus dengan menggunakan media cair,
kemudian digojok diatas shaker. Pertumbuhan kalus atau plb pada anggrek membutuhkan
temperature 25 C dan sinar yang cukup, maka ruang shaker dan entkas harus ada pendingin
dan lampu neon. Entkas dan Laminaer air flow sering juga diletakan satu ruangan dengan
shaker. Dalam laboratorium sederhana biasanya diperlukan entkas sebanyak 4 buah.
Eksplan

yang

baru

ditanam dan

diinkubasikan

dalam

ruang

inkubator

akan

menghasilkan kalus. Bila kalus ini cukup umur, maka dapat diperlukan suspensi sel, yaitu
menumbuhkan suatu eksplan atau kalusdengan menggunakan media cair (media yang tidak
menggunakan zat pemadat atau agar), kemudian digojok di atas shaker.
Hasil pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam istilah
asing disebut plb (protocorm like bodies). Bentuk protocormusadalah bulat-bulat padat dan
berwarna hijau. Bila keadaanprotocormus sudah keadaan demikian maka sudah siap
dipindahkan kedalam media padat untuk di tumbuhkan menjadi planlet.
Entkas juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker, kegunaan
enkas ini sama dengan Laminar Air Flow Cabinet, yaitu untuk menabur eksplan.

1.3.

Ruang Mutlak Steril


Yang dimaksud ruang steril disini adalah ruangan yang bersih dan bebas dari

debu. Supaya ruangan ini tidak berdebu maka ruangan ini harus dilengkapi dengan pendingin
ruangan (AC). Ruang penabur biasanya di buat dengan ukuran yang tidak terlalu besar, yaitu

2x3 m2. tujuannya adalah agar pelaksanaan sterilisasi ruangannya tidak membutuhkan waktu
yang lama dan tidak mengalami kesulitan.
Dinding ruang penabur dilengkapi dengan porselin, sehingga sterilisasi mudah
dilakukan. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 96% dengan
hand-sprayer. Sedangkan sterilisasi lantai dengan menggunakan kain pel yang dibasahi
alkohol 96%. Sterilisasi ini mutlak harus dilakukan menjelang ruang penabur akan
digunakan.
Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan, lampu ultra violet harus
dimatkan terlebih dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur
diperbolehkan memasuki ruangan tersebut. Sebaiknya, pada saat akan keluar lampu neon di
matikan dan setelah keluar menutup daun pintu kembali lampu ultra violet dinyalakan.
Dengan demikian steril ruangan dapat dijamin.
2. Alat-alat Laboratorium Kultur Jaringan
a. Laminar Air Flow Cabinet

Alat ini letaknya diruang penabur, yaitu ruang yang selalu harus dalam
keadaan steril. alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman.

b. Entkas

Merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC), maka fungsinya pun sama
seperti (LAFC).

c. Rotating Shaker (Penggojok)

Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita.
Penggojok ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan kalus pada eksplan anggrek
atau untuk membentuk protokormus atau sering disebut PLB (protocorm like bodies) dari
kalus bermacam jaringan tanaman.
d. Autoklaf

Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jarinang tanaman.
e. Timbangan Analitik

Jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah timbanagn yaang
dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat keil. Alat ini berfungsi
sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan.
f. Stirer

Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan menggunakan


listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai penggojok.
g. Centrifuge

h. Erlenmeyer

Alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana menuangkan
air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan.
i. Gelas Ukur

Gelas ukur digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan
digunakan.
j. Gelas Piala

Alat ini digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air
suling dalam pembuatan medium.

k. Petridish

Alat ini merupakan semacam jenis gelas piala yang mutlak dibutuhkan dalam
kultur jaringan.
l. Jarum Injeksi

m. Pipet

n. Pengaduk

o. Pinset dan Skalpel

Pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk
menanam eksplan.
p. Lampu Spiritus

Digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar
air flow cabinet atau di dalam enkas pada kita mengerjakan penanaman atau sub-culture.
q. Boks Alkohol

r. Sprayer

s. Tabung Reaksi

Alat ini digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas.

3. Media Tanam Kultur Jaringan


3.1. Unsur-unsur yang Dibutuhkan Tanaman
Sebelum menguraikan cara-cara membuat medium kultur jaringan, maka terlebih
dahulu kita harus mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman.
Unsur-unsur yang dibuthkan tanaman dikelompokkan menjadi:
1. Garam-garam Anorganik
Setiap tanaman membutuhkan paling sedikit 16 unsur untuk pertumbuhannya
yang normal. Tiga unsur di antaranya adalah C,H,O yang di ambil dari udara, sedangkan 13
unsur yang lain berupa pupuk yang dapat diberikan melalui akar atau melalui daun. Pada
perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Semua unsur tersebut dibutuhkan oleh tanaman
untuk pertumbuhannya. Ada unsur yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah besar yang
disebut unsur makro, ada pula yang dibutuhkan oleh tanaman dalam jumlah sedikit tetapi
harus tersedia yang disebut unsur mikro.
2. Zat-zat Organik
Zat-zat organik yang biasanya ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah
sukrosa, mio inositol, asam amino, dan zat pengatur tumbuh. Sedangkan sebagai tambahan
biasanya diberi zat organik lain seperti air kelapa, ekstrak ragi, pisang, tomat, toge dan lainlain.
3.2. Kegunaan Setiap Unsur Bagi Tanaman
Setelah kita mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan oleh tanaman, maka
sebelum kita menentukan unsur-unsur yang akan digunakan untuk meramu medium kultur
jaringan perlu mengetahui terlebih dahulu kegunaan unsur-unsur tersebut bagi pertumbuhan
tanaman atau jaringan tanaman.
1. Unsur Nitrogen (N)

Kegunaan unsur Nitrogen bagi tanaman adalah untuk menyuburkan tanaman,


sebab unsur N dapat membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik yang
lain.
2. Unsur Fospor (P)
Dibutuhkan oleh tanaman untuk membentuk karbohidrat. Maka, unsur P ini
dibutuhkan secara besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih.
3. Unsur Kalium (K)
Memperkuat untuk tubuh tanaman, karena unsur ini dapat digunakan untuk
memperkuat serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan buah tidak mudah gugur.
4. Unsur Sulpur (S)
Unsur ini digunakan untuk proses pembentukan anakan sehingga pertumbuhan
dan ketahanan tanaman terjamin.

5. Unsur Kalsium (Ca)


Digunakan untuk merangsang pembentukkan bulu-bulu akar, mengeraskan
batang dan merangsang pembentukkan biji.
6. Unsur Magnesium (Mg)
Digunakan tanaman sebagai bahan mentah untuk ppembentukkan sejumlah
protein.
7. Unsur Besi (Fe)
Unsur ini digunakan sebagai penyangga (chelati agint) yang sangat penting untuk
menyagga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.
8. Unsur Sukrosa
Unsur ini sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi
yang diperlukan untuk induksi kalus (Harianto. 2009).

9. Unsur Glukosa atau Fruktosa


Unsur ini dapat digunakan sebagai unsur pengganti sukrosa karena dapat
merangsang beberapa jaringan.
10. Unsur Mio-inositol
Penambahan unsur ini pada medium bertujuan untuk membantu diferensiasi dan
pertumbuhan sejumlah jaringan.
11. Unsur Vitamin
Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam mediumklutur jaringan antara lain
adalah Thiamin. Thiamin adalah vitamin esensial yang digunakan untuk medium kultur
jaringan (Rahardja. 1988).
12. Unsur Asam Amino
Unsur ini diunakan oleh tanaman untuk proses pertumbuhan dan diferensiasi sel.
Kebutuhan unsur asam amino oleh tanaman berbeda.
13. Unsur Zat Pengatur Tumbuh.
Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senywa organik bukan hara, yang
dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi
tumbuhan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman terdir dari lima kelompok yaitu, Auksin,
Sitokinin, Giberelin, Etilen dan Inhibitor dengan ciri khas dan pengaruh yang berlainan
terhadap proses fisiologis.
Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi
pertumbuhan dan diferensiasi. Tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium,
pertumbuhan sangat terhambat bahkan tidak akan tumbuh sama sekali.
3.3. Bentuk Fisik Media Tanam
Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin
pertumbuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber
unsur makro dan unsur mikro, gula , vitamin, protein, dan hormon tumbuh. media tanam
dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat

berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti campuran-campuran zat kimia dengan air
suling, sedangkan media padat adalah media zat cair tesebut ditambah dengan zat pemadat
agar.
3.4. Faktor Lingkungan
1. Keasaman (pH)
Keasaman pH adalah nilai derazat keasaman atau kebasaan dari larutan dalam air.
Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H dalam larutan. Nilai di dalam pH
berkisar antara 0 (sangat asam) sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk netral adalah pH pada
7.
Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai
toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0-6,0. Bila eksplan mulai
tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman umumnya akan naik apabila nutrein
habis terpakai.
Pengukuran pH dapat dilakukan dengan menggunakan pH meter, atau bila
menginginkan yang lebih praktis dan murah dapat digunakan kertas pH. Bila ternyata pH
medium masih kurang normal, maka dapat ditambah KOH 1-2 tetes. Sedangkan apabila pH
melampaui batas normal dinetralkan dengan penambahan HCL.
2. Kelembapan
Kelembapan relatif (RH) lingkungan biasanya mendekati 100%. RH sekeliling
kultur mempengaruhi pola pengembangan. Jadi, pengaturan RH pada keadaan tertentu
memerlukan suatu bentuk diferensiasi Khusus.
3. Cahaya
Intensitas

cahaya

yang

rendah

dapat

mempertinggi

embriogenesis dan organogenesis. Cahaya ultra violet dapat mendorong pertumbuhan dan
pembentukan tunas dari kalus tembakau pada intesitas yang rendah.
4. Temperatur

Temperatur yang dibutuhkan untuk dapat terjadi pertumbuhan yang optimum


umumnya adalah berkisar di antara 200-300C. Sedangkan temperatur yang optimum untuk
pertumbuhan kalus endosperm adalah sekitas 250C.
3.5. Pembuatan Media Tanam
Sebelum membuat medium, maka terlebi dahulu kita harus menentukan medium
apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat
digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalnya
mediaVacin Went sangat baik untuk media tumbuh anggrek. Tetapi tidak cocok untuk media
tumbuh lain. Untuk eksplan dair tanaman keras sring menggunakan medium WPM,
sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium
MS. Medium Kundson C cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek.
Untuk membuat media kultur jaringan, biasanya menimbang setiap komponen
bahan kimia yang terdapat pada resep medium dasar. Langkah ini kurang praktis karena
memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu, timbangan yang digunakan
untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Kendala ini
dapat diatasi dengan membuat larutan stoc terlebih dahulu, kecuali untuk unsur makronya.
Jadi perlu membuat larutan stoc mikro.
4. Metode Pelaksanaan Kultur Jaringan
4.1. Metode Kultur Jaringan
1. Dilihat dari Macam Media Tanam
Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu:
a. Metode Padat (Solid Method)
Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan
medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat
tumbuh menjadiplanlet. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen
kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat
pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-

agar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur
jaringan.
Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit
untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan
kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam.
Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus, karena tempat
area kalus yaitu pada irisan (jaringan yang luka) tertutup oleh medium. Metode padat dapat
digunakan untuk metode kloning, untuk menumbuhkan protoplas stelah diisolasikan, untuk
menumbuhkan planlet dari protokormus setelah dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk
menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan).
b. Metode Cair(Liquid Metho)
Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat,
karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga
keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. Oleh
karena itu, penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk
menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh
menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat yang sesuai.
Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita tidak p
erlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan zat
pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein.
2. Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai
Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan, maka metode kultur jaringan yang
telah dikenal sekarang antara lain adalah:
1) Kultur meristem
2) Kultur antera
3) Kultru endosperma
4) Kultur suspensi sel

5) Kultur protoplas
6) Kultur embrio
7) Kultur spora
8) Dan lain-lain
3. Dilihat dari Cara Pemeliharaan
Eksplan yang telah ditanam, agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian
menjadi planlet,

membutuhkan

pemeliharaan

yang

rutin

dan

tepat.

Artinya, eksplan atau kalus yang sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam
yang baru harus segera dilaksanakan, tidak boleh sampai terlambat. Pemindahan yang
terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat
mengalami brownig atau terkontaminasi oleh jamur atau bakteri.

4.2. Pelaksanaan Kultur Jaringan


1. Sterilisasi Alat Penabur
Sebelum digunakan, enkas harus diterilisasi dengan menggunakan hand sprayer
berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70%, dengan perbandinga 1:1. setelah
disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih 10 menit, baru kemudian boleh
digunakan.
2. Sterilisasi Alat dan Medium
Alat-alat dissecting set dan glass ware yang akan digunakan untuk kultur
jaringan, setelah dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan
disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121 oC, tekanan 15 lb, dan lama sterilsiasi 20-30
menit.

Botol-botol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan alumunium
foil, kemudian disterilisasi. Sterilisasi medium lebih sedikit waktunya dibandingkan dengan
sterilisasi alat-alat, yakni 15 menit, tetapi suhu dan tekannya sama (Indrianto. 2002).
3. Sterilisasi Eksplan
Sterilisasi eksplan dilaksanakan dengan dua cara yaitu:
a. Sterilisasi Eksplan secara Mekanis
Cara ini digunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan
membakar eksplan tersebut di atas lampu spirtus sebanyak tiga kali.
b. Sterilisasi Eksplan secara Kimiawi
Sterilisasi ini gunakan untuk eksplan yang lunak. Sterilisasi ini menggunakan
bahan kimia. Bahan-bahan yang digunakan untuk sterilisasi:
1. Sodium hipoklorit

2. Mercuri chlorit

3. Alkohol 70%

4. Menabur Eksplan
Menabur eksplan dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan kondisi
aseptik. Sebelum kita bekerja di dalam laminar air flow cabinet, semua perhiasan tangan
harus dilepas, dan tangan dibasuh terlebih dahulu dengan alkohol 70%.
Eksplan yang siap ditaman dipotng dengan menggunakan scalpel di dlam cawan
petri. Potongan eksplan dimasukan kedalam erlenmeyer yang berisi media tumbuh, hingga
permukaan yang teriris bersentuhan dengan medium. Setelah semua pekerjaan menabur
selesai, kemudian alat-alat yang sudah dipakai dibersihkan.
5. Melaksanakan Sub-Kultur

Dalam

waktu

satu

sampai

dua

minggu, eksplan akan

tumbuh

menjadikalus. Kalus adalah suatu masa sel yang terbentuk pada permukaan eksplan atau
irisan eksplan. Kalus ini akan tumbuh pada mediaeksplan yang padat., sedangkan pada media
cair akan tumbuh plb (protokormus). Sub-kultur adalah suatu usaha untuk mengganti media
kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk kalus atau
protokormus dapat terpenuhi.
6. Masalah-masalah Dalam Kultur Jaringan
Dalam kegiatan kultur jaringan, tidak sedikit masalah-masalah yang muncul
sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur
yang dilakukan. Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari bahan yang ditanam, dari
lingkungan kultur, maupun dari manusianya.
Permasalahan dalam kultur ada yang dapat diprediksi sebelumnya dan ada pula
yang sulit diprediksi kejadiannya. Untuk yang tidak dapat diprediksi, car mengatasinya tidak
dapat secara preventif tetapi diselesaikan setelah kasus itu muncul.

Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu :


1) Kontaminasi
Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur
jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu
yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya. Fenomena kontaminasi
sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri, jamur,
virus, dll).
Upaya mencegah terjadinya kontaminsai :

Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan.


Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.

Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang
longgar.

2) Pencoklatan/browning
Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang
sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa
pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi.
Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak
jarang berakhir pada kematian eksplan.
3) Vitrifikasi
Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan:

Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal.


Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil.
Pertrumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter.
Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent.
Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade..

4) Variabilitas Genetik
Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam
dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upayapemuliaan tanaman maka variasi
genetik adalah kendala.
Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena:

Laju multiflikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang

yang tidak terkontrol


Penggunaan teknik yang tidak sesuai.

Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalusdan kultur suspensi
sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifatinstabilitas kromosom mungkin akibat teknis
kultur, media atau hormon.
Cara mengatasi problem variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus
memperhatikan aspek yang dikulturkan.
5) Pertumbuhan dan Perkembangan
Problem utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang
ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi
tidak tumbuh.
Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan
tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan eksplan akan
dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel tua yang muda
kembali. Media juga dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari
kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan
pembesaran dirinya. Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan
pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari sel-sel
kalus. Terjadinyaembrio somatik dapat secara endogen atau eksogen.
6) Praperlakuan
Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja,
pertumbuahn dan perkembangannya dalam botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh
persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan
prapelakuaan tidak dilakukan.
Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum
adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis,
fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan
senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif pengelolaannya (Pramono.
2007).
7) Lingkungan Mikro

Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering
menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan eksplan,
suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan
pada eksplan. Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda,
namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu
ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan dengan
bagian ruangan yang lainnya. Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama
antara kultur yang satu dengan kultur yang lain (Kusuma. 2000).