Insert workgroup name on slide master

Insert workgroup
logo on slide master

Home
Whats New
Projects
Documents
Team
Links

KLT DENSITOMETER

ny Guntarti
FARMASI
2013

Insert workgroup name on slide master

Insert workgroup
logo on slide master

Home
Whats New
Projects
Documents
Team
Links

Kromatografi kertas

Insert workgroup name on slide master

Insert workgroup
logo on slide master

Home
Whats New
Projects
Documents
Team
Links

Kromatografi lapis tipis

KLT DENSITOMETER
Metoda analisis instrumental yang

berdasarkan interaksi radiasi elektro

magnetik dengan analit yang merupakan
noda pada KLT
Alat dilengkapi dengan spektrofotometer
yang mempunyai pancaran sinar yang
panjang gelombang diatur dari 200 - 700 nm.
Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem
absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)

Teknik penggunaannya :
- Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan
(hanya untuk TLC dengan pendukung gelas),
- Sinar yang diserap dan dipantulkan
- Atau sinar yang dipendarkan.
Susunan optik densitometer ini tidak banyak
berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada
densitometer digunakan alat khusus reflection
photomultiplier, sebagai pengganti
photomultiplier pada spektrofotometer.
55

Pada era perkembangan teknik kromatografi saat

ini pemakaian "Thin Layer Chromatograph
Scanner" yang lebih populer dengan nama
densitometer makin banyak dipakai .

66

lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan

noda pada KLT secara :
Absorpsi
Transmisi
Pantulan (refleksi) pendar fluor
Pemadaman pendar fluor

77

Sumber Radiasi
Pada umumnya spektrofotodensitometer memberikan

rentang gelombang penentuan 200-630 nm.

Lampu D2 (Deuterium) dipakai untuk pengukuran pada

daerah ultra violet dan lampu tungstein pengukuran

pada daerah sinar tampak.

Untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar

fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi.

Pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi

atau absorpsi dan retleksi pada panjang gelombang

maksimal.

 Pada penentuan pendar fluor dan

pemadaman pendar fluor diukur pada

panjang gelombang dimana terjadi emisi atau
intensitas relatif pendar fluor yang optimal.
Monokromator dipakai monokromator kisi
difraksi
Detektor PMI' (Photo Multiplier Tube = Tabung
Penggandaan Foton) merupakan detektor
umum yang dipakai pada densitometer.
9

 Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif

analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang

yang merupakan hasil pemisahan dengan KL T.
S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode

densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif

ultramikro. Keduanya telah berhasil meneliti
testosteron dalam cairan biologis pada rentang
kadar (1 hingga 250) ng, LSD dengan kadar (2-150)
ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan pengukuran
pendaran pada noda (kromatogram) KLT.
10
10

Lanjutan
Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area

noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya

dibanding metode KCKT (Kromatografi Cair kinerja
Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area
noda kromatogram diukur pada posisi lurus atau "Zigzag" menyeluruh.
Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang

dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis lurus,

akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati
parabola
11
11

Kurva hubungan serapan dan kadar

Persamaan Kubelka-Munk
Korelasi kadar analit yang dirajah terhadap area

kromatogram tidak merupakan garis lurus.

Bila REM (Radiasi Elektro Magnetik) dengan

intensitas semula (I0) jatuh pada permukaan lapisan

tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan
tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut akan:
direfleksikan (Is)

diserap oleh analit lapisan tipis (I)

diteruskan (It).
I=10 + Is + It
12
12

 Intensitas REM yang direfleksikan tergantung

pada koefisien permukaan lapis tipis (E), yang

dinyatakan sebagai :
Is = I. E
Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan

tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat :

I0 =I-Is
I0=I-I.E=(I-E)I
Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan

tipis yang homogen maka akan berlaku hukum

Lambert Beer seperti pada spektrofotometri.
It =I0. eKX

13
13

E = koefisien permukaan lapis tipis

It =I0. eHk. Lambeert Beer It = I0 . e-kt

KX

x
= tebal medium lapis tipis
k
= koefisien absorbsi
e-kt = berkurangnya I radiasi elektro magnetik
yang melewati medium Optical density

Parameter S (koef. Penghamburan)

 Oleh sehab itu pada metode spektrofoto-

densitometri dikenal parameter :

K (koefisien absorbsi)
S (koefisien penghamburan).
Karena adanya parameter S inilah terjadi

penurunan intensitas radiasi yang masuk

medium lapis tipis yang dihamburkan oleh
partikel-partikel fase diam.

15
15

Parameter S (koef. Penghamburan)

Menyebabkan penurunan I radiasi yang masuk ke
medium lapis tipis
Sx = tiap pelat berbeda harganya
= 0 -10

dl = + (S + K ) I + S
- dx
j
dl
+ dx = - (S + K ) I + Sj

I = radiasi elektromagnetik yang arahnya tegak

lurus menuju permukaan lapis tipis
j = radiasi elektromagnetik yang arahnya
meninggalkan permukaan lapis tipis
S = faktor hamburan untuk tiap satu satuan
tebal lapis tipis
K = faktor penyerapan/absorpsi untuk tiap satu
satuan tebal lapis tipis
X = tebal lapisan untuk tiap satu satuan tebal
lapis tipis

Pernyataan Kubelkan Munk :

( I R )2

C
2R
S
E = absorbsi radiasi elektromagnetik oleh analit
pada pelat KLT
C = kadar analit
R = cahaya terpantul pada permukaan lempang

Korelasi area analit dengan kadar dinyatakan

sebagai kurva parabola :
A2 = f ( C )
log A = f ( log C )
= E x

Bagan Alat densitometer

Gambar

19
19

Mk

Mk

PM
PS
I
I
I
I

PM

PM
Lempeng

PM

Lempeng

(a)
(b)
Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)

 Photomultiflier tersebut dapat memperbesar tenaga

beda potensial listrik sehingga mampu menggerakan

integrator.

Integrator dengan sistem mikrokomputer secara

langsung dapat menghitung luas puncak atau tinggi

puncak secara otomatik. Selain itu mencatat nomer
urut, kedudukan puncak pada ordinal Y atau waktu
retensinya.

Letak sumbu Y dan X dari lempeng akan mempengaruhi

hasil yang diperoleh.

Kalau Y disesuaikan dengan arah gerak eluen dan

sumbuk X tegak lurus padanya atau merupakan

deretan penotolan sampel pada lempeng. Dengan
cara itu mereka akan mendekati kepastian.

22
22

Cara kerja pelacakan bercak Densitometer

Gambar

23
23

Cara Kerja Densitometer

Lempeng yang telah digunakan untuk pemisahan.
diuji dulu kedudukan setiap bercak pada
sumbu(X,Y). agar sinar dapat tepat mengenai pusat
bercak.
Setelah tombol dihidupkan lempeng ditempat

kan pada satu garis deretan Y, bercak diatur,

dan gerakan lempeng diatur sesuai kedudukan
bercak, menggunakan mikrokomputer.
Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan

secara maksimum, bila belum diketahui dilakukan

24
scanning lebih dulu.
24

 Scanning pengujian kuantitatif ada 2 cara :

A. Cara memanjang
Sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga

bercak hanya dideteksi sepanjang garis

tengahnya sepanjang sumbu Y,(Y1 sampai Y2).
Hasilnya baik bila bercak berbentuk bulat
semetris.
B. Sistem zig-zag
Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu
Y tetapi berbelok -belok sampai garis tepi bercak
pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan
X1-X2.
25
25

 Pelacakan bercak,

Gambar. Cara pelacakan bercak dengan TLC Scanner

(a) Model zig-zag. ( b). model lurus

Kelebihan penggunaan metode zig-zag lebih merata

pengukurannya, apalagi delta Y menggunakan jarak
terkecil.
Kelemahannya waktu lebih lama, tetapi ketelitian
pengukuran lebih terjamin dibanding penggunaan
metode pengamatan lurus.
26
26

 Keterangan tambahan
Besarnya bercak, dari X1 sampai X2 lebih besar

dari garis tengah bercak agar semua bercak

teruji.
Delta Y, selisih garis kesatu dan kedua makin
kecil makin rata pengukurannya, antara 0,001
sampai 0,1 mm, kode yang diberikan angka 1
sampai dengan 3.
Simbul Y tergantung dalam meletakkan lempeng
terhadap arah scanning, (lihat panah) sesuai
garis Y, dan garis tegak lurus Y adalah garis X.
27
27

 Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah

dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas

area (mikro volt) yang tertera merupakan
besaran puncak. Kadang-kadang prosentase
yang tertulis hanya merupakan kadar relatif dari
puncak yang muncul (tergambar).
Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak
semitris akan kurang teliti sebab konsentrasi
terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak
bercak.
Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan
molekul senyawa untuk mengumpul ditengah
lebih banyak.
28
28

Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan

waktu retensinya, atau dilakukan penyarian dari

bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji
secara spektroskopi.
Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya
dapat diuji.

29
29

Cara Menyari/ekstrasi

Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar

UV diberi tanda (lingkari) dengan ujung pensil,
kemudian diambil lapisan tipis bersama
bercaknya.
Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas
piala, ditambah pelarut yang sesuai (etanol/
kloroform), diaduk, dan setelah larut, disaring.
Kedalam labu takar, dan cairan dijadikan volume
sampai tepat tanda ( 10,0 ml). Larutan siap diuji
dengan alat spektrofotometer.
30

 Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer

pada panjang gelombang serapan maksimumnya.

Karena pengenceran merupakan faktor penting
untuk perhitungan kadar senyawa yang diuji secara
kuantitatif segala caranya,
31

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (

Gambar Chamber yang banyak digunakan
Chamber

32

*Chamber harus
dijenuhkan dulu selama
lebih kurang 30 menit
dengan bantuan kertas
saring.
*Penguapan dari fase
gerak dari permukaan
lempeng, dalam
chamber yang tidak
jenuh akan
menghasilkan Rf yang
lebih besar,
reproducibility hasil
keterulangan Rf tak
bagus dan permukaan
fase gerak akan konkap.
*Fase gerak yang tidak
mau campur dengan

33

Lempeng
Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer

Chromatografi) atau KLTKT (kromatografi lapis tipis

Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif
(butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk
analisis kuantitatif

Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat

digunakan densitometer baik menggunakan pereaksi

bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan
pelacak sinar ultra ungu, sinar tampak maupun sinar
fluoresensi. (Didiskusikan tersendiri)
34

ALAT HPTLC= HIGH PERFORMANCE

THIN LAYER CHROMATOGRAPHY

 Penotolan

36

37

JALANNYA SINAR (OTIK)

39

HASIL SCANNING SATU BERCAK

Scanning senyawa yang berbeda

Digunakan metode:
Satu persatu dgn lambda serapan maksimumnya.
Cara serentak, dgn menggunakan lambda yang
dapat dimiliki oleh semua senyawa.

Hasil Rekaman

Hasil

 Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda

45

 Scanning serentak beberap puncak/bercak

46

MENGHITUNG WAKTU RETENSI

Rf = a/c (cm)
b/c (cm)

 Contoh 1
Analisis golongan tetrasiklin, dengan fase diam :

seluluse F, Fase gerak : larutan MgCl2 0,25 M.

(Nornendy, 1993).

Kromatogram tetrasiklin dan turunannya dilihat

dibawah sinar UV, 366 nm
1. Isotetrasiklin Rf =0,02 (coklat),
2. Anhidroterasiklin Rf=0,3(merah-ungu)
3. Terasiklin HCl Rf =0,73 (merah ungu)
49
49

H3C

CH3
N

H3C

8
9

CH3

10

11

12

TetrasiklinOH

OH

3
2

OH
C22H24N2O8
O
OH
O

O
C

sda
NH3

Klortetrasiklin

C22H23N2O8Cl

7-Cl

Oksitetrasiklin

C22H24N2O9

5-OH

Penjelasan Tetrasiklin
Turunan tetrasiklin dapat membentuk khelat dengan

logam bervalensi +2 sehingga tidak akan baik bila

digunakan silika gel GF.

Tetrasiklin dapat membentuk ikatan kompleks

dengan Ca++ sehingga tak dapat dielusi sempurna.

Bila digunakan selulusa sebagai fase diam, terdapat

batas kelarutan dalam selulusa, dan terjadi ikatan
hidrogen.

Dengan eluen larutan MgCl2,tetrasiklin dapat

membentuk ikatan kompleks lebih baik dibanding

51
yang lain.
51

Struktur
kimia
Gambar

52
52

 Contoh 2.

Analisis zat warna lipstik, fase diam : silika gel,

fase gerak : campuran n-isopropil etilasetat dan
amoniak 10% (65:75:60) ( Wulan dkk, 1991)

Kromatogram zat warna lipstik

1. Tartasin Rf =0, 12 (merah muda)
2. Kuning AB Rf= 0,48 (kuning)
3. Kuning OB Rf =0,67 (kuning hijau)
4. Oranye I C, Rf=0,88 (putih)
5. Poncou SX, Rf=0,98 (kemerahan)
53
53

Penjelasan Zat Warna

Berdasarkan kepolarannya adalah : tartrazin
poncou, oranye I, kuning AB, kuning OB (paling
kurang larut dalam air).
Fase gerak berupa amoniak 10%, maka tartrazin

kurang larut dalam fase gerak, tetapi mudah larut

dalam pelarut organik. Tartrazin sifat base lebih
kuat, dari pancou sehingga paling lambat
migrasinya dalam suasana basa (amoniak 10%).

Bila zat warna tidak discanner, tetapi bercak

disari kemudian diencerkan etanol sampai 5,0 ml.

Larutan yang didapat diuji dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang
54
serapan maksimumnya:
54

Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif diperlukan senyawa baku

pembanding, dan dibuat kurva regresi linier.

Untuk menguji tetrasiklin yang tidak mengalami

degradasi digunakan cara analisis dengan KLT

Dibuat kurva baku hubungan kadar (mcg/ml) dan luas

puncak (mV).

Data Kadar Luas puncak

0,0 mcg
5 mcg
10 mcg
15 mcg
20 mcg
25 mcg
30 mcg

1,96 mV
8,5468 mV
13,6856 mV
19,0454 mV
23,9754 mV
29,356 mV
38,675 mV

53

Kurva regresi linier normal

Y= 2.396 X + 1.097

56
56

Aplikasi Garis regresi

Persamaan kurva kromatogram yang didapat

pada pengamatan tetrasiklin mempunyai

persamaan regresi linier sebagai berikut:
Y = 0,513 X + 1,487 , R- 0,9996
Contoh menghitung:
Misal luas puncak pada sampel 24,487 mV,
Maka harga X :
= (24,487-1,487): 0,513 = (23)70,513 =44,834 mcg/ ml

57

Untuk analisis kuantitatif zat watna tidak discanner

tetapi bercak disari kemudian diencerkan etanol,
dan diencerkan sampai 5,0 ml.
Cara penyarian, pemisahan dan pengenceran
harus optimal. Untuk membuat kurva baku
diperlukan lempeng yang besar untuk elusi
senyawa baku yang berbeda kadarnya.

58

Yang perlu Diperhatikan Dalam uji Kuantitatif

Hasil penelitian Rhodamin

a. Hasil Uji Kualitatif (benang wol)
No

Nama Sampel

Warna Benang Wol

Hasil
Uji

Kerupuk bunga
(tersanjung)

Merah muda

Kerupuk bawang

Tidak merah muda

Kerupuk ketela

Merah muda

Kerupuk rengginang
ketan

Tidak merah muda

Kerupuk rengginang
beras

Tidak merah muda

Kerupuk slondok

Tidak merah muda

Kerupuk unyil

Merah muda

Kerupuk taro

Tidak merah muda

Kerupuk lotek

Tidak merah muda

10

Kerupuk angin

Tidak merah muda

Hasil kromatogram uji kualitatif Rhodamin B pd UV 254 nm dan

366 nm

Hasil kromatogram uji kuantitatif UV 254 nm dan 366 nm

a. Kerupuk ketela

b. Kerupuk bunga (tersanjung)

c. Kerupuk unyil

A. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk ketela:

1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml)

Luas Area (milivolt)

0,005

0,7092

0,015

0,8493

0,030

0,8582

0,060

2,8790

0,090

3,2248

0,120

4,5278

2. Sampel kerupuk ketela

Replikasi
1

Luas area (milivolt)

1,3010

1,0251

1,1926

1,4120

1,2412

1,0307

0,7282

B. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk bunga

1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml)

Luas area (milivolt)

0,005

0,4425

0,015

1,1420

0,030

1,5273

0,060

3,0667

0,090

4,2450

0,120

5,1967

2. Sampel kerupuk bunga

Replikasi
1

Luas area (milivolt)

2,1328

1,7314

1,2856

1,4730

1,0555

1,0966

0,6985

C. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk unyil

1. standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml)

Luas area (milivolt)

0,005

0,4865

0,015

0,9649

0,030

1,3910

0,060

1,6812

0,090

2,1991

0,120

2,2197

2. Sampel kerupuk unyil

Replikasi
1

Luas area (milivolt)

0,5340

0,7687

0,5636

0,5116

0,5502

Kesimpulan penggunaan HPTLC

a. HPTLC dapat digunakan untuk memisahkan dan
menganalisis campuran senyawa antara 20
sampai 30 senyawa.
b. Biaya pemeliharaan, operasinal, jauh lebih murah
dari HPLC.
c. Cara deteksinya bercak(senyawa) pada lempeng
lebih banyak pilihan dari HPLC walaupun dengan
pereaksi warna.
d. Pemisahan yang terjadi pada HPTLC lebih dari
10 menit, sedangkan HPLC mungkin lima menit
sudah selesai.
e. Ketilitian dan ketepatan mendekati HPLC.
66