TUGAS BIOTEKNOLOGI

Nama

: Intan Nur Saadah

NIM

: 132210101065

Plasmid
Plasmid adalah salah satu vektor yang biasa digunakan dalam proses pengklonan
gen. Vektor adalah pembawa molekul DNA di dalam proses pengklonan gen.
Plasmid adalah molekul DNA untai ganda sirkuler (tak berujung) yang berukuran
kecil yang terdapat di dalam sitoplasma, dan dapat melakukan replikasi secara
autonom. Karakteristik yang penting dari plasmid adalah dapat melakukan replikasi,
terdapat di luar kromosom, dan secara genetik dapat ditransfer dengan stabil.
Plasmid ini terdapat baik secara alami, maupun sudah mengalami modifikasi yang
disesuaikan dengan keperluan di dalam manipulasi genetik. Satu sel dapat
mengandung lebih dari satu kopi plasmid.
Plasmid berukuran 1 300 kb, sehingga dapat dibedakan dengan mudah dari
kromosom bakteri yang berukuran 3000 5000 kb. Plasmid yang terlibat dalam
proses konjugasi (plasmid F) biasanya berukuran besar. Untuk replikasi plasmid
dapat berada dalam keadaan terpisah dari kromosom (non-integratif) dan terintegrasi
dalam kromosom bakteri (episom). Plasmid terdapat di dalam sitoplasma organisme
prokaryot dan eukaryot sederhana uniseluler. Selain terdapat dalam bakteri, plasmid
juga terdapat pada Saccharomyces cerevisiae (plasmid 2 um). Plasmid dapat
dikelompokkan berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya, yaitu :
(i) Plasmid F (fertilitas) membawa gen tra, yang bertanggung jawab terhadap proses
konjugasi; (ii) Plasmid R (resistensi) mengandung gen resistensi terhadap antibiotic
atau logam berat; dan (iii) Plasmid yang mengandung gen penyandi toksin dan
bakteriosin seperti ColE1 dari E.coli; (iv) Plasmid degradatif yang mempunyai
kemampuan untuk melakukan metabolisme molekul organic seperti toluene (TOL
dari Pseudomonas putida); (v) Plasmid virulensi yang bertanggung jawab terhadap
patogenitas dari sel inang (pTi pada Agrobacterium tumefaciens).
Virus Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur
hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai

vektor kloning pada sel inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang
biasa digunakan sebagai vektor kloning, diantaranya adalah bakteriofag dan
M13.
Bakteriofag
Bakteriofag atau fag merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E. coli.
Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat
memanfaatkannya sebagai vektor kloning semenjak masa-masa awal
perkembangan rekayasa genetika. DNA yang diisolasi dari partikel fag ini
mempunyai konformasi linier untai ganda dengan panjang 48,5 kb. Namun
masing-masing ujung fosfatnya barupa untai tunggal sepanjang 12 pb yang
komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA untuk berubah
konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkulet, tempat bergabungnya kedua
untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos. Seluruh untai basa DNA
telah diketahui. Secara alamiah terdapat lebih dari satu tempat pengenalan
restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Oleh karena itu, DNA
tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi saat ini
telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA yang memenuhi syarat sebagai
vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA , yaitu
vektor insersional dan vektor substitusi. Vektor insersional adalah vektor yang
dnegan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing. Sedangkan vektor
substitusi adalah vektor yang untuk membawa fragmen DNA asing sebagian atau
seluruh urutan basanya yang terdapat didaerah non-esensial dan menggantinya
dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.
Bakteriofag mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase
lisogenik. Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah trasnsformasi untuk DNA
fag) dimulai dengan masuknya DNA yang berubah konformasinya menjadi
sirkuler dan mengalami replikasi secara indenpenden atau tidak bergantung
kepada kromosom sel inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlah salinan
DNA sirkuler, masing-masing DNA ini akan melakukan transkripsi dan
translasim membentuk protein kapsid (kepala). Selanjutnya, tiap DNA akan
dikemas dalam kapsid sehingga menghasilkan partikel baru yang akan keluar dari
sel inang untuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada fase
lisogenik DNA akan terintegrasi kedalam kromosom sel inang sehingga

replikasinya bergantung kepada kromosom sel inang. Fase lisogenik tidak

menimbulkan lisis pada sel inang. Didalam medium kultur, sel inang yang
mengalami lisis akan membentuk plak berupa daerah bening diantara koloni-koloni
sel inang yang tumbuh. Oleh karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat
dilakukan dengan melihat terbentuknya plak tersebut.
Cosmid
Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggunakan kos dari
DNA lamdha dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA
sepanjang 32 hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag
dan plasmid.
Fasmid
Selain kosmid, ada kelompok vektor sintetik yang merupakan gabungan antara
plasmid dan fag . Vektor yang dinamakan fasmid ini membawa segmen DNA
yang berisi tempat att. Tempat att digunakan oleh DNA untuk berintegrasi dengan
kromosom sel inang pada sel lisogenik.
Vektor YACs
Seperti halnya kosmid YACs (yeast artificial chromosomes atau kromosom
buatan dari khamir) dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA plasmid dan
segmen tertentu DNA kromosom khamir. Segmen kromosom khamir yang
digunakan terdiri dari sekuens telomere, sentromer, dan titik awal replikasi. YACs
dapat membawa fragmen DNA genomic sepanjang lebih dari 1 Mb. Oleh
karena itu, YACs dapat digunakanuntuk menggklon gen utuh manusia,
misalnya gen penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan
kemampuannya itu YACs sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti
pada proyek pemetaan genom manusia.
Vektor YEps
Vektor-vektor untuk keperluan kloning dan ekspresi gen pada Saccharomyces
cereviceae dirancang atas dasar plasmid alami berukuran 2 m, yang
selanjutnya dikenal dengan plasmid 2 mikron. Plasmid ini memiliki sekuens DNA
sepanjang 6 kb, yang mencakup titik awal replikasi dan dua gen yang terllibat

dalam replikasi. Vektor-vektor yang dirancang atas dasar plasmid 2 mikron

disebut YEps (yeast episomal plasmids). Segmen plasmid 2 mikronnya membawa
titik awal replikasi, sedangkan segmen kromosom khamirnya membawa suatu gen
yang berfungsi sebagai penanda seleksi, misalnya gen LEU2 yang terlibat dalam
biosintesis leusin. Meskipun biasanya bereplikasi seperti plasmid pada
umumnya, YEps dapat terintegrasi kedalam kromosom khamir inangnya.
SELEKSI BIRU-PUTIH (BLUE WHITE SELECTION)
Seleksi biru putih atau blue-white selection adalah salah satu metode untuk
mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi. Metode ini merupakan
salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi berdasarkan
warna.
Seleksi biru putih (blue-white selection) merupakan metode untuk memisahkan
sel yang mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid
tanpa insert. Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses
ligasi atau keberadaan DNA sisipan. Metode ini menggunakan media yang
mengandung X-gal dan IPTG (Isopropil Thiogalaktosida) (Brown TA 1995).
Transforman yang dihasilkan ada yang berwarna biru dan putih, adanya warna biru
karena senyawa X-gal dalam medium . Hasil transformasi terlihat bahwa koloni
berwarna putih terbentuk pada cawan dengan penambahan X-gal dan IPTG serta
pada kontrol positif tanpa perlakuan. X-gal adalah molekul yang mirip galaktosa,
sedangkan IPTG merupakan inducer enzim -galaktosidase. Hasil ini sesuai dengan
literatur yang mengatakan, terbentuknya koloni berwarna putih ini berarti sel bakteri
mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi dinyatakan berhasil
(Brown 1995). Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak berhasil
ditandai dengan warna koloni berwarna biru artinya proses transformasi yang
dilakukan tidak berhasil hal ini dapat terjadi karena ukuran insert terlalu kecil
sehingga tidak mampu membuat gen lacZ terinaktifasi atau posisi sisipan yang tidak
tepat, dan insert yang diklon bersifat meracuni bagi sel bakteri.
Transformasi dikatakan berhasil apabila rangkaian DNA yang diintroduksikan
dapat disisipkan ke genom sel inang (bakteri), diekspresikan, dan terpelihara dalam
seluruh proses pembelahan sel berikutnya. Seleksi bakteri pembawa DNA
rekombinan dapat dilakukan denan dua cara yaitu seleksi resistensi antibiotika dan
seleksi warna. Sel yang mengandung plasmid tanpa insert ditumbuhkan pada media

LA dan ampisilin tersebut maka gen lac-Z akan terekspresikan dan -galaktosidase
dihasilkan serta menghasilkan koloni biru. Enzim ini akan memecah X-gal dan
menghasilkan senyawa berwarna biru, begitu pula sebaliknya, jika sel yang
mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan atau berhasil tersisipi maka pada
media LA tersebut, maka gen lac-Z tidak akan diekspresikan dan -galaktosidase
tidak akan terbentuk. Koloni akan berwarna putih (Brown 1995).
RESISTENSI OBAT OLEH BAKTERI
Resistensi bakteri dapat terjadi secara intrinsik maupun didapat. Resistensi
intrinsik terjadi secara khromosomal dan berlangsung melalui multiplikasi sel
yang akan diturunkan pada turunan berikutnya. Resistensi yang didapat dapat terjadi
akibat mutasi khromosomal atau akibat transfer DNA.
1. Resistensi akibat mutasi.
Seperti proses mutasi khromosom yang lain, mutasi yang menimbulkan
keadaan resisten terhadap antibiotik juga merupakan peristiwa spontan,
terjadi secara acak, tidak dipengaruhi frekuensinya oleh kondisi seleksi
atau antibiotik, kecuali antibiotik tersebut sendiri adalah mutagen yang
mampu meningkatkan angka mutasi. Perubahan yang terjadi pada mutasi
biasanya mengenai satu pasangan basa pada urutan nukleotida gen. Mutasi
khromosom mengakibatkan perubahan struktur sel bakteri antara lain
perubahan struktur ribosom yang berfungsi sebagai target site,
perubahan struktur dinding sel atau membran plasma menjadi
impermeabel terhadap obat, perubahan reseptor permukaan dan
hilangnya dinding sel bakteri menjadi bentuk L (L-form) atau
sferoplast. Penggunaan antibiotik secara luas dan dalam jangka waktu yang
lama merupakan proses seleksi, sehingga galur mutan akan bekembang
biak menjadi dominan di dalam populasi.
2. Resistensi dengan perantaraan plasmid.
Plasmid R ditemukan sekitar tahun 1960-an dan telah menyebar luas
pada populasi bakteri komensal maupun patogen.

Plasmid adalah

elemen genetik ekstrakromosom yang mampu mengadakan replikasi

secara otonom. Pada umumnya plasmid membawa gen pengkode resisten
antibiotik. Resistensi yang diperantarai oleh plasmid adalah resistensi yang
umum ditemukan pada isolat klinik. Gen yang berlokasi pada plasmid lebih
mobil bila dibandingkan dengan yang berlokasi pada kromosom. Oleh

karena itu gen resistensi yang berlokasi pada plasmid dapat ditransfer dari
satu sel ke sel lain.

Sifat resistensi dengan perantaraan plasmid biasanya berhubungan

dengan sintesis protein yang bekerja secara enzimatik merusak obat atau
memodifikasi obat menjadi bentuk yang tidak bersifat bakteriostatikbakterisid.
3. Reistensi dengan perantaraan transposon.
Transposon dapat berupa insertion sequence dan transposon kompleks.
Transposon adalah struktur DNA yang dapat bermigrasi melalui genom
suatu organisme. Struktur ini bisa merupakan bagian dari plasmid dan
bakteriofaga tapi dapat juga berasal dari khromosom bakteri. Transposon
kompleks dapat berupa bagian dari plasmid tetapi juga dapat terjadi
pada genom bakteri. Transposon terdiri dari gen yang mengkode enzim
yang dapat memotong DNAnya sendiri sehingga dapat berpindah ketempat
lain. Transposon kompleks mengandung satu gen atau lebih dengan fungsi
yang berbeda-beda. Bila transposon yang

mengandung gen resisten

mengadakan insersi pada plasmid maka akan dipindahkan ke sel lain.

Dengan demikian bila plamid mampu bereplikasi sendiri pada inang yang
baru atau bila transposon pindah ke plasmid yang mampu mengadakan
replikasi atau mengadakan insersi pada khromosom maka sel ini menjadi
resisten terhadap antibiotik.