Does Lipofuscin Contain Protein?

Amino Acid,
Protein, and Ultrastructural Analysis of Human
Lipofuscin
ABSTRACT
Tujuan: lipofuscin (LF) terakumulasi dalam pigmen retina epitel (RPE) dengan usia dan
mungkin berkontribusi pada patogenesis terkait usia degenerasi makula (AMD). Kami
mencirikan komposisi LF butiran untuk lebih memahami mekanisme lipofuscin pembentukan
dan peran potensial dalam AMD.
Metode: LF diisolasi dari RPE manusia dengan sukrosa kepadatan gradien sentrifugasi dan
dicuci di buffer yang mengandung 0,2% SDS. Bahan tambahan-butiran telah dihapus dari LF
persiapan oleh proteinase K pencernaan. Tercerna dan proteinase K dicerna persiapan LF
dibandingkan dengan mikroskop, dengan analisis asam amino phenylthiocarbamide (AAA)
dan oleh proteomik analisis. Berat kering sampel LF ditentukan sebelum AAA. Untuk
proteomika analisis, persiapan LF menjadi sasaran SDS-PAGE, band gel dipotong dan
protein diidentifikasi oleh LC MS / MS.
Hasil: Analisis mikroskopis Transmisi elektron dari LF tercerna mengungkapkan sekitar bola
butiran dikelilingi oleh ekstra-butiran besar bahan protein. Pencernaan dengan proteinase K
efektif dihapus bahan ekstra-butiran, meninggalkan utuh, puing-bebas butiran LF. AAA LF
menunjukkan bahwa asam amino menyumbang ~ 10% dari berat kering LF tercerna dan ~
2% dari butiran berikut proteinase K pencernaan. Tidak ada protein diidentifikasi dari
proteinase K butiran LF dicerna sementara banyak protein diidentifikasi dari LF tercerna
persiapan. Banyak dari protein yang diidentifikasi dari LF tercerna massa materi pameran
penambahan dan mengandung modifikasi posttranslational jelas.
Kesimpulan: butiran LF Puing-bebas mengandung sedikit atau tidak ada protein. Protein
yang terkait dengan LF pada dasarnya semua ekstra-granular dan tampaknya dimodifikasi
secara signifikan.

INTRODUCTION
Lipofuscin (LF) adalah bahan seluler heterogen dengan fluoresensi karakteristik tidak
dibedakan antara butiran LF dan protein yang hanya co-mengisolasi dengan butiran neon. Di
sini kita melaporkan proteomik, kimia, dan analisis ultrastructural menunjukkan bahwa
puing-bebas butiran LF mengandung jumlah minimal protein / amino asam (~ 2% berat).

Butiran LF puing-bebas yang mengandung A2E dan oksidatif modifikasi dan fototoksik
untuk ARPE 19 sel.

METHODS
RPE lipofuscin Persiapan dan Kuantifikasi: mata manusia diperoleh dari Bristol Eye Bank,
Inggris, dan RPE sel diisolasi dan dibekukan pada -80 C sampai isolasi LF butiran dengan
kecepatan tinggi diskontinyu sukrosa kepadatan gradien sentrifugasi (4). Terpencil butiran
yang selanjutnya dimurnikan dengan dua pendekatan: (i) persiapan LF diobati dengan
proteinase K (10 mg / ml, 24 h / suhu kamar) di 15 mM N-etil asetat morfolina pH 8,3, 2 mM
EDTA, 100 pM BHT, 0,2% SDS; atau (ii) persiapan LF dicuci 6x di 15 mM N-etil asetat pH
morfolina 8.3, 2 mM EDTA, 100 pM BHT, 0,2% SDS. Aliquot dari butiran LF mentah,
proteinase K dicerna butiran LF, dan dicuci butiran LF yang diukur dengan berat kering
sebelum analisis. Butiran juga diukur dengan menghitung pada hemositometer a.
Transmisi Elektron Mikroskopi: persiapan lipofuscin yang tetap dalam campuran 2%
paraformaldehyde, 2,5% glutaraldehid dalam 0,1 M cacodylate penyangga. Pelet dicuci di
buffer yang sama, pasca-tetap dalam 1% OsO4, berurutan dehidrasi dalam etanol dari
tertanam dalam Epon. Mikrograf elektron transmisi diambil pada 20 Tecnai, 200 kV
mikroskop elektron digital menggunakan filter Gatan gambar dan kamera digital di 3600
diameter (5).
SDS-PAGE dan Analisis Barat: persiapan LF diekstraksi dengan kloroform / metanol (2: 1 v /
v) dan kloroform bahan larut disonikasi dan direbus di SDS buffer sampel untuk Western Blot
Slot analisis. Antibodi digunakan dalam analisis Barat termasuk anti-nitrotirosin mAb
(Upstate Bioteknologi, Lake Placid, NY), anti-CEP mAb (5), dan anti-iso [4] LGE2 (7). SDSPAGE dilakukan menurut Laemmli pada 10% gel dan diwarnai dengan koloid Coomassie
biru (Pierce Kode Blue).
Protein Identifikasi. Persiapan LF menjadi sasaran semalam pencernaan tryptic dan
komponen larut difraksinasi dengan pertukaran kation kuat (SCX) kromatografi. SCX fraksi
yang difraksinasi dengan RP HPLC dan melihat ke target MALDI menggunakan Probot
sebuah (LC Packing) dan dianalisis menggunakan model 4800 MALDI TOF-TOF
spektrometer massa (Applied Biosystems). Atau, LF irisan gel SDS-PAGE yang dipotong,
dicerna in-situ dengan tripsin, dan peptida diekstraksi untuk LC MS / MS dengan alat QTOF2
(Waters) (5). Identifikasi protein dari data MS / MS dimanfaatkan Maskot (Matrix Sains)
pencarian mesin dan Swiss-Protein database urutan protein.
Analis Asam Amino. Butiran lipofuscin dari mata manusia menjadi sasaran uap fase HCl
hidrolisis dan analisis phenylthiocarbamide (PTC) asam amino (6) menggunakan Agilent
1100 sistem HPLC.
A2E / iso-A2E Analisis: Crude dan dicuci sampel LF diekstraksi dengan kloroform / metanol
(2: 1). Ekstrak disaring kemudian mengalami RP-HPLC pada Atlantis dC18 kolom (3 m,
4,6 x 150 mm, Waters) di berair TFA / asetonitril pelarut. Sebuah Photodiode Array Detector
(Waters 2996) digunakan untuk pemantauan UV pada 430 dan 510 nm. A2E / iso A2E

diidentifikasi dan diukur berdasarkan UV-absorbansi spektrum dan elusi kali sesuai dengan
standar otentik (8).
Fototoksisitas Assay. Konfluen ARPE-19 sel diberi makan mentah dan dicuci butiran LF
kemudian dipertahankan dalam medium basal. Sel kontrol tidak memiliki butiran. Setelah 7
hari basal media diganti dengan fotosensitizer media bebas dan sel-sel yang dipelihara di
gelap atau terkena cahaya biru (400-500 nm) pada 2,8 mW / cm2, 35 C selama 48 jam.