Serum albumin (SA) adalah protein yang paling banyak pada plasma darah mamalia.

Karena konsentrasi dan banyaknya tempat ikatan, SA merupakan transporter utama senyawa
endagen, termasuk lemak, horman, dan ion logam (Peters, 1995). Banyak obat yang banyak
digunakan seperti warfarin, diazepam, dan ibuprofen juga terikat pada SA. Pengikatan pada
SA dapat meingkatkan kelarutan menurunkan pembentukan agregat dan meningkatkan waktu
paruh obat. Namun, obat degan afinitas yang tinggi dengan SA membutuhkan dosis yang
lebih tinggi untuk mencapai efek yang diinginkan. Seperti yang telah diungkapkan
sebelumnya dalam penelitian kristalografi, drug site 1 (Sudlow site I) berada dalam
subdomain IIA dan drug site 2 (Sudlow site II) di subdomain IIIA. Wang et al. (2013)
menunjukkan beberapa obat kanker berikatan pada sisi subdomain IIB, dan sisi ini diusulkan
untuk menjadi binding site ketiga. Selain berikatan dengan binding site utama, beberapa obat
juga ditemukan berikatan dengan sisi ikatan asam lemak. Studi kristalografi telah
menunjukkan Sembilan sisi ikatan asam lemak pada SA, tujuh yang mengikat rantai panjang
asam lemak (FA1-7) dan dua untuk asam lemak rantai pendek ( FA 8 dan FA 9). Ketiga sisi
ikatan tumpang tindih dengan sisi ikatan asam lemak; sisi obat 1 tumpang tindih dengan FA7,
sisi obat 2 dengan FA3/FA4 dan sisi obat 3 dengan FA1. Oleh karena itu, semua sisi ikatan
FA dianggap sebagai sisi ikatan obat yang potensial.
Cetirizine merupakan reseptor antagonis histamine H1 yang digunakan untuk
mengobati alergi musiman. Citrizine adalah antihistamin generasi kedua yang menunjukkan
efek samping minimal pada system saraf pusat dan mengurangi tingkat kardiotoksisitas.
Cetirizine secara fisiologis sebagai zwitter ion, dan strukturnya sangat berbeda jika
dibandingkan dengan antagonis reseptor H1 generasi pertama. Ini merupakan campuran
rasemat dari dua enansiomer, levo-cetirizine (R-cetirizine) dan dextro-cerizine (S-cetirizine).
Konsentrasi terapetik dalam darah, sekitar 90% cetrizin berikatan pada protein plasma,
terutama SA. Ada beberapa upaya untuk memprediksi sisi ikatan cetirizine pada SA.
Beberapa port yang diprediksikan dimana cetirizine berikatan adalah pada sisi obat 1, sisi
obat 2, atau keduanya.
Dalam penelitian ini peniliti menyajikan struktur kristal SA mamalia, serum albumin
kuda (ESA), yang membentuk kompleks dengan cetirizine. Dalam struktur ini, cetirizine
terikat pada dua sisi yang ditandai sebagai CBS1 dan CBS2 pada ESA dan serum albumin
manusia (HSA) menggunakan fluorescence tryptophan quenching (TFQ). Peneliti juga
membandingkat ikatan cetirizine oleh ESA dan HSA dengan memeriksa konservasi structural
pada sisi ikatan. Hipotesisnya adalah bagaimana ikatan cetirizine dipengaruhi oleh adanya
asam lemak dan membahas akibat dari glikasi SA pada transport cetirizine. Selain itu,

diberika juga gambaran kapasitas sisi ikatan SA berdasarkan semua struktur kristal SA yang
ada dalam PDB.
Metode
2.1. Bahan
Cetirizine dihidroklorida. ESA dan HSA, yang berupa serbuk defatted terlipofilisasi.
Setelah melarutkan protein albumin dalam larutan air, konsentrasinya diukur menggunakan
spektrofotometri dengena mengukur absorbansinya pada 280 nm.
2.2. Penentuan sturktur
2.2.1. Pemurnian dan kristalisasi protein
ESA dilarutkan dalam 10 mM buffer Tris pH 7,5 dan 150 mM buffer NaCl, dan
selanjutnya dimurnikan dengan kolom Superdex 200 yang terikat pada sistem filtrasi gel
FPLC toan AKTA pada 21 C. Fraksi yang mengandung protein monomer dengan BM 55-60
kDa digabung dan dipekatkan sampai 30 mg/mL. Kristal ESA bawaan di peroleh dengan
difusi uap hanging-drop pada 24 cawan. Cawan diatur secara manual dan diamati dibawah
mikroskop. Kristal terdisfraksi tumbuh setelah 1 hari dengan larutan reservoir yang tediri dari
100 mM Tris HCl pH 7.5, 1800 mM (NH 4)2SO4, 87.5 mM NaBr, 2.5% w/v PEG 8 K. kristal
direndam dengan 100 mM stok cetirizine,100 mM buffer Tris pH 7,4 dengan konsentrasi
akhir cetirizine sekitar 10 mM. Kristal didinginkan dengan minyak mineral sebagai
krioprotektan.
2.2.2. Pengumpulan data, penentuan struktur, pemurnian, dan validasi
Data difraksi ESA dalam kompleks dengan cetirizine dikumpulkan pada panjang
gelombang yang sesuai dengan batas absorbansi selenium (12670 eV), dari kristal tunggal
pada 100 K. Struktur diselesaikan dengan penggantian molekul menggunakan struktur asli
protein ESA sebagai model. Peta densitas electron awaldan model diperoleh dengan HKL3000 yang terintegrasi MOLREP dan program tambahan dari paket CCP4. Parameter
perpindahan atom dimodelkan dengan menggunakan B-factor isotropic tunggal dengan
paramerisasi TLS untuk menggambarkan perpindahan anisotropic atom tersebut. Data
statistic parameter dan pemurnian struktur dirangkum pada Tabel 1.
2.3. Pengujian Trypthophan quenching
2.3.1. Preparasi sampel
ESA dan HSA dilarutkan dalam buffer PBF (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 90 mM
Na2HPO4+, dan 16,2 mM KH2PO4, pH 7,4) dan selanjutnya dimurnikan dengan krmatografi
ekslusi ukuran pada 4 C. Fraksi yang sesuai dengan protein monomer digabung dan
dipekatkan. Sebagian ESA murni didialisis dalam dua buffer tambahan: 100 mM HEPES

dengan 150 mM NaCL pH 7,4 dan 100 mM buffer Tris dengan 150 mM NaCl pH pH 7,4
selama semalam, digunakan untuk menguji pengaruh buffer terhadap pengikatan cetirizine.
Cetirizine dilarutkan dalam buffer yang sama dengan protein untuk mecapai dua
konsentrasi akhir, 10 dan 7,5, dan pH nya masing-masing disesuaikan pada 7,4 agar sedekat
mungkin dengan kondisi fisiologis. Masing-masing stok cetirizine dilarutkan 1:1 dengan
dapar secara berurutan 14 kali, memberikan 30 seri pengenceran yang semuanya digunakan
untuk pegujian TFQ. Sebelum pengujian TFQ, larutan protein dan cetirizine disaring
menggunakkan membrane filter 0,1 um, dan dicampur dengan perbandingan 1:1.
2.3.22. Model yang digunakan untuk penentuan konstanta disosiasi cetirizine dengan
TFQ
Karena konsentrasi total albumin yang digunakan lebih rendah dibandingkan
konsentrasi total cetirizine, maka digunakan model TFQ sederhana, dianggap bahwa
konsentrasi ligan bebas mirip dengan konsentrasi ligan yang ditambahkan.F adalah
fluoresensi yang diukur, F0 adalah fluoresensi protein tanpa ligan, Fc fluoresensi plotein
kompleks, Kd adalah kontanta ikatan dan [L] adalah konsentrasi ligan. Saat persaamaan 1
diselesaiakan untuk F, dimana f = F0 - Fc/F0 adalah efisiensi quenching maka didapatkan

Cetirizine tidak banyak mengabsorbsiemisi triptofan pada panjang gelombang 340

nm. Namun, absorbansi pada panjang gelombang eksitasi 280 nm terjadi secara signifikan,
khususnya cetirizine konsentrasi tinggi, dan koreksi harus diterapkan untuk menyesuaikan
peningkatan hasil flouresensi karena peningkatan konsentrasi ligan. Koreksi ini
mengkompensasi penurunan fluoresensi karena pIFE dengan mengalikan pengukuran
Ap

fluoresensi dengan factor koreksi G.

1e
A p + Al
( A + A )
1e
G=
Ap
p

. Ap adalah absorbansi

protein pada 280 nm dan Al adalah absorbansi ligan pada 280 nm.
2.3.3. Pengukuran Triptofan quenching
Intensitas fluoresensi triptofan diukur pada 37 C. ESA dan HSA dengan konsentrasi
albumin 6,1 uM dipilih berdasarkan pengujian preliminary. Konsentrasi cetirizine
divariasikan dari 0,23 uM sampai 5 mM. intensitas fluoresensi albumin untuk setiap
konsentrasi cetirizine dirata-rata dari tiga replikasi. Nilai rata-rata dari ketiga pengukuran

flouresensi cetirizine dalam larutan control (tanpa protein) yang dikurangi sebagai koreksi
latar belakang dari setiap konsentrasi cetirizine. Experimental error diperkirakkan sebagai
strandar deviasi dari nilai yang diperoleh. Nilai absorbansi untuk perhitungan koreksi pF
diukur dari sampel yang sama. Ap diukur dengan konsentrasi cetirizine=0 dan Ap+Al direkam
untuk setiap konsentrasi cetirizine dengan adanya protein. Setelah itu factor koreksi G untuk
setiap konsentrasi cetirizine dihitung dan nilai intensitas fluoresensi dikalikan dengan factor
koreksi. Model TFQ disesuaikan dengan metode regresi non linier ke data eksperimental
yang telah dikoreksi dengan software Origin 6.
2.4. Analisis urutan dan struktur
PyMOL digunakan untuk menempatkan struktur dan menghasilkan gambar. Nilai
RMSD dihitung menggunakan fungsi PyMOL dengan set parameter siklus nol (command:
align mobile structure, target structure, cycles = 0, transform = 0). BioEdit digunakan untuk
memanipulasi dan merepresentasikan urutan. Dalam literature, penomoran residu selalu
mengacu pada urutan penomoran HSA agar lebih sederhana.
2.5. Analisis sisi ikatan ligan pada SA
Struktur Albumin digunakan untuk analisis sisi ikatan digunakan tiga pendikatan.
Pertama, menggunakan struktur HSA untuk menemuka struktur dengan Z-value lebih dari 9.
Daftar hasil dari 142 rantai dikurangi menjadi 132, kecuali rantai protein dengan lipatan
berbeda dari albumin. Kedua, alat PDB digunakan untuk mencari struktur dengan 30% urutan
yang sama dalam 103 struktur (147 rantai). Ketiga, PDB mencari semua record dengan
mengertikkan serum albumin dalam kolom molecule name. gabungan dari tiga pendekatan
menghasilkan satu set 151 rantai yang unik. Hanya rantai yang terikat ligan dengan lebih 5
atom non hydrogen yang dianalisa lebih lanjut (93 rantai).
3. Hasil
3.1. Keseluruhan lipatan dan kualitas struktur
Kristal ESA dalam kompleks dengan cetirizine mengadopsi gugus ruang P61 dan
terdifraksi resolusi 2,15 A. Keseluruhan lipatan sama dengan struktur asli dan
memperthankan bentuk jantung kanonik. Struktur dapat dibagi menjadi 3 domain homolog:
I (residu 1-195, penomoran merujuk pada HSA), II ( 196-383) dan III (384 -585), masingmasing berisi dua subdomain ( A dan B), masing-masing terdiri dari 4 dan 6 alfa-heliks.
Model murni memiliki gometri secara keseluruhan yang baik dengan presentase
outliner rotamen yang sangat rendah dan score MolProbily clash yang rendah (Tabel 1).
Struktur ridak memiliki outliner plot Ramachandean. Perdasarkan urutan asam amino, protein
yang matang mengandung 582 residu. Berbeda dengan struktur PDB Equus caballus yang

telah disimpan, ditemuak satu titik mutasi tunggal, R561A. Rantai samping arginin yang
panjang tidak dapat dimodelkan dalam posisi ini karena bentrokan sterik dengan ikatan
disulfide terdekat yang menghubungkan Cys567 dan Cys558. Berdasarkan database NCBI,
mutasi ini adalah ciri khas Equus ferus przewalskii, subspecies langka kuda liar dari Asia
tengan. Namun ada kemungkinan bahwa da kesalahan dalam urutan SA Equun caballus, atau
mutasi yang termati memang secara alami terjadi pada spresies.
3.2. Sisi ikatan cetrizine dalam albumin serum kuda
Defatted ESA digunakan untuk kristalisasi untuk mencegah kompetisi secara
potensial antara cetirizine dan asam lemak pada sisi ikatan yang sama. Sisi ikatan cetirizine
yang pertama (SBS1) terletak dalam kantong yang berada di antara subdomain IA dan IB,
dimana cetirizine terjepit di antara heliks h2 dan h3 dari subdomain IA, dan h2 dari IB. sisi
ini hidrofobik karena ada 7 residu yang sangat hidrofobik. Dua cincin aromatic dari molekul
cetirizine terkunci dalam kantong ikatan karena interkasi hidrofobik. Atom OD1 dan OD2
dari Asp132, yang terletak pada pembukaan celah ikatan, membentuk jembatan garam yang
kuat kea tor nitrogen NAF dari cincin piperazine dan menstabilkan cetirizine pada posisi ini.
Gugus karboksilat dari cetirizine menjorok keluar dari kantong dan berinteraksi dengan
salinan protein asimetris. Atom oksigen dari gugus karboksilat dari membentuk jembatan
garam dengan atom nitrogen NE2 dari His338 dengan salinan protein simetris, yang
mengunci ekor dalam konformasi.
Dilihat kecocokan dengan 2mFo-DFcomit map, B-factor atom klorida, dan nilai RSR
peneliti hanya memodelkan konformasi predominan di setiap kantong; dextrocetirizine dalam
CBS1 dan levocetirizine dalam CBS2. Senyawa cetirizine dalam CBS1 disempurnakan
dengan occupancy=1 B-factor rata-rata 78 A2 dan CBS2 dengan occupancy=0,8 dan B-factor
rata-rata 81 A2. Dua molekul cetirizine cocok dengan peta densitas electron (Gambar 2.)
ditunjukkan dengan nilai RSR yang rendah dan niali LLDL masing-masing 1,79 dan 2,04.