Anda di halaman 1dari 12

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN GRAM

Kamis, 5 Maret 2015


Kamis, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama

NPM

Vikneswaran Mutayah

260110132004

LABORATORIUM

MIKROBIOLOGI

FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015

Nilai

TTD

PEWARNAAN SEDERHANA/TUNGGAL

I.

TUJUAN
Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri,
dengan menggunakan satu macam zat pewarna.

II.

PRINSIP
1. Teknik aseptis
Teknik aseptis memiliki beberapa macam sterilisasi, yaitu
sterilisasi mekanik, sterilisasi fisik dan sterilisasi kimia. Setiap
macam tersebut memiliki prinsip kerja yang berbeda sesuai dengan
keadaan media yang akan disterilisasikan. Apabila dalam
melakukan penelitian maupun percobaan tidak dilakukan teknik
tersebut kemungkinan akan terjadi kontaminasi yang menyebabkan
hasil penelitian atau percobaan itu kurang akurat. Oleh karena itu,
teknik aseptis sangat penting dalam kegiatan praktikum ataupun
penelitian. (Pratiwi, 2008).
2. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik untuk melihat bentuk
morfologi bakteri (basil, cocus, spiral, dll) dengan hanya
menggunakan satu macam zat warna. (Suriawiria, 1999).
3. Ikatan ion
Ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa
aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seuler maupun
pada pewarna. (Tryana, S.T, 2008).

III.

TEORI DASAR

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur, dan sifatsifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut di suspensikan.

Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi adalah dengan metode pengecatan atau pewarnaan, hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkain pengecetan. (Karmana,2008).
Sel bakteri dapat diamati dengan jelas jika menggunakan mikroskop
dengan perbesaran 100 x 10 yang ditambah minyak emersi. Jika dibuat preparat
ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk
memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel
bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras
sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat
asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan
warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. (Karmana,2008).
Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat
warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena
muatan negatif banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam
antara lain cristal violet, methylen blue, safranin, Base Fuchsin, Malachite Green,
dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Subandi, 2009).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zatzat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromotofiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi
pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi, pewarnaan
dan penggunaan warna penutup. Suatu preparat yang sudah menyerap zat warna,
kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat
juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri ini disebut bakteri
tahan asam, dan ini merupakan ciri khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 2005)
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesiemen mikroba untuk
pemeriksaan mikroskopis adalah penempatan olesan atau lapisan spesiemen pada
kaca objek, fiksasi olesan pada kaca objek dan aplikasi pewarnaan tunggal

(pewarnaan

sederhana)

atau

serangkain

larutan

pewarna

atau

reagen

(Pelczar,1986)
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,
susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus
diperlukan untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan hal-hal terperinci
tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan
ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Pewarnaan sederhana merupakan tekhnik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat
sulit,larena selain bakteri itu tidak berwarna juga tranparan dan sangat kecil.
Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu tekhnik pewarnaan sel
bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamat. Oleh karena itu
tekhnik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama
dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. (Hadioetomo, 1993).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen
seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat
dibedakan asam dan pewarna basa. (Hadioetomo, 1993).
Pewarna asam dapat terjadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif.
Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan
negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding
sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh
pewarna asam misalnya: tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat, eosin, dll.
(Hadioetomo, 1993).
Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga
akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri ini jadi berwarna dan terlihat.
Contoh dari pewarna basa misalnya metilen biru, kristal violet, safranin, dan lainlain. Teknik pewarnaa asam basa ini hanya menggunaka satu jenis senyawa

pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini


diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentuknya maupun susunan sel.
Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan
senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan
bakteri misalnya, bakteri gram positif dan gram negatif atau bakteri tahan asam
dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti
flagela, kapsula, spora, dan nukleus. (Waluyo,Lud. 2010)
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku sebagai berikut,
mempersiapkan kaca objek. Kaca objek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk
membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. Mempersiapkan apusan, apusan yang
baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis. Apusan ini
berasal dari biakan cair atau padat. Biakan cair suspensi sel sebanyak satu atau
dua mata ose dan diletakkan ke kaca objek. Lalu diapuskan pada kaca objek
selebar beberapa cm. biarkan mengerig di udara atau diatas apai kecil dengan
jarak 25 cm. (Waluyo,Lud. 2010)
Biakan padat. Bakteri yang dikulturkan pada medium padat tidak dapat
langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu.
Letakkan setetes air pada kaca objek, lalu dengan jarum inokulasi ambil bakteri
dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering di
udara. Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada kaca objek dapat
dilakukan diantaranya dengan cara memanaskan diatas api. (Waluyo,Lud. 2010)
Faktor yang mempengaruhi pewaraan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu
preparat yang sudah suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer.bakteribakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang
khas bagi suatu spesies. (Waluyo,Lud. 2010)
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial

dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik
lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau
olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur
pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagianbagian sel mikroba disebut teknik pewarnan diferensial. Sedangkan pengecatan
struktural hanya bisa mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan
bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengectan
endospora, flagela dan pengecatan kapsul. (Waluyo,Lud. 2010)

IV. ALAT DAN BAHAN


IV.1
Alat
1. Bak pewarna
2. Kaca obyek
3. Kapas
4. Kertas saring
5. Mikroskop majemuk
6. Ose
7. Pembakar spirtus.
IV.2
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Bahan
Air suling
Alkohol 70 %
Desinfektan
Minyak celup
Sampel air liur
Zat warna karbol fuksin, biru metilen dan karbol gentian violet.

IV.3

Gambar Alat

V.

PROSEDUR
Kaca objek di bersihkan menggunakan alkohol 70 % lalu di
keringkan menggunakan kapas hingga kering dan bersih. Dibuat tanda
pengamatan menggunakan spidol. Dilakukan fiksasi ose diatas api
hingga besi pada ose memerah, didinginkan didekat api. Diambil
sampel air ludah dalam cawan petri menggunakan ose yang telah dingin
lalu dibuat olesan bakteri dari air liur di atas kaca obyek yang bersih
serta bebas lemak. Kaca objek di lewatkan diatas api hingga telihat
kering. Dimulai dengan perlakuan proses pewarnaan menggunakan
pewarna carbol fuksin, dengan meneteskan karbol fuksin secara merata
pada preparat diatas bak warna. Didiamkan selama 5 menit, lalu dibilas
dengan aquadest. Preparat dikeringkan dengan kertas saring, lalu
ditetesi dengan minyak emersi. Diamati pada mikroskop majemuk

dengan obyektif berkekuatan 10x dan 100x. Prosedur diatas diulangi


dengan pewarna metilen blue.
VI.

HASIL PENGAMATAN

Pewarnaan

menggunakan

karbol Pewarnaan menggunakan metilen

fuksin dengan perbesaran 10X.

Pewarnaan

menggunakan

karbol Pewarnaan menggunakan metilen

fuksin dengan perbesaran 100X.

VII.

blue dengan perbesaran 10X.

blue dengan perbesaran 100X.

PEMBAHASAN

Pada percobaan ini, telah dipelajari untuk mengamati morfologi bakteri yang
melingkungi ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri dengan

menggunakan satu macam zat pewarna. Pada percobaan kali ini telah dilakukan
pewarnaan sederhana menggunakan sampel air liur dan zat pewarna atau
kromogen yaitu carbol fuksin dan metilen blue. Pengunaan satu macam zat warna
yaitu carbol fuksin dan metilen blue bertujuan hanya untuk melihat bentuk sel.
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri seperti kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik yang bermaksud suka akan basa sedangkan zatzat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
yang mempunyai komponen kromoforiknya bermuatan positif.
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan
pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat
morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak
digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsinkarbol (5 detik).
Sebagai praktek telah diaplikasikan beberapa prinsip dalam percobaan ini. Antara
yang digunakan adalah teknik aseptis dimana ia merupakan suatu teknik yang
harus dipraktek selama melakukan pengamatan bakteri. Hal ini demikian karena
teknik aseptis merupakan satu teknik yang dilakukan untuk menjamin preparasi
atau pembiakan tersebut bebas dari partikel dan kontaminasi luar pada waktu
perlakuan. Prinsip seterusnya adalah pewarnaan sederhana yang bermaksud
percobaan ini diamati bentuk morfologi bakteri dengan menggunakan satu bahan.
Prinsip terakhir yang diaplikasikan dalam percobaan ini adalah ikatan ion. Ketika
bakteri diberikan pewarnaan, bakteri tersebut mengalamai ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Maka terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seuler maupun pada pewarna.

Seterusnya dimulai dengan pembuatan pewarnaan sederhana dengan menyiapkan


alat dan bahan yang dibutuhkan. Olesan bakteri yang digunakan adalah sampel air
liur. Sekian itu, telah dibersihkan preparat dengan alkohol 70% lalu dikeringkan
dengan kapas dimana perlakuan ini betujuan agar tidak ada kontaminasi yang
terjadi dan bebas dari lemak yang masih menempel pada kaca obyek karena lemak
tersebut cenderung berikatan dengan zat warna yang mampu memberikan hasil
visualisasi terhadap bakteri yang kurang efektif. Selanjutnya telah dilakukan
pembuatan menandakan batas pengamatan dengan menggunakan spidol pada kaca
obyek yang bertujuan agar diketahui bagian yang akan dioleskan dengan sampel
kandungan bakteri dan lebih mudah untuk diamati pada saat apabila diobservasi
dibawah mikroskop karena setelah proses pewarnaan.
Prosedur selanjutnya adalah dimana sampel air liur dikumpul ke dalam suatu
cawan petri. Sebagai langkah pertama ose atau innoculating loop terlebih dahulu
harus di fixation/fiksasi dengan meletakkan hujung bagian kawat ose pada api
sehingga kawat pada ose bertukar menjadi merah. Perlakan ini dilakukan untuk
memastikan bahwa ose tersebut tidak mengandung atau menpunyai penempelan
sebarang bakteri dan kontaminan yang berada di sekitar atau sekian pemakaian
sebelumnya. Setelah fiksasi, ose didinginkan untuk beberapa menit sehingga ose
tidak panas lagi. Pendinginan ose adalah untuk memastikan bahwa ose yang
masih panas ketika dicelup kedalam sample bakteri berpotensi membunuh bakteri
yang ada pada sample sehingga hasil pengamatan tidak dapat dikenal pasti.
Berikutan itu, diambil sample air liur dengan menggunakan ose yang telah dingin
berdekatan api dan dioleskan pada linkungan yang ditandai pada kaca obyek
secara rata berdekatan api. Perlakuan ini dilakukan berdekatan dengan api untuk
mengurangkan dan mencegah paparan kontaminasi yang mungkin terjadi pada
proses pengambilan sampel dan pengolesan sampel. Seterusnya, kaca obyek yang
dioleskan air liur telah dilewatkan untuk beberapa detik sehingga kelihatan agak
mengering dan tidak bisa dilewatkan pada api terlalu lama karena bakteri pada
kaca obyek itu akan mati. Proses pengeringan itu bertujuan agar bakteri yang
dioleskan tidak tercuci apabila proses pewarnaan dilakukan. Berikutan itu, dilanjut

dengan proses pewarnaan dengan menggunakan pewarna Karbol Fuschin yang


telah diteteskan secara merata pada preparat pada posisi horizontal pada bak
pewarna. Seterusnya, didiamkan selama 5menit agar pewarnaan tersebut merata
ke seluruh daerah dimana bakteri dioleskan dan melewati ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan
menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi
dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya
ditingkatkan. Kemudian dibilas dengan aquadest secara perlahan-lahan sehingga
tidak ada bakteri yang tercuci ketika proses pembilasan. Preparat tersbut
kemudian telah dikeringkan dengan kertas saring pada daerah diluar batas
pengamatan karena bakteri pada preparat cenderung menempel pada kertas saring
maka proses pengeringan ini harus dilakukan secara berhati-hati dan perlahan.
Proses akhirnya adalah penetesan minyak emersi pada preparat yang bertujuan
dapat memberikan visualisasi yang lebih jelas dan terang ketika pengamatan dan
juga melindungi mikroskop itu sendiri. Minyak imersi memiliki indeks refraksi
yang tinggi dibandingkan dengan air atau udara sehingga objek yang kita amati
dapat terlihat lebih jelas. Secara akhirnya, telah diamati preparat yang adanya
bakteri pada mikroskop majemuk. Sekian itu, seluruh percoban diulang dengan
pewarna yang beda yaitu metilen blue dan dilihat juga dibawah mikroscopik.
Hasil dari pengamatan telah dicatat dan telah dikenalpasti morfologi dan stuktur
dan ciri-ciri bakteri tersebut pada sample air liur.

VII.

KESIMPULAN
1. Telah diamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri,
dengan menggunakan satu macam zat pewarna.
2. Telah mengenal pasti pewarna yang digunakan untuk proses pewarnaan
tunggal

VIII.

DAFTAR PUSTAKA

Tryana, S.T.2008. Dasar-dasar Mikorobiologi. Malang : Djambatan

Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.


Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.
Karmana, Oman. 2008. Biologi.PT Grafindo Media Pratama: Jakarta
Subandi, 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Gunung Djati Press: Bandung
Waluyo,Lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM:
Malang
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.
Pelczar, Michael. 1986. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakata: U dan D
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.
Millati, Tanwirul, dkk. 2010. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Industri. Fakultas
Pertanian Universitas Lambung Mangkurat. Banjarbaru
Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum.UMM. Malang
Widjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan