Ageing-associated changes of lysosomal compartment implications on cellular functions

ABSTRACT
Kompartemen lisosom adalah situs utama untuk degradasi intraseluler. Degradasi lisosom
konstituen sel sendiri, disebut autophagy, tidak hanya menyediakan sel dengan nutrisi, tetapi
juga menghilangkan struktur endogen yang rusak dan berpotensi berbahaya, sehingga
mengamankan homeostasis intraseluler. Di sisi lain, lisosom telah terbukti terlibat dalam
tahap awal apoptosis, dan efek perlindungan dari autophagy telah disarankan untuk beralih ke
kematian sel ketika berlebihan.
Perubahan-Penuaan terkait struktur selular result dari kerusakan yang disebabkan oleh spesies
oksigen reaktif (ROS), yang merupakan terelakkan oleh-produk dari kehidupan aerobik.
Omset intraseluler organel terganggu dan makromolekul, yang lisosomal degradasi
merupakan kontributor utama, tidak berfungsi sempurna, bahkan di bawah kondisi yang
menguntungkan. ini melekat ketidaklengkapan degradasi lisosomal bertanggung jawab atas
akumulasi dari berbagai non-terdegradasi dan fungsional tidak efisien struktur, yang dapat
dianggap biologis "sampah". Biologis "sampah" meliputi rusak makromolekul nonterdegradasi dan organel, serta struktur polimer-seperti non-degradable intralysosomal
disebut lipofuscin, atau usia pigmen. Meskipun akumulasi biologis "sampah" telah
disarankan berbahaya, sedikit yang diketahui tentang mekanisme yang merusak efek.
Untuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik dari perubahan-penuaan terkait lisosomal
yang kompartemen dan pengaruh mereka pada fungsi sel, kami fokus pada belajar: (1) peran
macroautophagy dalam omset organel dan lipofuscin pembentukan; (2) peran biologis
"sampah" akumulasi di pengembangan perubahan-penuaan dan kematian terkait akhirnyapertumbuhan ditangkap, sel postmitotik-seperti; (3) efek sel-protektif kemungkinan mitosis;
(4) pengaruh lipofuscin pada kelangsungan hidup sel selama kelaparan lengkap; dan (5) efek
lipofuscin pada stabilitas lisosom.
Sebagai model induksi biologis "sampah" akumulasi kami menggunakan konfluen fibroblast
manusia diperlakukan dengan autophagy pada inhibitor 3-methyladenine (3MA). Atau,
degradasi lisosomal ditekan dengan menggunakan sistein leupeptin PI, atau cathepsin D
inhibitor pepstatin A. Sebagai model selular sel tua, kami menggunakan lipofuscin-loaded
manusia fibroblas. Lipofuscin-loading dicapai oleh kultur konfluen fibroblas dalam kondisi
hipoksia selama 2-4 bulan. Dengan menggunakan in vitro model, penelitian ini menunjukkan

bahwa: (1) penghambatan hasil autophagy di akumulasi bahan autofluorescent lisosom terkait
dan mitokondria dengan potensi membran rendah; (2) efek yang merugikan dari biologis
"sampah" akumulasi penghambatan berikut autophagy adalah dicegah dengan pembelahan sel
yang terus menerus; (3) sel lipofuscin-loaded lebih tahan terhadap kematian sel kelaparan
diinduksi dari sel kontrol; (4) lisosom fibroblas lipofuscin-loaded yang lebih tahan terhadap
organel-ditargetkan stres maka lisosom sel kontrol.
Berdasarkan hasil penelitian ini kami menyimpulkan bahwa benar beroperasi mesin
autophagic memainkan peran penting dalam mencegah perubahan yang berkaitan dengan usia
terkait dengan akumulasi biologis "sampah". Kami juga menyarankan bahwa proliferasi
terus-menerus adalah mekanisme alami di mana sel-sel mengatasi akumulasi bahan nondegradable, menggunakan cairan mekanik selama pembelahan sel. Akhirnya, kami
memperkenalkan ide lipofuscin menjadi agen hormetic, dan mungkin memiliki beberapa
lisosom-menstabilkan properti. Pemahaman yang lebih baik dari pengaruh usia-terkait
akumulasi biologis "sampah" pada fungsi selular mungkin dapat membantu untuk
pembangunan masa depan anti-penuaan terapi dan pengelolaan usia- patologi terkait.

ABBREVIATIONS
3MA
AMC
ANOVA
AO
BrDU
GAPDH
Hsp
LAMP
LDH
M6PR
MSDH
NADH
NAG
NzQ
PBS
PCD
PI3K
PI
ROS
Tor

3-methyladenine
7-amino-4-methyl-coumarin
analysis of variance
acridine orange
bromodeoxyuridine
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
heat-shock protein
lysosome-associated membrane protein
lactate dehydrogenase
mannose 6-phosphate receptor
O-methyl-serine dodecylamide hydrochloride
nicotinamide adenine dinucleotide (reduced form)
N-acetyl-D-glucosaminidase
5,8-dihydroxy-1,4-naphthoquinone
phosphate buffered saline
programmed cell death
phosphatidylinositol 3-kinase
propidium iodide
reactive oxygen species
target of rapamycin

INTRODUCTION
Lysosomes
General features

Lisosom yang umumnya didefinisikan sebagai organel membran-terikat mengandung banyak

enzim hidrolitik dengan aktivitas enzim optimum pada asam pH. Karakterisasi lisosom
sebagai organel sub-seluler diskrit adalah pertama diuraikan pada tahun 1951 (Berthet et al.,
1951), dan istilah itu sendiri diciptakan pada 1955 (de Duve dkk., 1955). Lisosom hadir di
semua eukariotik benar sel, menempati 0,5-15% dari volume sel, dan terkonsentrasi dekat
dengan mikrotubulus pengorganisasian pusat (Matteoni dan Kreis, 1987; Gambar 1).
SEBUAH berbagai enzim litik, termasuk protease, nucleases, lipase, fosfatase, dan
glycosidases, adalah alasan utama penamaan ini asam organel lisosom, yaitu partikel litik (de
Duve dkk., 1955). Degradatif kapasitas dan rendah pH intra-organel fitur khas lisosom (de
Duve dan Wattiaux, 1966). Lisosom pH disediakan oleh fungsi vacuolar H + ATPase, pompa
yang translocates proton dari sitosol ke lisosom yang (Ohkuma et al, 1982;. Bowman et al,
1988.), dan dipertahankan sekitar pH 4,5 0,5 (Reijngoud dan Tager, 1973; Ohkuma dan
Poole, 1978). Kondisi asam, yang sangat diperlukan untuk aktivitas optimal enzim lisosom,
memungkinkan denaturasi protein mengalami degradasi membantu efisiensi proses
proteolitik.
Ukuran lisosom berkisar antara sekitar 0,5 dan 2 mikrometer (Gambar 1B), dan tergantung
pada konten mereka dan tahap Proses degradasi lisosom (Luzio et al., 2003). lisosom yang
membran diperkaya dalam glikoprotein membran integral, yang dianggap bertanggung jawab
untuk ketahanan lisosomal diri degradasi dari dalam (Winchester, 2001). Meskipun juga
asam, endosomes bertanggung jawab untuk pengiriman bahan endocytosed ke kompartemen
lisosomal, dan dirampas lisosom terkait spesifik protein membran (lampu; Eskelinen, 2006;
Gambar 1A).

Gambar 1. Fluorescent (A) dan elektron (B) mikroskop dari lisosom dalam fibroblas
manusia. Dalam (A) lisosom adalah immunostained untuk lisosom terkait protein membran
(LAMP-2). L, lisosom; Mt, mitokondria; N, inti. Bar skala, 20 m (A) dan 2 m (B).

Fitur lain yang penting yang membedakan lisosom dari endosomes adalah tidak adanya
reseptor manosa 6-fosfat (M6PRs) dan daur ulang reseptor membran plasma (Kornfeld dan
Mellman, 1989;. Luzio et al, 2001).

Biogenesis of lysosomes

Studi terbaru dari Biogenesis lisosom telah mengungkapkan dinamis kompleksitas

kompartemen lisosomal, dan menentang mendominasi dengan pandangan lisosom sebagai
organel degradatif terminal statis jalur endocytic di sel hewan (Luzio et al., 2003). The
endocytosed bahan pertama dikirim ke endosomes awal, kemudian endosomes terlambat dan,
akhirnya, lisosom (Mellman, 1996;. Mukherjee et al, 1997). Untuk menjelaskan mekanisme
penyampaian materi endocytosed dari endosomes terlambat untuk lisosom, hipotesis yang
berbeda telah diusulkan. Pematangan, sebelumnya mengaku sebagai mekanisme yang masuk
akal dari lisosom Biogenesis (Murphy, 1991), biasanya terjadi pada akhir jalur endocytic, dan
tidak dianggap sebagai sarana utama penyampaian materi ke lisosom (Luzio et al., 2003).

Gambar 2. Model tentatif dari lisosom Biogenesis. Didalam model hipotesis dari perpaduan
langsung antara endosomes akhir dan lisosom digunakan. 1, endositosis; 2, mannose 6reseptor fosfat terkait perdagangan vesikular; 3, penyerapan bahan sitosol. [Dimodifikasi
dari Luzio et al, 2003, Mol membr Biol 20:. 141-54]
Mekanisme lain, yang disebut transportasi vesikular, sebagian besar hadir dalam jalur
sekretori dan endocytic (Mellman dan Warren, 2000), dengan sedikit bukti untuk lalu lintas

seperti antara endosomes akhir dan lisosom. Ciuman dan menjalankan "hipotesis (Storrie dan
Desjardins, 1996) menggunakan ide dari diulang sementara fusi dan fisi proses antara dua
organel. Atau, fusi lengkap akhir endosome dan hasil lisosom dalam pembentukan organel
hybrid (Cerah et al, 1997;. Gambar 2) dengan kualitas menengah antara endosomes akhir dan
lisosom (Mullock et al., 1998). Kondensasi berikutnya dari konten dan penghapusan
membran yang berlebihan oleh operator vesikular mengarah pada re-pembentukan lisosom
dari organel hybrid (Pryor et al., 2000). Dengan cara ini, fungsi organel hybrid sebagai
organel pencernaan atau "perut sel" (Griffiths, 1996), dan lisosom dipandang sebagai organel
penyimpanan untuk asam hidrolase (Luzio et al., 2003). Atau, lisosom dapat sekering dengan
autophagosomes dengan pembentukan phagolysosomes auto, yang juga merupakan situs
untuk degradasi intraseluler.

Functions of lysosomes

Degradasi baik material ekstra dan endogen berasal telah dianggap sebagai fungsi utama dari
lisosom (de Duve dan Wattiaux, 1966). Keterlibatan lisosom di degradasi endocytosed servis
bahan tujuan sebagian besar gizi, sedangkan degradasi konstituen sel sendiri, autophagy
socalled, juga mengamankan homeostasis intraseluler melalui penghapusan struktur molekul
rusak dan berpotensi berbahaya dan organel (Klionsky, 2005). Ini juga telah menunjukkan
bahwa kompartemen lisosomal adalah terlibat dalam signaling sel (Miaczynska et al., 2004),
terutama inisiasi kematian sel (Ferri dan Kroemer, 2001).
Ide keterlibatan lisosom kematian sel, tinju disarankan oleh de Duve dan Wattiaux (1966),
telah mendapat dukungan dari penelitian yang menunjukkan bahwa lisosom destabilisasi
adalah peristiwa yang memicu kematian sel yang diinduksi oleh berbagai faktor seperti
radiasi, stres oksidatif, Staurosporine-pengobatan, paparan agen lysosomotropic dan
teroksidasi low-density lipoprotein (Yuan et al, 1997;. Brunk dan Svensson, 1999; Roberg et
al, 1999;.. Li et al, 2000; Johansson dkk., 2003; Persson dkk., 2005). Jenis kematian sel,
diinduksi oleh lisosom destabilisasi, tergantung pada derajat lisosom kerusakan dengan
nekrosis menjadi hasil dari rilis yang luas dari lisosom konten, dan apoptosis maju karena
pecah moderat lisosom (Brunk et al, 2001;.. Zhao et al, 2003).

Autophagy
Definition and characteristics

Autophagy (juga disebut auto fagositosis) adalah evolusi dilestarikan jalur selular untuk
degradasi protein berumur panjang dan organel (Klionsky, 2003). Kata autophagy berasal dari
bahasa Yunani dan berarti untuk makan diri. Fenomena autophagy terjadi di berbagai
eukariotik organisme dari ragi untuk mamalia selama kelaparan, sel dan jaringan
pengembangan, dan kematian sel (Levine dan Klionsky, 2004; Gambar 3). Di sel mamalia,
tiga jenis autophagy diakui tergantung pada cara penyampaian materi mengalami degradasi

ke lisosom, dan termasuk macroautophagy, microautophagy dan pendamping-dimediasi

autophagy (Klionsky dan EMR, 2000; Cuervo, 2004).
Macroautophagy memainkan peran utama dalam degradasi intraseluler dan sering digunakan
sebagai sinonim untuk autophagy (Yoshimori, 2004). Selama macroautophagy, bagian dari
sitoplasma, dan bahkan seluruh organel, yang diasingkan dalam organel ganda membran
disebut autophagosome. Seperti itu organel dikenakan sejumlah perubahan berikutnya
termasuk transformasi membran, pengasaman, dan, akhirnya, fusi dengan lisosom atau akhir
endosomes, dan pembentukan autophagolysosome dari amphistomes, masing-masing
(Fangsrud et al, 2004;. Gambar 2). Meskipun macroautophagy adalah umumnya dianggap
sebagai proses non-selektif (Seglen et al., 1990), telah ada laporan telah autophagy selektif
peroksisom dan mitokondria (Yokota, 1993; Lemasters, 2005). Asal usul dan sifat dari
autophagic yang membran eksekusi (phagophore) masih menjadi bahan diskusi yang sedang
berlangsung dengan dua alternatif yang dipertimbangkan untuk pembentukan phagophore
baik oleh de novo sintesis, atau dengan pemanfaatan membran sitoplasma yang sudah ada
(Fengsrud et al., 2004).
Proses ketika lisosom menyerap komponen sitoplasma di invaginations membran lisosom
didefinisikan sebagai macroautophagy (Dice, 2000). Pencernaan bahan diinternalisasi terjadi
setelah hilangnya membran vesikel. Macroautophagy menyumbang degradasi peroksisom
dan beberapa protein sitosol (Subramani, 19989).

Gambar 3. Elektron mikrograf dari fibroblast manusia menunjukkan vakuola autophagic

(AV). Autophagy diinduksi oleh paparan MSDS deterjen lysosomotropic pada konsentrasi 25
uM selama 60 menit. Mt, mitokondria; N, inti. Skala bar, 2 m.

Pendamping-dimediasi autophagy adalah jalur selektif bertanggung jawab untuk degradasi

protein sitosol tertentu setelah transportasi langsung melalui lisosomal membran dengan cara
chaperone molekul (Cuervo dan Dadu, 1998; Dadu, 2000; Cuervo, 2004). Protein yang
dipilih untuk jenis autophagy, mengandung urutan asam amino tertentu (KFERQ: lisin
fenilalanin-glutamat-arginin-glutamin), yang diakui oleh protein pendamping jenis heat
shock, dan diangkut ke lisosom terkait membran jenis protein 2a (LAMP-2a) untuk
translokasi ke dalam lumen lisosom (Cuervo, 2004).

Regulation

Autophagy adalah proses terus berlangsung, bahkan di bawah yang normal hadir kondisi, dan
diatur oleh agen yang berbeda. Mekanisme regulasi macroautophagy dipahami lebih baik dari
peraturan jenis lain autophagy. Oleh karena itu, mekanisme regulasi, singkatnya dijelaskan
dalam ini tesis, yang bersangkutan sebagian besar macroautophagy, meskipun disebut sebagai
autophagy.
Kekurangan gizi adalah inducer kuat autophagy, sementara asam amino, menjadi produk
akhir dari degradasi autophagic protein, bertindak sebagai negatif regulator umpan balik
(Blommaart et al., 1997). Merupakan bagian penting dari nutrisi regulasi tergantung jalur
adalah serin / treonin kinase Tor (target rapamycin). Penghambatan Tor oleh rapamycin
menginduksi autophagy bahkan di Kehadiran asam amino (Blommaart et al., 1995).
Meskipun sebenarnya Mekanisme regulasi asam amino aktivitas Tor belum dipahami, telah
menunjukkan bahwa aktivasi Tor oleh nutrisi menginduksi fosforilasi protein yang terlibat
dalam langkah awal autophagy, sehingga pembongkaran dan penghambatan autophagy
mereka (Levine dan Klionsky, 2004; Meijer dan Codogno, 2004). Tor juga telah ditemukan
sensitif terhadap deplesi ATP (Dennis et al., 2001).
Selain nutrisi, autophagy juga diatur oleh beberapa hormon terutama insulin dan glukagon.
Aktivasi menginduksi reseptor insulin kegiatan kelas I phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K),
dengan konsekuensi aktivasi kaskade enzim menengah, akhirnya mengakibatkan
upregulation Tor dan penghambatan autophagy (Levine dan Klionsky, 2004). Ada juga telah
dijelaskan reseptor insulin Tor-independen terkait jalur, aktivasi yang menghasilkan
penghambatan autophagy (Saeki et al., 2003). Glukagon, di sisi lain, mengaktifkan autophagy
dengan menghambat Tor melalui terkait Mekanisme protein kinase (Kimball et al., 2004).
Di antara regulator yang berbeda dari autophagy, perhatian khusus diberikan untuk kelas III
PI3K. Aktivasi enzim ini diperlukan untuk penyerapan, awal langkah autophagy (Petiot et al.,
2000). Meskipun sejumlah tambahan protein, seperti protein G heterotrimeric, Ras, protein
kinase A dan B, dan lain-lain, di mana ditampilkan untuk mengatur autophagy, peran dan
mekanisme mereka tindakan belum dipahami dengan baik (Levine dan Klionsky, 2004;
Meijer dan Codogno, 2004).

Autophagy and cell death

Kematian sel terprogram (PCD) memainkan peran penting dalam pemeliharaan organisme
homeostasis dengan mengendalikan jumlah sel dan menghapus sel-sel abnormal (Baehrecke,
2002). Atas dasar morfologi, tiga jenis kematian sel telah dijelaskan (Schweichel dan Merker,
1973; Baehrecke, 2005). Tipe I PCD (atau apoptosis klasik), ditandai dengan seluler
penyusutan, kromatin kondensasi dan fragmentasi inti, membran blebbing, dan terperosok
berikutnya sel mati oleh sel atau makrofag khusus tetangga (Kerr et al., 1972). Ciri khas dari
tipe II PCD (atau kematian sel autophagic) adalah kehadiran dari autophagosomes dan
autophagolysosome (Ogier-Denis dan Codogno, 2003; Bursch, 2004; Edinger dan Thompson,
2004), yang merupakan pelaksana diri degradasi. Tipe III (juga disebut non-lisosomal)
kematian sel mirip nekrosis karena melibatkan pembengkakan organel dan lysosomepembentukan independen "ruang kosong" dalam sitoplasma (Leist dan Jttel, 2001;
Baehrecke, 2005). Namun, perbedaan antara berbagai jenis PCD terkadang sulit untuk
membuat. Dengan demikian, ada penelitian yang menunjukkan bahwa vacuolisation
autophagic mendahului apoptosis klasik (Uchiyama, 2001;. Gonzalez-Polo et al, 2005), dan
yang kedua jenis PCD dapat diamati dalam sel yang sama (Bursch, 2004).
Implikasi dari autophagy di apoptosis telah dijelaskan oleh yang berbeda mekanisme. Dengan
demikian, autophagy ditemukan untuk menyerap seperti pro-apoptosis faktor sebagai
sitokrom c dan AIF, yang dirilis ke sitosol selama permeabilitas transisi mitokondria (TakanoOhmuro et al, 2000;. Elmore et al., 2001). Temuan tersebut menyebabkan saran bahwa
autophagy terutama adalah respon kelangsungan hidup sel untuk apoptosis rangsangan, dan
PCD diaktifkan bila autophagy kelebihan beban (Lemasters et al., 1998). Ide ini konsisten
dengan pengamatan bahwa autophagy cukup aktif memiliki efek menguntungkan pada
kelangsungan hidup sel, tetapi beralih ke sel bunuh diri ketika berlebihan (Edinger dan
Thompson 2004; Gozuacik dan Kimchi 2004; Lockshin dan Zakeri, 2004).
Tipe II PCD dianggap fenomena lama filogenetis (Bursch, 2001), dan ditemukan di kedua
negara fisiologis dan patologis (Orier- Denis dan Codogno, 2003). Bahkan ada saran yang sel
autophagic kematian evolusi didahului apoptosis (Schwartz et al., 1993). autophagic PCD
terutama diaktifkan bila ada kebutuhan sel besar eliminasi, misalnya selama pengembangan
dan renovasi jaringan. Itu Karakteristik penting dari tipe II PCD, yang membedakannya dari
apoptosis, adalah autophagy yang menghilangkan sebagian besar sitoplasma sebelum
perubahan nuklir muncul. Mekanisme ini menjamin kemungkinan penghapusan autophagic
dari konstituen yang rusak pada tingkat sub-seluler, melanjutkan ke penghapusan seluruh sel
jika kerusakan tidak pantas diperbaiki (Bursch, 2004).

Ageing

Defining ageing

Keberadaan berkepanjangan mayoritas sistem yang kompleks, termasuk yang biologis, yang
pasti disertai dengan penuaan. Seperti dilihat oleh ahli biologi, proses terkait kehidupan
penuaan dimulai pada saat pembuahan dan terus sampai mati (Balcombe dan Sinclair, 2001).
Menurut Perpustakaan Nasional of Medicine dan National Institutes of Health, penuaan
adalah dianggap sebagai "perubahan ireversibel bertahap dalam struktur dan fungsi dari
organisme yang terjadi sebagai akibat dari perjalanan waktu ". Perubahan ini umumnya
dipandang sebagai berbahaya, penurunan fungsi normal dan adaptasi, dan sekaligus
meningkatkan kemungkinan kematian (Comfort, 1979).
Mengenai penuaan selular, atau penuaan, penekanan biasanya pada penurunan kemampuan
untuk berkembang biak sebagai akibat dari baik melebihi proliferasi Batas (penuaan
replikatif; Hayflick, 1965; Blackburn, 2000; Weinert dan Timiras, 2003) atau stres seluler
(stress penuaan; Toussaint et al,. 2002; Campisi, 2003; Itahana et al., 2004). Dalam tesis ini,
penuaan selular dianggap sebagai perubahan fungsi dan struktur yang terjadi dalam sel
individu dengan berlalunya waktu.

Oxidative stress and cellular ageing

Dari berbagai teori diperkenalkan dalam rangka untuk menjelaskan mekanisme penuaan
(Medvedev, 1990), ada teori tunggal yang berlaku umum. Antara teori-teori yang diperoleh
paling menarik perhatian adalah teori radikal bebas dari penuaan diusulkan oleh Harman
(1956). Menurut teori ini, penuaan terkait Perubahan struktur seluler result dari kerusakan
yang disebabkan oleh sangat reaktif agen, yang disebut radikal bebas dan didefinisikan
sebagai atom atau molekul mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan.
Molekul tersebut atau ion, dibentuk sebagai akibat dari tidak lengkap pengurangan satu
elektron dari oksigen, secara kolektif disebut spesies oksigen reaktif (ROS), dan merupakan
terelakkan oleh-produk dari kehidupan aerobik (Beckman dan Ames, 1998; Cadenas dan
Davies, 2000). Hipotesis Harman didukung oleh penelitian yang menunjukkan penuaan yang
dipercepat dalam kondisi stres oksidatif, yang merupakan gangguan dalam keseimbangan
antara pro dan antioksidan dalam mendukung mantan (Barja, 2002). Di antara sumber
endogen ROS, mitokondria memainkan peran paling penting, karena pembentukan radikal
bebas yang mau tidak mau ditambah dengan mitokondria terkait fosforilasi oksidatif dan
terjadi bahkan di bawah kondisi yang menguntungkan (Harman, 1972).
Meskipun struktur selular dapat menjadi subjek kerusakan ROS-diinduksi, penurunan
mitokondria dan lisosom fungsi adalah faktor kunci dalam memahami mengapa struktur yang
rusak seperti menumpuk (Brunk dan Terman, 2002). Dengan demikian, kerusakan terus
menerus dari hasil mitokondria bahkan decoupling lebih menonjol dari fosforilasi oksidatif
dan kebocoran ROS. Selain itu, sistem lisosomal dikompromikan tidak dapat secara efektif

menghapus baik struktur yang rusak secara oksidatif atau sumber mereka merusak, yaitu
mitokondria yang rusak, mempromosikan stres oksidatif lebih lanjut (Terman et al., 2006).

Functional characteristics of cellular ageing

Proliferative capacity of ageing cells

Penuaan selular dikaitkan dengan berbagai morfologi dan fungsional keunggulan, dan
sebagian besar dikaitkan dengan apa yang disebut sel postmitotik, seperti neuron dan miosit
jantung (Sachs et al, 1977;. La Velle dan Buschmann, 1983; Terman dan Brunk, 2006). Di
antara perubahan fungsi sel, penurunan potensi proliferatif adalah fitur utama dari sel
penuaan. Usia- penurunan tergantung dari proliferasi sel telah dijelaskan oleh telomere
memperpendek, diperoleh selama pembelahan sel sebelumnya atau paparan stres faktor yang
menyebabkan kerusakan DNA (Von Zglinicki, 2003;. Itahana et al, 2004). Atau dengan
telomere tergantung pemendekan proliferatif kecacatan, telah menunjukkan bahwa p19 /
ARF-p53 dan p16 / PRB jalur, dikenal sebagai mekanisme penekan tumor, proliferasi sel juga
berkurang selama penuaan selular (Campisi, 2001; Itahana et al, 2004).

Autophagy and ageing

Karakteristik fungsional lain penuaan selular adalah autophagic menurun degradasi (Cuervo
dan Dice, 2000; Bergamini et al, 2004.), dan ditambah dengan itu akumulasi progresif bahan
fungsional tidak aktif, jadi- disebut "sampah biologis" (Terman et al., 2006). Ini "sampah",
atau intraseluler "buang" -bahan termasuk rusak non-terdegradasi makromolekul dan organel,
terakumulasi baik intralysosomal, karena degradasi enzimatik lengkap, atau extralysosomally,
sebagai akibat dari penyerapan autophagic rusak. Sejak, mitokondria adalah primer sumber
endogen berasal ROS, daur ulang mitokondria memiliki penting dalam pembentukan dan
akumulasi "sampah biologis" (Brunk dan Terman, 2002). Menjadi awalnya hasil dari lengkap
degradasi autophagic, akumulasi "sampah biologis" akhirnya berkontribusi pada penurunan
kapasitas degradatif seluler, sehingga membentuk sebuah lingkaran setan (Cuervo dkk.,
2005).

Cellular ageing and apoptosis

Kematian sel merupakan hasil tak terhindarkan dari kehidupan terbatas sel-sel normal.
Penuaan memiliki dianggap sebagai pendahulu dari kematian sel, tetapi mekanisme di balik
kematian sel penuaan belum sepenuhnya jelas. Hal ini diketahui bahwa kematian sel mungkin
terjadi dengan apoptosis atau nekrosis. Sementara apoptosis dianggap sebagai diatur, Proses
diprogram, diarahkan pelaksanaan "diam" mati tanpa aktivasi respon inflamasi, nekrosis, di

sisi lain, adalah pasif, respon merusak kerusakan sel akut, disertai dengan reaksi inflamasi
yang ditandai (Kerr et al, 1972;. Wyllie, 1997). Perbandingan antara anggota pro dan antiapoptosis Bcl-2 protein keluarga telah dianggap sebagai faktor penting dalam regulasi
apoptosis (Adams dan Cory, 1998; Antonsson dan Martinou, 2000). Sel penuaan yang
terbukti resisten terhadap apoptosis (Pereira-Smith dan Bertram, 2000). Resistensi ini
memiliki telah ditemukan berkorelasi dengan peningkatan ekspresi Bcl-2 (Warner et al.,
1997) dan aktivitas berkurang dari pelaksana utama apoptosis, caspase-3 (Spaulding et al,
1999;.. Marcotte et al, 2004). Ini juga telah menunjukkan bahwa Sel penuaan menahan
kematian sel terprogram karena ketidakmampuan untuk menekan Bcl-2 (Wang, 1995).
Ketidakmampuan penuaan sel untuk menjalani tergantung p53 apoptosis dalam menanggapi
kerusakan DNA telah disarankan untuk bertanggung jawab atas pergeseran dalam sel jalur
kematian dari apoptosis nekrosis (Seluanov et al., 2001).
Ageing and hormesis

Penuaan umumnya ditandai oleh adaptasi berkurang karena mengumpulkan ketidakcukupan

homeodynamics (Rotan, 2004). Telah hipotesis bahwa stimulasi jalur bertanggung jawab
untuk seluler pemeliharaan dan perbaikan akan menghasilkan peningkatan kemampuan
adaptasi dan meningkat umur. Stres ringan dalam bentuk dosis rendah agen berbahaya telah
terbukti stimulasi sehingga mampu mengaktifkan homeodynamics tanpa menyebabkan
kematian sel. Fenomena seperti respon adaptif terhadap dosis rendah agen dinyatakan
berbahaya disebut hormesis (Rotan dan Clark, 2005). Paparan periode berulang heat shock
ringan dilaporkan memiliki menguntungkan efek anti-penuaan, yang berkaitan dengan
peningkatan kadar berbagai heat shock protein, akumulasi berkurang protein teroksidasi, dan
ditingkatkan aktivitas proteasomal mengakibatkan resistensi stres (Rotan, 1998; Fonagy et
al., 2002; Verbeke et al., 2002). Efek anti-penuaan pembatasan kalori juga dapat dijelaskan
dalam hal hormesis, jika intermiten puasa dipandang sebagai contoh dari stres ringan (Anson
et al, 2003;. Masoro, 2005). Demikian pula, berbagai macam perawatan kimia dan fisik yang
terbukti memiliki sifat hormetic (Calabrese dan Baldwin, 2000; Le Bourg dkk., 2000; Le
Bourg, 2001).

Lipofuscin
Basic features

Perubahan morfologi selama proses penuaan sel termasuk pembentukan pigmen berwarna
kuning kecoklatan, dengan khas spektrum luas autofluorescence (Porta, 2002; Gambar 4).
Pigmen seperti, ditemukan di dalam lisosom, disebut lipofuscin (Terman dan Brunk, 2004;
Gambar 5) ketika usia-terkait, atau ceroid, ketika akumulasi mereka dipengaruhi oleh kondisi
patologis (Porta, 2002; Seehafer dan Pearce, 2006).

Gambar 4. lipofuscin terkait autofluorescence pada manusia fibroblas terdeteksi

menggunakan mikroskop confocal (488 nm laser). Akumulasi lipofuscin dipercepat oleh
kultur sel di 40% oksigen selama dua bulan. Skala bar, 20 pM.

Lipofuscin yang biasa disebut "pigmen usia". Ini adalah gabungan struktur polimer, terdiri
dari cross-linked protein oksidatif diubah dan residu degradasi lipid. Lipofuscin juga
mengandung karbohidrat dan beberapa logam, yang besi adalah yang paling penting, karena
implikasinya di Fenton-jenis kimia dan pembentukan radikal bebas (Terman dan Brunk,
2004). Fitur yang paling khas dari lipofuscin, meskipun perbedaan yang Komposisi antara
jenis sel yang berbeda, adalah bahwa semua pigmen lipofuscin yang terdegradasi. Ini
mungkin karena pembentukan struktur polimer seperti kompleks selama silang peptida
(Kikugawa et al., 1989).

Gambar 5. Elektron mikrograf dari fibroblast manusia menunjukkan sejumlah lipofuscin

mengandung lisosom (Lf). Akumulasi lipofuscin dipercepat oleh kultur sel di 40% oksigen
selama dua bulan. N, inti. Skala bar, 1 m.

Mechanisms of formation and accumulation

Lipofuscin bisa berasal dari kedua intra (di sebagian besar sel postmitotik) dan bahan
ekstraseluler, misalnya di makrofag, sel glial dan pigmen retina epitel (Burke dan Skumatz,
1998; Siddiqi dan Peters, 1999). auto The / bahan phagocytosed dikirim ke lisosom, tetapi
proses degradasi tampaknya inheren tidak sempurna, dan menghasilkan lisosom antar
akumulasi produk non-terdegradasi. Endogen membentuk hidrogen peroksida bebas berdifusi
melalui membran lisosom dan menyebabkan radikal kerusakan auto / phagocytosed
biomolekul. Seperti disebutkan sebelumnya, pada lisosom rendah pH redoks besi aktif
mempromosikan pembentukan radikal hidroksil melalui reaksi Fenton, juga menyebabkan
kerusakan radikal dan meningkatkan resistensi bahan intralysosomal ke lisosom enzim
dengan formasi final Struktur terdegradasi, yaitu lipofuscin (Terman dan Brunk, 2004;
Terman dan Brunk, 2006).

Physiological effects

Memiliki hipotesis kerja yang lipofuscin sendiri mungkin berpartisipasi dalam pembentukan
radikal bebas mengubah lama mendominasi pandangan lipofuscin sebagai "tidak bersalah"
penanda penuaan selular (Terman dan Brunk, 2004). Demikian, telah menunjukkan bahwa di
pigmen retina sel epitel lipofuscin akumulasi mengurangi kapasitas fagositosis (Sundelin et
al., 1998). Dalammodel yang sama lipofuscin selular bertindak sebagai fotosensitizer,
terutama ketika gembira dengan cahaya biru, menyebabkan destabilisasi lisosomal dan
kematian sel (Wihlmark et al., 1997). Ini juga telah menunjukkan bahwa akumulasi lipofuscin
meningkatkan kerentanan fibroblast untuk oksidatif stres diinduksi kerusakan lisosom dan
kematian sel berikutnya (Terman et al., 1999). Selain itu, telah menyarankan bahwa baru
diproduksi enzim lisosom adalah salah tempat ke lisosom lipofuscin-dimuat dalam upaya
efektif untuk menurunkan lipofuscin, melepaskan diri mereka dari fungsi yang berguna
mereka di dalam lisosom lipofuscin bebas (Terman dan Brunk, 2004). Meskipun disajikan
bukti, efek buruk dari lipofuscin belum berlaku umum(Porta et al., 2002).

AIMS OF THE STUDY

Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mempelajari perubahan-penuaan terkait
kompartemen lisosomal dan pengaruh mereka pada fungsi sel. Tujuan khususnya adalah
untuk menentukan:
Paper I
- Sumber lipofuscin dalam fibroblas manusia
- Lokasi intraseluler struktur lipofuscin seperti mengumpulkan selama penghambatan
autophagy
- Peran macroautophagy dalam omset organel dan pembentukan lipofuscin
Paper II
- Peran biologis "sampah" akumulasi dalam pengembangan penuaan terkait perubahan dan
akhirnya kematian sel postmitotik
- Kelayakan efek perlindungan dari pembelahan sel

Paper III
- Karakteristik kematian sel berikut kelaparan lengkap
- Pengaruh lipofuscin pada kelangsungan hidup sel selama kelaparan lengkap
Paper IV
- Efek lipofuscin pada stabilitas lisosom

MATERIALS AND METHODS

Cells
Penuaan terutama mempengaruhi sel postmitotik berumur panjang seperti neuron dan miosit
jantung. Konfluen sel pertumbuhan ditangkap menyerupai postmitotik benar sel dan secara
luas digunakan untuk studi penuaan. Dalam penelitian ini, manusia Fibroblas AG-1518 (yang
diperoleh dari Coriell Institute, Camden, NJ, USA; Makalah I-IV) dan astrosit U-1160CG
(hadiah semacam Profesor Bengt Westermark, Departemen Patologi, Universitas Uppsala,
Swedia; Kertas II) yang digunakan.
Sel tumbuh di bawah kondisi hipoksia dikenal untuk mempercepat usia terkait perubahan dan
akumulasi lipofuscin (Terman dan Brunk, 1998; Grune et al., 2005). Dalam rangka untuk
menginduksi akumulasi lipofuscin konfluen manusia fibroblas (Papers I-IV) terkena hipoksia
(40% O2, 55% N2 dan 5% CO2) selama dua-lima bulan dan disebut sebagai lipofuscinloaded.
Experimental design*
Sel tumbuh di bawah kondisi hipoksia dikenal untuk mempercepat usia terkait perubahan dan
akumulasi lipofuscin (Terman dan Brunk, 1998; Grune et al., 2005). Dalam rangka untuk
menginduksi akumulasi lipofuscin konfluen manusia fibroblas (Papers I-IV) terkena hipoksia
(40% O2, 55% N2 dan 5% CO2) selama dua-lima bulan dan disebut sebagai lipofuscinloaded.

Paper I

Konfluen budaya fibroblast AG-1518 didistribusikan di lima kelompok: (i) budaya konfluen
awal; (ii) sel dikultur dalam kondisi normal untuk dua minggu; (iii) sel dikultur dalam kondisi
hipoksia selama dua minggu; (iv) sel dalam kondisi normal terkena 5 mM autophagy
inhibitor 3-methyladenine (3MA) selama dua minggu; (v) sel dalam kondisi hipoksia terkena
5 mM 3MA selama dua minggu. Perbandingan dilakukan antara non sel diperlakukan dalam
kondisi normal dan kelompok lain serta antara kelompok yang berbeda.
Autophagy-menghambat efek 3MA disebabkan penghambatan kelas III phosphatidylinositol
3-kinase (PI3K). Aktif PI3K kelas III diperlukan bagi penyerapan, tahap awal autophagy
(Petit et al., 2000).

Paper II

U-1160CG astrosit dan fibroblas lipofuscin-loaded didistribusikan di kelompok berikut: sel

konfluen tidak diobati; sel konfluen diobati dengan 5 mM 3MA selama dua minggu; subkonfluen sel yang tidak diobati; 3MA-diperlakukan sub sel konfluen. Fibroblas AG-1518
didistribusikan di kelompok yang sama ditambah tambahan: sel konfluen diobati dengan 5
mM 3MA selama dua minggu, kemudian sub-dibudidayakan dalam kondisi 3MA-paparan
(sel 3MA-diperlakukan dilepaskan dari confluency); sel konfluen diobati dengan 50 pM dari
lisosom sistein protease inhibitor leupeptin selama 10 hari; leupeptin- sel sub-konfluen
diobati. Perbandingan dilakukan baik antar kelompok yang berbeda dalam model selular yang
sama dan antara kelompok masing-masing model seluler yang berbeda.
Berbeda dengan 3MA pengobatan terkait pencegahan autophagic penyerapan, leupeptin
mengganggu degradasi intralysosomal dari auto phagocytosed material. Kami berspekulasi
bahwa pengobatan dengan 3MA akan terutama mempercepat akumulasi ekstra lisosom
"sampah", sementara leupeptin-pengobatan akan sebagian besar mengakibatkan akumulasi
intralysosomal "buang" -bahan. Dengan cara ini, pendekatan yang berbeda untuk percepatan
biologis "sampah" pembentukan dipekerjakan.

Paper III

Sel dibagikan dalam kelompok berikut: (i) fibroblast normal (disebut sebagai kontrol); (ii)
fibroblast lipofuscin-loaded; (iii) fibroblast yang normal pra terkena 5 mM 3MA selama 24
jam; (iv) fibroblast yang normal pra-terkena 100 pM dari cathepsin D inhibitor pepstatin A
selama 24 jam. Di semua kelompok kelaparan diinduksi oleh paparan sel untuk phosphatebuffered saline (PBS) untuk interval waktu yang berbeda (24, 48, 72 dan 96 jam). Selama
kelaparan, sel-sel dalam kelompok (iii) dan (iv) terkena 5 mM 3MA dan 100 pM pepstatin A,
masing-masing. Perbandingan dilakukan antara lipofuscin dimuat dan sel non-loaded dalam
kaitannya dengan titik waktu di mana perubahan signifikan telah terjadi.
Pepstatin perlakuan A diperkenalkan untuk menghambat enzim lisosom cathepsin D,
diketahui terlibat dalam tahap awal apoptosis (Roberg et al., 1999). Pepstatin A juga
seharusnya meniru hipotetis lipofuscin terkait penghambatan cathepsin D.

Paper IV

Dua kelompok sel dibandingkan: fibroblas normal (disebut sebagai kontrol) dan lipofuscinloaded. Kedua kelompok yang terkena tiga perlakuan yang berbeda: (dalam) MSDS deterjen
lysosomotropic pada konsentrasi 25 pM selama 15, 30 atau 60 menit; (ii) redoks-bersepeda
kuinon naphthazarin (inducer stres oksidatif akut) pada konsentrasi 0,75 pM selama 15, 30

atau 60 menit dan; (iii) vacuolar ATPase inhibitor bafilomycin A1 pada konsentrasi 20 nM
selama 15 atau 30 menit.
Perawatan yang dipilih menggunakan mekanisme yang berbeda dari tindakan, dan
memungkinkan pendekatan multifaset untuk mempelajari stres lisosom bertarget. Dengan
demikian, MSDH- dan NzQ-pengobatan menyebabkan perubahan struktural dalam membran
lisosom dengan menginduksi modifikasi deterjen-seperti dan oksidatif, masing-masing,
akhirnya menghasilkan lisosom kebocoran atau pecah. Atau, bafilomycin A1- pengobatan
mempengaruhi pengasaman lisosom tanpa perubahan jelas integritas membran lisosom
(Bowman et al., 1988).

Assessment of cellular autofluorescence

Jumlah bahan lipofuscin-seperti diperkirakan dengan pengukuran autofluorescence seluler
(Paper I). Untuk kuantifikasi autofluorescence, gambar laser scanning non-confocal budaya
hidup diperoleh. Tidak seperti gambar confocal, yang merupakan bagian optik, non-confocal
gambar mewakili sel utuh. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan National Institute of
Health Program Gambar (http://rsb.info.nih.gov/nih- gambar/). Intensitas fluoresensi telah
dinyatakan dalam satuan sewenang-wenang (au) makhluk produk dari nilai pixel rata-rata per
sel (termasuk latar belakang) dan sel daerah (Terman et al., 1999). Dari setiap spesimen 90140 dipilih secara acak sel dianalisis.
Co-localisation of autofluorescent material with lysosomes
Co-lokalisasi bahan autofluorescent dengan lisosom adalah diperkirakan dengan
perbandingan gambar autofluorescent dengan gambar lisosom baik immunostained untuk
cathepsins (D atau L; FITC-conjugated sekunder antibodi) atau amat diwarnai dengan
fluorochrome lysosomotropic acridine orange (AO). Kedua jenis pencitraan yang dilakukan
pada sel-sel berlapis kacamata penutup Chambered dengan daerah bawah ditandai (lingkaran
sekitar 1 mm). Selama pencitraan berulang (deteksi autofluorescence, diikuti oleh lisosom
pewarnaan), sel-sel yang sama diidentifikasi dan sasaran penyelidikan. Sejak FITC dan AO
fluoresensi yang jauh lebih terang dari lipofuscin seperti autofluorescence, itu memungkinkan
atenuasi sinar laser ke level ketika lipofuscin tidak terdeteksi, tidak memberikan kontribusi
bagi fluoresensi terdeteksi selama lisosom pewarnaan. 90 sel minimum per sampel dianalisis
(Paper I).

Assessment of proliferative potential

Potensi proliferatif diperkirakan dengan deteksi imunositokimia Sintesis DNA (Paper II).
Bromodeoxyuridine (BrdU) menggabungkan ke dalam nuclear- dan mitokondria-DNA bukan
timidin selama replikasi dan memperbaiki (Davis dan Clayton, 1996). Sementara deteksi
mtDNA replikasi biasanya membutuhkan paparan BrdU selama 12 jam, eksposur untuk 60
menit sudah cukup untuk mendeteksi replikasi DNA nuklir. Menurut ini, sel-sel yang terkena
15 pM BrdU selama 60 menit, tetap di 4% formaldehida dalam PBS selama 20 menit di 4C.
Setelah Permeabilisasi dan denaturasi DNA, sel yang terkena monoklonal anti tikus Antibodi
BrdU, diikuti oleh pengobatan dengan kelinci anti-tikus FITC- antibodi terkonjugasi. Sel-sel
kemudian dibilas dengan PBS dan air suling, dipasang di Vectashield, dan mengalami
mikroskop fluoresensi (biru eksitasi cahaya) dan pencitraan. Sel dengan pewarnaan BrdU
terang inti dianggap BrdU-positif (Gambar 6). 100 sel minimum dari masing-masing
spesimen dianalisis.

Gambar 6. Nuclei fibroblas immunostained untuk BrdU. BrDU- negatif (A) atau BrdU-positif
(B) inti. Skala bar, 20 pM.

Detection of cell death

Kedua metode morfologi dan biokimia yang digunakan untuk mendeteksi kematian sel.
Untuk estimasi morfologi sel apoptosis, formaldehida-tetap sel menjadi sasaran fase kontras
(Makalah II dan III) dan fluoresensi mikroskop (Kertas II). Penyusutan seluler, pyknosis dan
nuklir fragmentasi dianggap khas untuk sel apoptosis. sel kematian- perubahan morfologi
terkait, diungkapkan oleh gabungan Hoechst / propidium iodida pewarnaan vital, dianalisis
baik oleh in situ mikroskop fluoresensi (Kertas II) atau dengan aliran cytometry (Paper III).
Deteksi biokimia dari kematian sel termasuk penilaian aktivitas caspase-3-seperti (Paper III).

Hoechst/Propidium iodide staining

Menggunakan kombinasi dari Hoechst dan propidium iodida (PI) pewarnaan yang berbeda
jenis kematian sel dapat diidentifikasi. Hoechst noda kromatin kental sel apoptosis lebih
intens dari kromatin inti normal. PI meresapi hanya sel dengan gangguan membran plasma,
dan dengan demikian noda inti sel nekrotik. Vital pewarnaan, dengan campuran 5 ug / ml
Hoechst 33342 dan 1 mg / ml PI selama 20 menit di atas es, dilakukan baik di situ (Paper II)
atau pada sel yang telah trypsinized, disentrifugasi pada ~ 300 xg selama 5 menit, kembali
ditangguhkan dalam media kultur dan disaring melalui sel 70 pM saringan (Paper III). Dalam
kasus yang pertama, analisis Hoechst / PI pewarnaan dilakukan dengan menggunakan
mikroskop fluoresensi (330-380 / 420 nm dan 510-560 / 590 filter eksitasi / penghalang nm
untuk Hoechst dan PI pewarnaan, masing-masing), sementara dalam kasus yang terakhir sel
diwarnai dianalisis oleh aliran cytometry (UV / biru eksitasi ganda, dan 380 nm panjang lulus
dan 575 filter penghalang 26 nm untuk pengukuran emisi fluoresensi dari Hoechst dan PI,
masing-masing).

Gambar 7. Fluoresensi mikroskop fibroblas Hoechst-bernoda. NN, inti normal; Ho +,

Hoechst-positif (juga terfragmentasi) inti dari apoptosis sel menjalani. Skala bar, 20 pM.

Selama analisis gambar neon, sel-sel yang normal menunjukkan layak rendah intensitas
Hoechst-pewarnaan. Sebaliknya, sel-sel mati dengan kental, dan di beberapa kasus
terfragmentasi, inti, dipamerkan intens Hoechst-pewarnaan (Gambar 7). Semacam
pewarnaan, jelas lebih terang dari yang dari inti utuh, adalah Dianggap Hoechst-positif.
Menurut pola Hoechst / PI positif pewarnaan, sel dibagikan dalam tiga kelompok: (i)
Hoechst-positif saja sel, dianggap sebagai menjalani tahap awal apoptosis; (ii) PI-positif
hanya sel, dianggap sebagai nekrotik; (iii) sel dengan gabungan Hoechst dan PI positif,

dinilai sebagai sel dalam tahap nekrosis pasca-apoptosis (Weber et al., 1997). Delapan puluh
sampai 120 sel yang dipilih secara acak dari setiap spesimen yang dianalisis.
Selama aliran analisis cytometric, dua populasi sel yang terjaga keamanannya sesuai dengan
intensitas Hoechst / PI pewarnaan. Sel menunjukkan intensitas rendah dari pewarnaan
dianggap layak, sementara mereka dengan intensitas yang lebih tinggi dianggap sebagai sel
yang mengalami apoptosis atau nekrosis pasca-apoptosis. 10.000 sel dari masing-masing
sampel dianalisis.

Caspase-3-like activity assay

Caspases dikenal sebagai pelaksana utama apoptosis klasik. Untuk menilai aktivitas caspase3-seperti (Paper III), lisat sel diinkubasi dengan fluorophore urutan substrat terkonjugasi (AcDEVD-AMC). fluoresensi intensitas dibebaskan AMC (7-amino-4-metil-kumarin) pada
caspase pembelahan substrat antara D dan AMC diukur dengan spektrofotometer dan
dinyatakan sebagai mol AMC dirilis per miligram protein per jam. Kandungan protein diuji
menggunakan metode yang dijelaskan oleh Lowry (Lowry et al., 1951).

Lysosomal integrity assays

Decrease of lysosome-associated red fluorescence of acridine orange

Akridin oranye (AO) adalah basa lemah lysosomotropic dengan fitur metachromatic (Koenig,
1963; Robbins, 1963). Bentuk oligomer yang sangat terkonsentrasi dan terprotonasi AO
(AOH +) ditemukan dalam lisosom utuh dan menunjukkan fluoresensi merah. Lisosom
alkalinisasi dan translokasi konten lysosomal hasil sitosol dalam pembentukan monomer
yang bentuk terdeprotonasinya AO dengan fluoresensi hijau (Olsson et al., 1989). Itu tingkat
kebocoran lisosom diperkirakan sebagai penurunan lysosome- terkait fluoresensi merah AO
(Kertas IV). Sel pada cover-slip yang sebentar diwarnai dengan 5 mg / ml AO selama 15
menit di bawah budaya yang normal kondisi, dibilas dalam medium lengkap dan terkena
tepat perawatan. Setelah diperoleh gambar neon dari sel-sel (cahaya biru eksitasi), lisosom
terpisah dijiplak dan pengukuran lisosomal merah AO-fluoresensi dilakukan dengan
menggunakan Institut Nasional Kesehatan Program image (http://rsb.info.hih.gov/nihimage/). Fluoresensi Intensitas dinyatakan dalam unit sewenang-wenang (au) menjadi produk
yang bernilai pixel rata-rata per lisosom dan daerah lisosom. Dari 100-140 lisosom dari setiap
spesimen dianalisis.

Immunocytochemical detection of location of cathepsin D

Cathepsin D biasanya hadir di dalam kompartemen lisosomal. Kami menggunakan cathepsin

D sebagai "enzim penanda" meskipun cathepsin lain juga dilepaskan dari lisosom dengan
integritas membran terganggu. sel dengan lisosom utuh menunjukkan kasar (lisosom-seperti)
pola cathepsin D immunostaining. Destabilisation membran lisosom disertai dengan
translokasi cathepsin D ke sitosol, sehingga difus (sitosol) pola pewarnaan. Fibroblas berlapis
pada cover-slip diproses untuk immunocytochemistry setelah diperbaiki di 4% formaldehid
dalam PBS selama 20 menit di 4C. Inkubasi dengan poliklonal kelinci anti-manusia antibodi
untuk cathepsin D diikuti oleh paparan kambing anti-kelinci IgG Alexa 594 terkonjugasi.
Setelah itu, sel-sel dibilas di PBS dan air suling, dipasang di Vectashield, dan mengalami
mikroskop fluoresensi dan pencitraan (Makalah III dan IV).
Detection of cytosolic fraction of cathepsin D

Ekstraksi dari sitosol dilakukan dengan menggunakan agen kolesterol-solubilising digitonin

seperti yang dijelaskan di tempat lain (Johansson et al, 2003;. Kertas IV). Secara singkat,
konsentrasi rendah digitonin permeabilise plasma kaya kolesterol membran, sedangkan
membran kolesterol buruk misalnya lisosom tetap kurang lebih utuh. Konsentrasi digitonin
yang dioptimalkan untuk menghasilkan rilis maksimum sitosol laktat dehidrogenase (LDH).
LDH-kegiatan juga diukur untuk memverifikasi jumlah yang sama diekstraksi sitosol di
semua sampel, dan spektrofotometri diperkirakan sebagai penurunan absorbansi pada 340 nm
dari nicotinamide adenin dinukleotida (NADH) selama pengurangan LDH-katalis dari piruvat
menjadi laktat. Integritas lisosom selama digitonin-pengobatan diverifikasi oleh penilaian
lisosom yang enzim, N-asetil-D-glucosaminidase (NAG), aktivitas, yang sesuai dengan
fluoresensi dari dibelah NAG-substrat (4-Methylumbelliferyl-2- asetamido-2-deoksi--D
glucopyranoside) pada panjang gelombang eksitasi 356 nm dan dari panjang gelombang
emisi 444 nm.
Paparan sel untuk ekstraksi penyangga (250 mM sukrosa, 20 mM Hepes, 10 mM KCl, 1,5
mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA dan digitonin di konsentrasi 25 ug / ml) selama 12
menit di atas es diikuti oleh koleksi supernatan dan pengendapan protein dengan cara
pengobatan dengan 5% perklorat asam di atas es selama 10 menit dan sentrifugasi
selanjutnya di ~ 20.800 x g selama 15 menit. Protein pelet kemudian mengalami
imunoblotting. Sebuah mouse monoclonal cathepsin anti-manusia D antibodi primer, dan
kambing anti-tikus antibodi sekunder peroxidase-conjugated lobak digunakan untuk analisis
western blot. Band divisualisasikan menggunakan Western blotting Luminol Reagen.
Pemuatan sama diverifikasi oleh menyelidik membran dengan antibodi dehidrogenase tikus
anti-gliseraldehida-3-fosfat (GAPDH).

Lysosomal pH measurement

PH rendah adalah ciri khas dari lisosom (De Duve dan Wattiaux, 1966) dan merupakan
perwakilan dari integritas fungsional lisosom (Chen, 2002; Nilsson et al., 2003). PH lisosom
diukur dengan aliran cytometry sebagai dijelaskan di tempat lain (Nilsson et al, 2003;.
Makalah III dan IV). Secara singkat, sel-sel pre-loaded dengan dekstran FITC-terkonjugasi
menjadi sasaran yang tepat perawatan. Setelah itu, sel trypsinized, disentrifugasi pada ~ 300
xg selama 5 menit, kembali ditangguhkan dalam media kultur, disaring melalui sel 70 pM
saringan dan dianalisis oleh aliran cytometry. Sebuah 488 nm argon laser digunakan untuk
eksitasi FITC, dan emisi terdeteksi di FL1 dan FL2 saluran menggunakan 530 28 nm dan
610 20 filter penghalang nm, masing-masing. Data dari 10.000 sel dianalisis. Modifikasi
buffer Britton-Robinson (pH 4.0- 7.0) digunakan untuk persiapan kurva standar. Rasio FL1 /
FL2 digunakan untuk menghitung pH menggunakan kurva standar (Gambar 8).

Gambar 8. Contoh dari kurva standar yang diperoleh untuk pH lisosom.

Statistical analysis
Semua percobaan diulang setidaknya tiga kali. Nilai-nilai yang diberikan sebagai sarana
S.D. Perbandingan statistik dari data pH lisosom dibuat menggunakan Kruskal-Wallis dan
post hoc uji Mann Whitney. Data yang diperoleh dari percobaan lain dianalisis menggunakan
ANOVA dan post hoc uji LSD. P-nilai <0,05 dianggap signifikan.

RESULTS AND DISCUSSION

Paper I
Dalam penelitian ini, budaya konfluen dari fibroblast manusia AG-1518 terkena hipoksia
dan / atau autophagy inhibitor 3-MA selama dua minggu. Pengobatan jangka panjang dengan
3-MA dimungkinkan karena toksisitas relatif rendah obat, dan memungkinkan akumulasi
struktur selular non-autophagocytosis untuk dipelajari. Kami berspekulasi bahwa identifikasi
bahan non-terdegradasi mengumpulkan akan memberikan informasi mengenai sumber
lipofuscin dalam fibroblas manusia.
Lipofuscin-like material accumulates following exposure to hyperoxia
and/or 3-MA

Paparan dari konfluen fibroblast budaya sampai 40% ambient oksigen atau 3-MA, tetapi
terutama kombinasi keduanya, yang diproduksi ditingkatkan autofluorescence dibandingkan
dengan sel kontrol, dipertahankan dalam kondisi normal dan hanya menampilkan
peningkatan terkait usia autofluorescence. mengakumulasi bahan dipamerkan lipofuscinseperti spektrum luas autofluorescence berikut eksitasi dengan ultraviolet, biru, atau hijau
muda. Meskipun menyerupai umum, berkaitan dengan usia lipofuscin, bahan mengumpulkan
memiliki beberapa karakteristik morfologi tertentu diungkapkan oleh elektron studi
mikroskopis. Dengan demikian, kerapatan elektron dari vakuola mengandung bahan
mengumpulkan lebih rendah dibandingkan dengan inklusi lipofuscin. Beberapa vakuola ini
juga berisi ruang elektron-berkilau dan urat saraf-seperti struktur.

Inhibition of autophagy increases the number of lysosomes and

mitochondria with low membrane potential

Lisosom ditemukan lebih berlimpah di 3-MA sel terkena daripada di kontrol. Karena paparan
3-MA tidak mengubah endosomal akhir kompartemen (sebagai disimpulkan dari tidak adanya
perubahan yang cukup di MPR immunoreactivity), yang jauh lebih kecil dari wilayah yang
diduduki oleh autofluorescent lisosom penanda-positif butiran (lihat bagian berikutnya), itu
menyarankan bahwa itu terutama lisosom dewasa yang terakumulasi berikut blok autophagy.
Ini konsisten dengan elektron Temuan mikroskop, menunjukkan bahwa sebagian besar
vakuola mengumpulkan selama 3- MA paparan tidak memiliki struktur multivesicular, khas
untuk akhir endosomes (Luzio, et al., 2003).
Paparan 3-MA juga disebabkan peningkatan moderat umum di nomor mitokondria, terutama
mereka yang memiliki potensi rendah membran dalam. Dari tingkat mikroskopis elektron,
mitokondria dari 3-MA diperlakukan sel ditampilkan perubahan serupa dengan yang

ditemukan dalam sel-sel penuaan, yaitu sebagian kental matriks dan melebar krista. Temuan
ini sesuai dengan sebelumnya penelitian yang menunjukkan bahwa berkepanjangan 3-MA
pengobatan menginduksi akumulasi struktur selular dikeluarkan dari daur ulang (Terman et
al., 2003).
Lipofuscin-like autofluorescence in 3-MA treated cells co-localises with
lysosomes

Bahan Autofluorescent, akumulasi selama dua minggu-paparan 3-MA, colocalized dengan

lisosom, seperti disimpulkan dari kesamaan pola autofluorescence dengan immunostaining
untuk cathepsins D dan L, dan pewarnaan vital dengan AO sel yang sama.
Sejak lipofuscin dianggap sebagai pigmen intralysosomal, yang dibentuk dari bahan dikirim
ke lisosom sebagian besar dengan cara autophagy (Brunk et al, 1992;. Terman dan Brunk,
2004), akumulasi diamati lisosom yang mengandung bahan lipofuscin-seperti dalam kondisi
menghambat autophagy dapat dijelaskan jika kemungkinan autophagy lisosom adalah
dipertimbangkan. Istilah "xylophagy" awalnya digambarkan mikroskop elektron
Temuan dari lisosom pelagica membran (de Duve dan Wattiaux, 1966; Glaumann et al.,
1981) muncul setelah lisosom fusi atau microautophagy, dan dianggap sebagai bukti
membran parsial daur ulang (Marzella et al, 1981;. Lloyd, 1996). Dalam terang baru-baru ini
Temuan, "autophagy" bisa menggambarkan tidak hanya kelebihan cairan-fase autophagy,
tetapi juga macroautophagy massal-fase seluruh lisosom. Gagasan lisosom autophagy
didukung oleh imunoelektron sebelumnya Temuan mikroskopis protein membran lisosom
dalam lisosom (Barriocanal et al., 1986), dan asam fosfatase kegiatan positif membran-terikat
struktur dalam autophagosomes setelah vinblastin diinduksi blok fusi (Miettinen dan
Reunanen, 1991).
Pengurangan diamati dari Golgi kompleks dan penurunan immunostaining untuk prokolagen
di 3-MA sel diperlakukan dapat dianggap contoh berbahaya efek dari bahan terakumulasi
pada fungsi seluler. Undegraded bahan mengumpulkan karena penghambatan berkepanjangan
autophagy, terutama bila dikombinasikan dengan stres oksidatif kronis, mungkin dipandang
sebagai biologis "Sampah" biasanya ditemukan dalam sel-sel penuaan (Sheldrake, 1974;
Hirsch, 1978; Terman, 2001). Kesamaan temuan ini untuk umum penuaan terkait Perubahan
menekankan kesesuaian model sel yang digunakan dalam penelitian ini untuk penuaan
penelitian.
Paper II
Penuaan selular dikaitkan dengan akumulasi progresif fungsional bahan yang tidak efisien
sering disebut biologis "sampah" atau "sampah" (Terman, 2001). Biologis "sampah" termasuk
extralysosomally lokal kerusakan struktur molekul non-degradable dan organel, misalnya
"raksasa" mitokondria, dan bahan polimer dicerna intralysosomal disebut lipofuscin. Dalam
rangka mempercepat biologis "sampah" akumulasi, Ag 1518 fibroblast manusia (sarat dengan

lipofuscin atau tidak) dan U-1160CG astrosit yang terkena autophagy inhibitor 3-MA selama
dua minggu. Atau, degradasi intralysosomal terhambat di AG-1518 fibroblas dengan cara
paparan lisosom sistein PI leupeptin selama 10 hari. Kami berhipotesis bahwa proliferasi sel
akan mencegah "sampah" akumulasi dengan pengenceran mekanik, dan meningkatkan sel
kelangsungan hidup dengan mengurangi konsentrasi berpotensi berbahaya "sampah".

Confluent cells frequently die following prolonged inhibition of autophagy

Dalam semua model sel yang digunakan dalam penelitian ini, kematian sel spontan bahkan
dalam diobati budaya konfluen terdeteksi. Jumlah sel mati meningkat signifikan berikut
penghambatan autophagy. Dibandingkan dengan non-loaded sel, fibroblas lipofuscin-loaded
ditampilkan penurunan kurang jelas dari kelangsungan hidup setelah pengobatan dengan 3MA. Sel mati berikut berkepanjangan paparan leupeptin terkandung dalam jumlah besar
autofluorescence lipofuscin- seperti bahan dan menunjukkan fragmentasi nuklir khas
apoptosis. di sel sekarat berikut 3-MA pengobatan, penelitian mikroskop elektron
mengungkapkan apoptosis seperti kondensasi kromatin dan fragmentasi nuklir,
dikombinasikan dengan sejumlah besar vakuola sarat dengan bahan Undegraded.
Sub-cultivation increases proliferation of both untreated and3-MA exposed
fibroblasts

Kedua lipofuscin-loading dan 3-MA pengobatan berkurang sub-budidaya proliferasi

diinduksi, yang, bagaimanapun, tetap secara signifikan lebih tinggi daripada dalam budaya
konfluen. Paparan 3-MA tidak menyebabkan penurunan lebih lanjut dari potensi proliferatif
sudah dikompromikan di lipofuscin dimuat fibroblas sub-konfluen.

Sub-cultivation improves viability of cells under conditions of inhibited

autophagy

Dalam semua model sel "sampah" sel akumulasi disajikan dalam penelitian ini, sub-budidaya
mengakibatkan penurunan yang signifikan dalam jumlah sel-sel mati, bahkan ketika subbudidaya dikombinasikan dengan paparan terus-menerus terhadap inhibitor autophagy. Efek
perlindungan dari sub-budidaya, meskipun masih signifikan, itu kurang diucapkan dalam
lipofuscin-loaded fibroblas mungkin karena potensi proliferasi mereka menurun.
Penurunan disajikan viabilitas sel akibat penghambatan berkepanjangan autophagy dan
akumulasi terkait biologis "sampah" konsisten dengan gagasan bahwa akumulasi "limbah"
bahan kompromi seluler fungsi (Terman et al, 1999;. Terman, 2001; Terman dan Brunk,
2006). Ide ini didukung oleh temuan sebelumnya kematian progresif jantung miosit berikut 3MA penghambatan diinduksi autophagy (Terman et al., 2003). Efek merugikan dari "sampah"
akumulasi dapat dijelaskan oleh toksisitas produk oksidasi protein (Goldberg, 2003;. Grune et

al, 2004), dan peningkatan jumlah ROS dihasilkan oleh rusak mitokondria (Sohal et al.,
1995). Atau, dengan menduduki tertentu jumlah ruang fisik di dalam sel, biologi "sampah"
bisa mengganggu sinyal intraseluler, transportasi dan metabolisme.
Efek menguntungkan dari proliferasi sel mungkin karena dilusi berbahaya non-degradable
"sampah" selama mitosis, yang menyediakan lebih atau distribusi kurang lebih sama bahan
antara sel anak. Kontinu kerja dari mekanisme tersebut bisa menjadi satu-satunya
kemungkinan untuk sel untuk melarikan diri penuaan terkait perubahan dan akhirnya
kematian. Dalam perjanjian dengan ini Ide adalah temuan penggantian terus-menerus dari
semua sel dalam primitif organisme Hydra, diketahui kekurangan fitur dari penuaan
(Martinez, 1998). Secara keseluruhan, hasil penelitian ini mendukung "sampah" teori
akumulasi penuaan dan menekankan peran pembelahan sel sebagai anti-penuaan alami
mekanisme.

Paper III
Dari berbagai induser kematian sel, kelaparan lengkap terpilih karena kebanyakan "fisiologis"
satu. Dalam penelitian ini, manusia fibroblas AG-1518, normal dan mereka pra-berbudaya
dalam kondisi hipoksia untuk menginduksi akumulasi lipofuscin, terkena phosphate-buffered
saline (PBS) hingga 96 jam. Sejak lisosom telah terbukti terlibat pada tahap awal kematian
sel terprogram (Yuan et al, 1997;. Brunk dan Svensson, 1999; Roberg et al., 1999; Li dkk.,
2000; Ferri dan Kroemer, 2001; Johansson dkk., 2003; Persson dkk., 2005), kami
berspekulasi bahwa lipofuscin-loading, 3-MA penghambatan diinduksi autophagy, atau
inhibisi enzim lisosomal cathepsin D dengan pepstatin A akan mengganggu fungsi lisosom
yang dapat mempengaruhi sensitivitas sel kelaparan-diinduksi kematian sel.

Lipofuscin-loaded cells endure complete starvation

Dalam sel kontrol, peningkatan yang signifikan dalam jumlah sel-sel mati terjadi setelah 72
jam dari kelaparan lengkap. Dibandingkan dengan kontrol, kematian sel adalah ditunda
sampai 96 jam di pepstatin A sel diobati, dan dipercepat dalam sel terkena 3-MA (diamati
setelah 48 jam paparan PBS). kematian sel terhambat dalam sel lipofuscin-load, dan
peningkatan yang signifikan dalam jumlah sel yang mati tidak ditemukan bahkan setelah 96
jam dari kelaparan.

Caspase-3 activity declines during starvation

Caspase-3 kegiatan, hadir di beberapa tingkat basal dalam sel non-kelaparan, menurun
selama kelaparan. Selanjutnya caspase-3 re-aktivasi ditemukan bertepatan dengan waktu

peningkatan yang signifikan dalam persentase sel-sel mati di sesuai kelompok eksperimen.
Tidak ada perubahan signifikan dalam caspase-3 aktivitas selama 96 jam dari kelaparan yang
diamati pada sel lipofuscin-loaded. Temuan ini dari tingkat signifikan lebih rendah dari basal
caspase 3 aktivitas dalam sel lipofuscin-loaded dibandingkan dengan kontrol ini sesuai
dengan laporan sebelumnya yang menunjukkan berkurang caspase-3 kegiatan dalam penuaan
sel (Spaulding et al, 1999;. Marcotte et al,. 2004).

Starvation is associated with lysosomal alkalinisation

Lisosom alkalinisasi terjadi di kedua kontrol dan lipofuscin-loaded sel, tetapi lebih diucapkan
di bekas. Peningkatan yang signifikan dari pH lisosom dalam sel kontrol ditemukan
bertepatan dengan waktu peningkatan yang signifikan dalam persentase sel-sel mati dalam
kelompok itu (setelah 72 jam kelaparan). Hal ini konsisten dengan keterlibatan dilaporkan
sebelumnya dari lisosom alkalinisasi di apoptosis (Nilsson et al., 2003). Penting, kontrol dan
sel lipofuscin-loaded ditampilkan pH lisosom yang sama sebelum memulai kelaparan.

Starvation-induced cell death is associated with relocation of cathepsin

D to the cytosol

Immunostaining untuk cathepsin D mengungkapkan relokasi enzim ke sitosol setelah 72 jam

karena kelaparan, yang bertepatan dengan titik di waktu yang meningkat signifikan dari
persentase sel-sel mati di kelompok kontrol ditemukan. Dalam sel-sel mati, studi mikroskop
cahaya mengungkapkan dramatis Penurunan volume sitoplasma tanpa perubahan jelas nuklir
morfologi. Sebaliknya, sel-lipofuscin dimuat diawetkan yang normal morfologi dan lisosom
pola cathepsin D pewarnaan.

Hyperoxia does not induce overexpression of Hsp70

Stres ringan, termasuk stres oksidatif ringan, dianggap sebagai penggerak dari sistem
bertanggung jawab untuk pemeliharaan dan perbaikan sel, dan merupakan dasar hormesis
(Rotan dan Clark, 2005). Efek perlindungan dari eksposur diulang stres ringan telah
ditemukan terkait dengan peningkatan ekspresi panas- shock protein, yaitu Hsp70 (Fonagy et
al, 2002;.. Hercus et al, 2003). Di penelitian ini tidak ada perubahan jelas dalam ekspresi
Hsp70 ditemukan berikut paparan 40% ambient oksigen untuk sampai 4 bulan. Hal ini sesuai
dengan temuan yang dilaporkan sebelumnya menunjukkan penurunan ekspresi dan
inducibility protein heat-shock dengan usia lanjut (Njemini et al., 2002; Jin dkk., 2004;
Starnes et al., 2005).
Perbedaan antara PCD tipe I, atau apoptosis klasik ditandai dengan aktivasi caspase, dan
PCD tipe II, atau kematian sel autophagic, tidak selalu jelas (Bursch, 2001; Lockshin dan

Zakeri, 2004). Menurut saat ini Temuan, kematian sel kelaparan-diinduksi dikaitkan dengan
penyusutan terkenal sitoplasma sebelum perubahan nuklir jelas, yang khas untuk kematian sel
autophagic (Bursch, 2001). Di sisi lain, temuan bahwa penghambatan autophagy dengan 3MA dipercepat kematian sel-sel kelaparan berpendapat terhadap sifat autophagic kematian sel
kelaparan-diinduksi. Sebagai tambahan, kondensasi kromatin nuklir, diamati pada sel-sel
mati, lebih karakteristik untuk apoptosis dan nekrosis pasca-apoptosis (Weber et al., 1997).
Akhirnya, meskipun peran caspases di sel terprogram kelaparan-diinduksi kematian tidak
sepenuhnya jelas, aktivasi mereka juga lebih khas untuk apoptosis (Bursch, 2004; Edinger
dan Thompson, 2004). Karena kemungkinan simultan co-eksistensi dari kedua jenis PCD
dalam sel yang sama (Bursch, 2004; Mills et al., 2004), kita tidak menentukan jenis kematian
sel terdeteksi di pelajaran ini.
Temuan ini dari respon kematian sel menurun dari lipofuscin-loaded sel berada dalam
perjanjian dengan pandangan bahwa sel-sel penuaan mengembangkan resistensi terhadap
apoptosis. Alternatif untuk mekanisme dijelaskan sebelumnya di balik ini resistensi (Wang,
1995; Spaulding et al, 1999;. Pereira-Smith dan Bertram, 2000; Marcotte et al., 2004), yang
tak lama dibahas dalam Pendahuluan, yang Efek hormetic (Rotan dan Clark, 2005) dari
tingkat moderat lipofuscin adalah juga mungkin. Kami selanjutnya berspekulasi lipofuscin
yang mungkin menstabilkan lisosom kompartemen melalui tarik enzim lisosom,
menonaktifkan mereka translokasi ke sitosol selama PCD. Ide ini didukung oleh Temuan ini
kematian sel tertunda di fibroblas dengan cathepsin terhambat Kegiatan D. Secara
keseluruhan, hasil penelitian ini menjamin pandangan novel akumulasi lipofuscin sebagai
mekanisme untuk pelestarian integritas seluler dengan mengorbankan fungsi dan reaktivitas
umum.

Paper IV
Berdasarkan temuan kami sebelumnya peningkatan resistensi dari lipofuscin-loaded sel untuk
kematian sel kelaparan tersebut, kita berspekulasi bahwa anti-apoptosis Pengaruh lipofuscin
adalah karena stabilisasi lisosom dan, dengan cara ini, pencegahan PCD-memicu dalam
kondisi stres lisosom. Dalam urutan untuk menguji apakah lipofuscin bisa mempengaruhi
stabilitas lisosom, manusia AG-1518 fibroblas pertumbuhan ditangkap (lipofuscin-load
dibandingkan sel non-loaded) adalah terkena lisosom bertarget stres yang disebabkan baik
oleh lysosomotropic sebuah deterjen (MSDS; Li et al, 2000.) atau stres oksidatif akut oleh
paparan redoks-bersepeda kuinon-pengobatan (NZQA;. Roberg et al, 1999). Selain itu,
integritas fungsional dari lisosom terkena paparan vacuolar ATPase inhibitor bafilomycin A1
(Bowman et al., 1988).

MSDH-induced lysosomal destabilisation activates autophagy

Paparan MSDH mengakibatkan diucapkan vacuolation autophagic diamati pada kedua

tingkat elektron dan cahaya-mikroskopis. Kami berspekulasi bahwa peningkatan autophagy
bisa dilihat sebagai respon seluler adaptif di untuk membatasi kerusakan yang disebabkan
oleh kebocoran proton dan proteolitik enzim ke dalam sitosol karena gangguan membran
lisosom. Gagasan ini sesuai dengan peran yang disarankan sebelumnya autophagy
vacuolation dalam perlindungan homeostasis intraseluler (Henics dan Wheatley, 1999).
Dengan cara ini, vacuolisation autophagic, meskipun hadir di kontrol dan fibroblas
lipofuscin-load, tapi kurang menonjol di Yang terakhir, bisa menjadi tanda dari tingkat yang
lebih rendah kerusakan lisosom di lipofuscin- sel dimuat.
Lysosomal destabilisation following the organelle-targeted stress is
more pronounced in control than in lipofuscin-loaded fibroblasts

Lisosom destabilisasi secara signifikan lebih diucapkan dalam kontrol dari pada fibroblas
lipofuscin-load, terutama selama NZQA-pengobatan ketika sel lipofuscin-loaded tidak
menunjukkan tanda-tanda penurunan lisosom. Penurunan jumlah lisosom, menyusul organelditargetkan stres, juga ditemukan karakteristik untuk kontrol tetapi tidak untuk lipofuscinloaded sel.
Menurut temuan ini penurunan sensitivitas lipofuscin dimuat lisosom stres organelditargetkan, kami berhipotesis bahwa fenomena yang diamati adalah karena intra lisosom
lipofuscin. Kami selanjutnya berspekulasi bahwa tergantung lipofuscin lisosom stabilisasi
dapat dijelaskan oleh mekanisme tentatif berikut:
- Pendudukan Tetap situs aktif enzim lisosom oleh non-degradable (tapi ditargetkan untuk
degradasi) lipofuscin, yang mencegah translokasi enzim untuk sitosol selama stres lisosom.
Ide ini, berdasarkan hasil sekarang menurun translokasi sitosol cathepsin D di lipofuscinfibroblas dimuat, adalah sesuai dengan temuan kami sebelumnya peningkatan resistensi sel
lipofuscin-loaded kelaparan-diinduksi kematian (Paper III).
- Proton-menjebak karena struktur polimer dari lipofuscin mengandung jumlah tinggi
kelompok OH-, yang berpotensi mampu bereaksi dengan H +. Ide ini didasarkan pada hasil
ini penurunan alkalinisasi sitosol dalam sel lipofuscin-loaded berikut paparan MSDH, NzQ,
dan, terutama, spesifik vakuola ATPase inhibitor bafilomycin A1 (Bowman et al., 1988). Ide
ini juga didukung oleh temuan kami sebelumnya menurun lisosom alkalinisasi di fibroblas
lipofuscin-dimuat selama kelaparan (Paper III).
- Lipofuscin adalah situs tarik radikal bebas. Ini mungkin menjelaskan resistensi yang tinggi
diamati sel lipofuscin-loaded untuk akut stres oksidatif.
Secara keseluruhan, hasil penelitian ini mendukung ide kami menyarankan sebelumnya
lisosom-menstabilkan sifat lipofuscin.

CONCLUSIONS AND FUTURE PERSPECTIVES

Ide diperkenalkan dari lisosom autophagy (Paper I) menganggap kemungkinan degradasi
lisosom sebagai keseluruhan organel. Mekanisme tentatif yang disajikan menyediakan baik
omset lebih efisien dari membran lisosom, jika dibandingkan dengan daur ulang parsial
berikut lisosom fusi atau autophagy mikro, dan alternatif cara pengiriman enzim lisosom ke
situs degradasi yang sedang berlangsung.
Benar mesin autophagic operasi telah terbukti memainkan peran penting dalam mencegah
perubahan yang berkaitan dengan usia yang terkait dengan (dan tergantung pada) akumulasi
disebut biologis "sampah" (Makalah I dan II). Biologis "sampah" didasari atas dua kelompok
non-degradable struktur intraseluler: bahan polimer seperti yang dikenal sebagai lipofuscin,
dan non- autophagocytosis rusak bio-molekul dan organel. Paling Perbedaan penting antara
keduanya, dalam pandangan saya, adalah bahwa yang pertama adalah compartmentalised ke
lisosom, sedangkan yang kedua terletak di sitosol. Menurut penelitian ini, biologi "sampah"
mengumpulkan sebagai hasil dari autophagy dihambat adalah merugikan bagi sel (Papers I
dan II), mungkin karena efek racun dari protein teroksidasi dan, terutama, mitokondria yang
rusak, yang belum diasingkan dari sitosol (Paper I). Proliferasi terus-menerus bisa menjadi
mekanisme alami dimana sel mengatasi akumulasi bahan non-degradable, mempekerjakan
pengenceran mekanik selama pembelahan sel (Paper II).
Di sisi lain, lipofuscin intralysosomal, meskipun juga non-degradable materi tetapi dihapus
dari situs di mana mesin apoptosis adalah melepaskan, bisa dilihat sebagai penanda
kerusakan sel yang memiliki berhasil bertahan. Dengan cara ini, penuaan sel, ditandai dengan
akumulasi lipofuscin, akan dipandang sebagai proses yang berkelanjutan untuk mengatasi
kerusakan konstituen seluler oleh salah degradasi berpotensi struktur berbahaya, atau
penghapusan mereka ke topologi yang berbeda kompartemen. Selain itu, lipofuscin telah
ditemukan untuk mengekspresikan lysosome- menstabilkan sifat (Papers III dan IV) dan
untuk meningkatkan kelangsungan hidup sel dalam kondisi stres (Paper III). Dengan
demikian, pandangan baru pada lipofuscin adalah diperkenalkan, meskipun mekanisme efek
sel-protektif lipofuscin, jika ada, masih soal spekulasi dan bertujuan untuk masa depan
investigasi.
Dalam rangka untuk lebih memahami pengaruh perubahan yang berkaitan dengan usia dari
lisosom kompartemen pada fungsi seluler, penelitian lebih lanjut diperlukan. Dengan
demikian, gagasan disajikan mungkin omset lisosom melalui autophagy makro (Paper I)
membutuhkan lebih banyak bukti untuk sepenuhnya dikonfirmasi. Kemungkinan untuk
mempertimbangkan lipofuscin sebagai agen hormetic mendesak lebih lanjut Penelitian
difokuskan pada menemukan hubungan antara jumlah lipofuscin dan dampaknya pada fungsi
sel, terutama lisosomal stabilitas. Mengingat heterogenitas disebut biologis "sampah",
penyelidikan lebih lanjut dari efek fisiologis / patologis komponen yang berbeda dari

"sampah" - bahan yang dibutuhkan. Memahami mekanisme dan konsekuensi dari usiaakumulasi terkait biologis "sampah" mungkin dapat membantu untuk masa depan
pengembangan terapi anti-penuaan dan manajemen penyakit terkait usia.