Anda di halaman 1dari 9

Bahan pemeriksaan yg mengandung bakteri harus diwarnai dulu agar dapat dilihat jelas

di bawah mikroskop.
Beberapa cara pewarnaan:
1. Sederhana --> hanya menggunakan 1 jenis zat warna, untuk memastikan morfologi
bakteri
2. Diferensial --> menggunakan 2 zat warna, untuk pemisahan kelompok
Contoh: Pewarnaan gram, tahan asam (Ziehl Neelsen), dan spora (Schaeffer-Fulton)
3. Khusus --> untuk melihat bagian-bagian bakteri
Contoh: Gray (flagella), Gins Burri (kapsul), Feulgen (inti sel), Klein (spora)
Perbedaan Gram (+) dan Gram (-)

Perbedaan gram positif dan gram negatif

Struktur dinding sel gram positif

Struktur dinding sel gram negatif

Prinsip Pewarnaan Gram


Bakteri gram positif dan gram negatif sama-sama mengikat zat warna pertama (Carbol
gentian violet) yang berwarna ungu, namun bakteri gram negatif melepas zat warna
pertama kemudian mengikat zat warna berikutnya yaitu safranin/water fuchsin yang
berwarna merah. Maka dari itu, hasil akhir nya gram negatif berwarna ungu sedangkan
negatif berwarna merah.
Cara Pewarnaan Gram
A. Alat dan Bahan
1. Rak pewarnaan
2. Bak pewarnaan
3. Sediaan yang akan diwarnai
4. Zat warna gram

Carbol gentian violet 1%

Gram iodin/lugol 2%

Alkohol 96%

Safranin/water fuchsin 1%

5. Air (yang akan dipakai setelah menggunakan tiap zat warna)


B. Metode Pewarnaan
1. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan
2. Sediaan dituangi pewarna basa, kristal violet selama 1 menit, cuci dengan air (bakteri
akan mengikat zat warna)
3. Tuangi gram iodin selama 30 detik, cuci dengan air
4. Dekolorisasi dengan alkohol 96% (20-30 detik, jangan terlalu lama ataupun terlalu
singkat karena pada tahap ini bakteri gram positif mungkin tampak merah jika terlalu
lama sedangkan gram negatif mungkin tampak tetap ungu jika terlalu singkat;
seharusnya LPS pada bakteri gram negatif kemungkinan tercuci oleh alkohol), cuci
dengan air
5. Counterstain dengan water fuchsin/safranin selama 1-2 menit, cuci dengan air

6. Keringkan
7. Baca sediaan dengan mikroskop pembesaran objektif 100x

basil gram positif

coccus gram negatif (yang ditunjuk dgn tanda panah)

Materi Praktikum Mikrobiologi

Cara Pembuatan Preparat


. Tujuan dilakukannya praktikum pembuatan Preparat yaitu nantinya diharapkan agar kita
nantinya dapat membuat preparat dari kultur cair dan Mengerti teknik pewarnaan
Dalam pembuatan preparat alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek
glass, kawat ose, Bunsen, pipet tetes, koloni mikroba, agar miring, alcohol 95%, larutan
Kristal violet, fuchsin basa, larutan lugol. Proses pembuatan preparat bakteri yaitu kawat ose
dipijarkan diatas api Bunsen. Setelah itu diambil koloni bakteri pada agar miring PCA (Plate
Count Agar) lalu taruh koloni bakteri tersebut diatas objek glass. Penempatan koloni bakteri
tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu
ditambahkan fuchsin basa dan Kristal violet pada kaca preparat dan didiamkan selama 1
menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan mikroba pada objek glass,
memperjelas pengamatan dibawah mikroskop dan membunuh mikroba. Setelah itu diamati
di bawah mikroskop dan digambar.
Mikroorganisme yang ada di ala mini mempunyai morfologi, struktur daan sifat-sifat yang
khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras
dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan
atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologinya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Dwidjoseputro,
1989).
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifatsifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Volk dan Wheeler,
1993).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negative. Senyawa-senyawa
kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakteri
akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar
pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa.
Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika
warna terdapat pada ion negative maka disebut zat warna asam. Zat warna asam umumnya
mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan
zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri
dipengaruhi oleh factor-faktor seperti fiksasi, pelunturan warna, substrat, intesifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, sprilum, dsb) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarnaan sederhana. Istilah pewarnaan sederhana dapat diartikan dalam
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri
mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat
basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan

sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Factorfaktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat,
intesifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah
meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan alcohol maka semua zat warna
terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap alcohol.
Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan
cirri khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1989).
Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan pengecatan sederhana dan pengecatan gram
atau pengecatan bertingkat, tetapi beberapa genus anggota dari genus mycobacterium
bersifat resisten dan hanya dapat dilihat dengan metoda tahan asam.
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Melihat
dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan
mudah diamati. Oleh larena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara
yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah
adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna
yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat
dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Pewarnaan sederhana, sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas objek
gelas yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspense bakteri yang terlalu padat,
tapi jika suspense bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri
dengan
mikroskop.
Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan meletakkan sel bakteri pada
objek gelas tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus
pandang (transaparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga
sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bisa yang hampir
sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair.kontras antara sel
dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut
dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).

Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi bakteri, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membrane sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu
gram positif dan gram negative. Bakteri gram positif mempunyai dinding sel tebal dan
membrane sel selapis. Sedangkan bakteri gram negative mempunyai dinding sel tipis yang

berada diantara dua lapisan membrane sel. Karena kemampuannya membedakan suatu
kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan ini juga disebut
pewarnaan diferensial atau pewarnaan bertingkat. Prinsipnya bakteri dengan pewarnaan
utama yaitu dengan Kristal violet akan berwarna ungu, melalui fiksasi warna dengan lugol
akan menguatkan pelekatan warna utama, penambahan alcohol akan melunturkan atau
memucatkan zat warna utama sehingga pada sel gram negative sel menjadi tidak berwarna
tetapi pada sel gram positif tidak mengalami pelunturan sehingga tetap berwarna ungu.
Pada pemberian pewarnaan tandingan yang berbeda dengan pewarna utama yaitu fucin
basa menebabkan bakteri gram negative akan menyerap warna tersebut menjadi merah.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja
serta mengikuti aturan dasar yang berlaku yakni sebagai berikut: mempersiapkan kaca
objek. Kaca objek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat lapisan dari bakteri
yang diwarnai. Mempersiapkan preparat , preparat yang baik adalah yang tipis dan kering,
terlihat seperti lapisan yang tipis. Preparat ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.
Biakan cair suspense sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada
kaca objek lalu preparat pada kaca objek lebar dan biakan mongering dengan cara fiksasi.
Biakan padat bakteri yang kulturnya pada media padat tidak dapat langsung dibuat preparat
seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dahulu, dengan cara meletakkan setetes air
pada kaca objek lalu dengan jarum inokulasi diambil bakteri dari biakan padat, biarkan
mongering atau dilakukan dengan cara fiksasi.
Alat
dan
Alat dan bahan yang kita butuhkan dalam pembuatan preparat ini diantaranya :
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.

Kaca objek
Biakan dari e.coli pada agar kaldu miring
Jarum inokulasi
Gelas kimia berisi air dengan sebatang pengaduk kaca
Lampu Bunsen
Kertas saring
Mikroskop
Kapas
Larutan lugol
Alcohol 90%
Gelas kimia 100 mL
Stopwatch
Fuchin basa

Praktikum

a.

Pembuatan preparat sederhana


1.
2.
3.

Mensterilkan kaca preparat dengan alcohol 90%


Mengambil akuades dengan pipet tetes
Meletakkan diatas preparat

Bahan

4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

b.

Mengambil biakan bakteri menggunakan jarum ose, lakukan secara steril


Meletakkan biakan ke dalam preparat hingga rata
Melakukan fiksasi terhadap preparat
Meneteskan Kristal violet dan fucin basa ke atas preparat
Menunggu hingga 1 menit
Membilas dengan akuades
Mengamati dengan mikroskop.

Pembuatan preparat berwarna menurut gram


1.
2.

Melakukan hal ang sama (1-6) pada pembuatan preparat sederhana


Meneteskan gram A (Kristal violet) ke atas preparat tunggu hingga 1 menit

3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Membilas dengan akuades


Meneteskan gram B (larutan lugol) ke atas preparat tunggu hingga menit
Membilas dengan akuades
Meneteskan gram C (alcohol) ke atas preparat tunggu hingga 1 menit
Membilas dengan akuades
Meneteskan gram D (fucin basa) ke atas preparat, tunggu hingga 3 menit
Membilas dengan akuades
Mengamati di mikroskop.

Analisis dan Pembahasan


Pada praktikum ini kita membuat preparat bakteri, sebelum membuat preparat bakteri
usahakan semua alat dan media yang digunakan tersebut sudah steril. Sebelum
memindahkan bakteri ke kaca objek kita harus memijarkan dulu jarum ose dan tabubg
reaksi bakteri, setelah itu ambil sedikit saj bakteri dari biakan induk bakteri lalu gesekkan
pada kaca objek secara hati-hati. Kalu bakteri terlalu tebal tetesi dengan air, dan sebarkan
secara merata.
Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis agar bakteri dengan mudah
dapat diidentifikasi. Teknik yang digunakan dalam pembuatan preparat ada berbagai macam
tergantung pada specimen dan penelitian yang dibutuhkan, antara lain fiksasi yaitu suatu
metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistic dengan
menggunakan Kristal violet.
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas bentuk dan ukuran bakteri seperti dinding sel dan vakuol, menghasilkan sifatsifat fisik dan kimia ang khas dari pada bakteri dengan zat warna serta meningkatkan
kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
Ada beberapa factor yang memepngaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram

pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histology yaitu Cristian Gram
(Capucino dan Shesman, 1983).
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan atu jenis zat warna untuk mewarnai
organism tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitiplasmanya bersifat basofilik (suka air dan basa). Pada zat warna basa,
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan
positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan dalam memberikan zat
warna memiliki muatan negative. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan
negative banyak ditemukan pada permukaan sel. Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersidat alkalin. Dengan pewarnaan sederhana dapat
mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan
untuk pewarnaan sederhana adalah Kristal violet dan fucin basa.
Pada pewarnaan sederhana menggunakan satu macam pewarnakristal violet untuk objek
gelas yang pertama dan fucin basa untuk objek gelas yang kedua, sehingga ketika diamati
dengam menggunakan mikroskop maka pada bakteri e.coli akan terlihat berwarna biru
keungu-unguan untuk objek gelas yang pertama dengan Kristal violet, pada objek gelas
kedua yaitu dengan fucin basa e.coli terlihat berwarna ungu merah.
Pewarnaan gram atau bertingkat menghasilkan dua kelompok besar bakteri, yaitu gram
positif yang berwarna ungu dan gram negative yang berwarna merah. Adanya gram positif
dan gram negative disebabkan oleh perbedaan pandangan dinding sel bakteri. Kandungan
senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal dibandingkan pada dinding
gram negative. Zat warna yang digunakan pada pengecetan gram meliputi Kristal violet,
lugol, alcohol, dan fucin basa. Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah:
1.

Kristal violet

Berwarna ungu dan merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberikan warna
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan
akan terlihat berwarna ungu.
2.

Lugol

Merupakan pewarna mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer
yang diserap mikroorganisme target. Pemeberian lugol pada pengecatan gram ini
dimaksudkan untuk memperkuat pengikat warna oleh bakteri.
3.
Alcohol
Merupakan solven organic yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat
warna pada sel bakteri. Pemberian alcohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan
terjadinya dua kemungkinan:

Mikroorganisme tetap berwarna ungu kebiruan


Bakteri mejadi tidak berwarna

4.

Fucin basa

Merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alcohol.
Dengan kata lain memberikan warna pada mikroorganisme non target.
Pada pewarnaan gram ini ditemukan bahwa bakteri e.coli setelah diamati dengan
menggunakan mikroskop terlihat berwarna ungu kebiruan. Menurut praktikum bakteri e.coli
merupakan bakteri gram positif karena dapat mempertahankan warna ungunya. Tetapi
menurut referensi e.coli merupakan bakteri gram negative yang tidak mempertahankan
warna ungunya sehingga berubah warna menjadi merah.
Kesimpulan
Dari hasil pengamatan yang sudah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa
preparat dari kultur cair. Preparat dibuat dari kultur e.coli. Teknik pewarnaan untuk
identifikasi e.coli dilkukan dengan 2 cara yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan
gram/bertingkat. Berdasarkan teknik pewarnaan tersebut dapat disimpulkan bahwa e.coli
merupakan gram negative menurut referensi tetapi menurut praktikum merupakan gram
negative.
Sumber Pustaka

Camphell, N.A., dan Reece, J.B., 2005, Biologi Jilid 2, Erlangga:Jakarta.

Hadioetomo,
R.S.,
1990,
Mikrobiologi
Dasar
Dalam
Praktek,
Gramedia:Jakarta.

Law, W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Raja Grafindo


Persada:Jakarta.

Pelczar, M.W., 1986, Dasar-dasar Mikrobiologi 1, UI Pres:Jakarta.

Wahyuningsih, 2008, Pengecatan Gram, Universitas Jendral Sudirman,


Fakultas Pertanian:Purwokerto.