FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015
Nilai
TTD
PEWARNAAN SEDERHANA/TUNGGAL
I.
TUJUAN Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan menggunakan satu macam zat pewarna.
II.
PRINSIP 1. Teknik aseptis Teknik aseptis memiliki beberapa macam sterilisasi, yaitu sterilisasi mekanik, sterilisasi fisik dan sterilisasi kimia. Setiap macam tersebut memiliki prinsip kerja yang berbeda sesuai dengan keadaan media yang akan disterilisasikan. Apabila dalam melakukan penelitian maupun percobaan tidak dilakukan teknik tersebut kemungkinan akan terjadi kontaminasi yang menyebabkan hasil penelitian atau percobaan itu kurang akurat. Oleh karena itu, teknik aseptis sangat penting dalam kegiatan praktikum ataupun penelitian. (Pratiwi, 2008). 2. Pewarnaan sederhana Pewarnaan sederhana merupakan teknik untuk melihat bentuk morfologi bakteri (basil, cocus, spiral, dll) dengan hanya menggunakan satu macam zat warna. (Suriawiria, 1999). 3. Ikatan ion Ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seuler maupun pada pewarna. (Tryana, S.T, 2008).
III.
TEORI DASAR
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur, dan sifatsifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut di suspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi adalah dengan metode pengecatan atau pewarnaan, hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkain pengecetan. (Karmana,2008). Sel bakteri dapat diamati dengan jelas jika menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 x 10 yang ditambah minyak emersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. (Karmana,2008). Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain cristal violet, methylen blue, safranin, Base Fuchsin, Malachite Green, dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Subandi, 2009). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zatzat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromotofiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi, pewarnaan dan penggunaan warna penutup. Suatu preparat yang sudah menyerap zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri ini disebut bakteri tahan asam, dan ini merupakan ciri khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 2005) Langkah-langkah utama dalam persiapan spesiemen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopis adalah penempatan olesan atau lapisan spesiemen pada kaca objek, fiksasi olesan pada kaca objek dan aplikasi pewarnaan tunggal
(pewarnaan
sederhana)
atau
serangkain
larutan
pewarna
atau
reagen
(Pelczar,1986) Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998). Pewarnaan sederhana merupakan tekhnik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,larena selain bakteri itu tidak berwarna juga tranparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu tekhnik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamat. Oleh karena itu tekhnik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. (Hadioetomo, 1993). Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan asam dan pewarna basa. (Hadioetomo, 1993). Pewarna asam dapat terjadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya: tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat, eosin, dll. (Hadioetomo, 1993). Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri ini jadi berwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilen biru, kristal violet, safranin, dan lainlain. Teknik pewarnaa asam basa ini hanya menggunaka satu jenis senyawa
pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini
diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentuknya maupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora, dan nukleus. (Waluyo,Lud. 2010) Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku sebagai berikut, mempersiapkan kaca objek. Kaca objek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. Mempersiapkan apusan, apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis. Apusan ini berasal dari biakan cair atau padat. Biakan cair suspensi sel sebanyak satu atau dua mata ose dan diletakkan ke kaca objek. Lalu diapuskan pada kaca objek selebar beberapa cm. biarkan mengerig di udara atau diatas apai kecil dengan jarak 25 cm. (Waluyo,Lud. 2010) Biakan padat. Bakteri yang dikulturkan pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca objek, lalu dengan jarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering di udara. Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada kaca objek dapat dilakukan diantaranya dengan cara memanaskan diatas api. (Waluyo,Lud. 2010) Faktor yang mempengaruhi pewaraan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer.bakteribakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies. (Waluyo,Lud. 2010) Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial
dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagianbagian sel mikroba disebut teknik pewarnan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya bisa mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengectan endospora, flagela dan pengecatan kapsul. (Waluyo,Lud. 2010)
IV. ALAT DAN BAHAN
IV.1 Alat 1. Bak pewarna 2. Kaca obyek 3. Kapas 4. Kertas saring 5. Mikroskop majemuk 6. Ose 7. Pembakar spirtus. IV.2 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Bahan Air suling Alkohol 70 % Desinfektan Minyak celup Sampel air liur Zat warna karbol fuksin, biru metilen dan karbol gentian violet.
IV.3
Gambar Alat
V.
PROSEDUR Kaca objek di bersihkan menggunakan alkohol 70 % lalu di keringkan menggunakan kapas hingga kering dan bersih. Dibuat tanda pengamatan menggunakan spidol. Dilakukan fiksasi ose diatas api hingga besi pada ose memerah, didinginkan didekat api. Diambil sampel air ludah dalam cawan petri menggunakan ose yang telah dingin lalu dibuat olesan bakteri dari air liur di atas kaca obyek yang bersih serta bebas lemak. Kaca objek di lewatkan diatas api hingga telihat kering. Dimulai dengan perlakuan proses pewarnaan menggunakan pewarna carbol fuksin, dengan meneteskan karbol fuksin secara merata pada preparat diatas bak warna. Didiamkan selama 5 menit, lalu dibilas dengan aquadest. Preparat dikeringkan dengan kertas saring, lalu ditetesi dengan minyak emersi. Diamati pada mikroskop majemuk
dengan obyektif berkekuatan 10x dan 100x. Prosedur diatas diulangi
dengan pewarna metilen blue. VI.
HASIL PENGAMATAN
Pewarnaan
menggunakan
karbol Pewarnaan menggunakan metilen
fuksin dengan perbesaran 10X.
Pewarnaan
menggunakan
karbol Pewarnaan menggunakan metilen
fuksin dengan perbesaran 100X.
VII.
blue dengan perbesaran 10X.
blue dengan perbesaran 100X.
PEMBAHASAN
Pada percobaan ini, telah dipelajari untuk mengamati morfologi bakteri yang melingkungi ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri dengan
menggunakan satu macam zat pewarna. Pada percobaan kali ini telah dilakukan pewarnaan sederhana menggunakan sampel air liur dan zat pewarna atau kromogen yaitu carbol fuksin dan metilen blue. Pengunaan satu macam zat warna yaitu carbol fuksin dan metilen blue bertujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri seperti kokus, basil, spirilum, dan sebagainya dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik yang bermaksud suka akan basa sedangkan zatzat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin yang mempunyai komponen kromoforiknya bermuatan positif. Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsinkarbol (5 detik). Sebagai praktek telah diaplikasikan beberapa prinsip dalam percobaan ini. Antara yang digunakan adalah teknik aseptis dimana ia merupakan suatu teknik yang harus dipraktek selama melakukan pengamatan bakteri. Hal ini demikian karena teknik aseptis merupakan satu teknik yang dilakukan untuk menjamin preparasi atau pembiakan tersebut bebas dari partikel dan kontaminasi luar pada waktu perlakuan. Prinsip seterusnya adalah pewarnaan sederhana yang bermaksud percobaan ini diamati bentuk morfologi bakteri dengan menggunakan satu bahan. Prinsip terakhir yang diaplikasikan dalam percobaan ini adalah ikatan ion. Ketika bakteri diberikan pewarnaan, bakteri tersebut mengalamai ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Maka terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seuler maupun pada pewarna.
Seterusnya dimulai dengan pembuatan pewarnaan sederhana dengan menyiapkan
alat dan bahan yang dibutuhkan. Olesan bakteri yang digunakan adalah sampel air liur. Sekian itu, telah dibersihkan preparat dengan alkohol 70% lalu dikeringkan dengan kapas dimana perlakuan ini betujuan agar tidak ada kontaminasi yang terjadi dan bebas dari lemak yang masih menempel pada kaca obyek karena lemak tersebut cenderung berikatan dengan zat warna yang mampu memberikan hasil visualisasi terhadap bakteri yang kurang efektif. Selanjutnya telah dilakukan pembuatan menandakan batas pengamatan dengan menggunakan spidol pada kaca obyek yang bertujuan agar diketahui bagian yang akan dioleskan dengan sampel kandungan bakteri dan lebih mudah untuk diamati pada saat apabila diobservasi dibawah mikroskop karena setelah proses pewarnaan. Prosedur selanjutnya adalah dimana sampel air liur dikumpul ke dalam suatu cawan petri. Sebagai langkah pertama ose atau innoculating loop terlebih dahulu harus di fixation/fiksasi dengan meletakkan hujung bagian kawat ose pada api sehingga kawat pada ose bertukar menjadi merah. Perlakan ini dilakukan untuk memastikan bahwa ose tersebut tidak mengandung atau menpunyai penempelan sebarang bakteri dan kontaminan yang berada di sekitar atau sekian pemakaian sebelumnya. Setelah fiksasi, ose didinginkan untuk beberapa menit sehingga ose tidak panas lagi. Pendinginan ose adalah untuk memastikan bahwa ose yang masih panas ketika dicelup kedalam sample bakteri berpotensi membunuh bakteri yang ada pada sample sehingga hasil pengamatan tidak dapat dikenal pasti. Berikutan itu, diambil sample air liur dengan menggunakan ose yang telah dingin berdekatan api dan dioleskan pada linkungan yang ditandai pada kaca obyek secara rata berdekatan api. Perlakuan ini dilakukan berdekatan dengan api untuk mengurangkan dan mencegah paparan kontaminasi yang mungkin terjadi pada proses pengambilan sampel dan pengolesan sampel. Seterusnya, kaca obyek yang dioleskan air liur telah dilewatkan untuk beberapa detik sehingga kelihatan agak mengering dan tidak bisa dilewatkan pada api terlalu lama karena bakteri pada kaca obyek itu akan mati. Proses pengeringan itu bertujuan agar bakteri yang dioleskan tidak tercuci apabila proses pewarnaan dilakukan. Berikutan itu, dilanjut
dengan proses pewarnaan dengan menggunakan pewarna Karbol Fuschin yang
telah diteteskan secara merata pada preparat pada posisi horizontal pada bak pewarna. Seterusnya, didiamkan selama 5menit agar pewarnaan tersebut merata ke seluruh daerah dimana bakteri dioleskan dan melewati ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Kemudian dibilas dengan aquadest secara perlahan-lahan sehingga tidak ada bakteri yang tercuci ketika proses pembilasan. Preparat tersbut kemudian telah dikeringkan dengan kertas saring pada daerah diluar batas pengamatan karena bakteri pada preparat cenderung menempel pada kertas saring maka proses pengeringan ini harus dilakukan secara berhati-hati dan perlahan. Proses akhirnya adalah penetesan minyak emersi pada preparat yang bertujuan dapat memberikan visualisasi yang lebih jelas dan terang ketika pengamatan dan juga melindungi mikroskop itu sendiri. Minyak imersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air atau udara sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas. Secara akhirnya, telah diamati preparat yang adanya bakteri pada mikroskop majemuk. Sekian itu, seluruh percoban diulang dengan pewarna yang beda yaitu metilen blue dan dilihat juga dibawah mikroscopik. Hasil dari pengamatan telah dicatat dan telah dikenalpasti morfologi dan stuktur dan ciri-ciri bakteri tersebut pada sample air liur.
VII.
KESIMPULAN 1. Telah diamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan menggunakan satu macam zat pewarna. 2. Telah mengenal pasti pewarna yang digunakan untuk proses pewarnaan tunggal
Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.
Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka. Karmana, Oman. 2008. Biologi.PT Grafindo Media Pratama: Jakarta Subandi, 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Gunung Djati Press: Bandung Waluyo,Lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM: Malang Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan. Pelczar, Michael. 1986. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakata: U dan D Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta. Millati, Tanwirul, dkk. 2010. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Industri. Fakultas Pertanian Universitas Lambung Mangkurat. Banjarbaru Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum.UMM. Malang Widjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan
