BAB 4

METODE PENELITIAN
4.1.Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris dengan
desain post-test only control grup.
4.2.Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari 2015. Proses ekstraksi dan uji
fitokimia buah kapulaga (Amomum compactum) dilakukan di Laboratorium Kimia
Fakultas Keguruan dan Ilmu Pengetahuan (FKIP) Universitas Syiah Kuala
(Unsyiah). Pengujian hasil ekstrak buah kapulaga terhadap A. actinomycetemcomitans dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan
(FKH) Universitas Syiah Kuala Banda Aceh.
4.3.Sampel Penelitian
Sampel pada penelitian ini adalah buah kapulaga (Amomum compactum)
yang berasal dari daerah Nagan Raya dan sampel A. actinomycetemcomitans
diambil dari isolat klinis penderita periodontitis agresif yang telah diidentifikasi
sebelumnya di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan (FKH)
Universitas Gadjah Mada (UGM).
4.4.

Alat dan Bahan Penelitian

4.4.1. Alat
Alat-alat yang digunakan:
-

Autoklaf (Aesculap)

Timbangan analitik (Ohaus)

Sterilisator (Heraeus)

Gelas ukur (Pyrex)

Jarum ose

Tabung reaksi (Pyrex)

Cawan petri

Anaerobic jar + CO2 5%

19

Universitas Syiah Kuala

20

Hot plate dan Magnetic stirrer

Vortex (Rotamixer)

Pipet pasteur

Batang L/ Batang sebar

Mikroskop cahaya (Olympus)

Colony counter

Labu Erlenmeyer (Pyrex)

Lampu spiritus

Pipet tetes (Iwaki)

Kaca objek (Pyrex)

Inkubator

Aluminium foil

Blender (Philips)

Rotary evaporator

Kertas label dan alat tulis

Rak tabung reaksi

4.4.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan:
-

A. actinomycetemcomitans Growth Medium (AaGM) agar dengan

komposisi:
Trypticase Soy Broth (TSB) 30 gram/liter
Yeast extract 6 gram/liter
Sodium bicarbonate 4 gram/liter
Dextrose 8 gram/liter
Agar 15 gram/liter
Alkohol 96%
Akuades
Ciprofloxacin 10 g

Universitas Syiah Kuala

21

Bahan pewarnaan Gram:

- Kristal ungu (violet)
- Lugols iodine
- Safranin (counterstain)
Mc Farland 0,5 (3x106 CFU/ml)
Mueller Hinton Agar (MHA) dengan komposisi:
- Beef extract 150 gram/500 ml
- Asam amino 17,5 gram/liter
- Amilum 1,5 gram/liter
- Bacto agar 17 gram/liter
Alkohol 70%
Larutan NaCl 0,9%
Buah kapulaga 1 Kg
Kloroform
H2SO4
Mg
HCL
FeCl3
Handscoon
Masker

4.5.Cara Kerja
4.5.1. Pembuatan Ekstrak Buah Kapulaga (Amomum compactum)
Buah kapulaga (Amomum compactum) ditimbang sebanyak 1 kg, lalu
dicuci hingga bersih dan dikeringkan. Buah kapulaga (Amomum compactum) yang
telah kering kemudian dihaluskan menggunakan blender hingga menjadi serbuk.
Kemudian dilakukan proses ekstraksi metode maserasi dengan memasukkan
serbuk buah kapulaga tersebut ke dalam labu Erlenmeyer dan direndam dalam
pelarut etanol 96% sampai buah kapulaga terendam semua dalam pelarut. Proses
ekstraksi juga diikuti dengan dilakukan pengadukan untuk mempercepat proses
ekstraksi. Setelah itu, dilakukan penguapan dengan rotary evaporator pada suhu
50oC sehingga diperoleh ekstrak pekat dan tidak mengandung etanol.33

4.5.2. Uji Fitokimia Ekstrak Buah Kapulaga (Amomum compactum)

Uji flavonoid dilakukan dengan cara beberapa ml sampel dalam etanol
dipanaskan selama 15 menit di atas penangas air kemudian ditambah 0,5 ml HCl

Universitas Syiah Kuala

22

pekat, dan 3-4 potong logam Mg, adanya warna merah atau jingga menunjukkan
adanya senyawa flavonoid. 35
Uji saponin dilakukan dengan cara sebanyak 0,5 simplisia yang telah
diserbukkan dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan air panas, didinginkan
kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk buih setinggi 1-10
cm, tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan HCl maka
ekstrak positif mengandung saponin.25
Uji polifenol dilakukan dengan mengambil 10 ml larutan sampel ditambah
dengan beberapa tetes larutan FeCl3, bila bereaksi positif menghasilkan hijau, biru
atau ungu.34
Uji terpenoid dilakukan dengan menambahkan 2 ml kloroform lalu
dihomogenkan dan disaring. Kemudian ditambahkan 2 tetes H2SO4 pekat, lalu
amati perubahan warna. Bila bereaksi positif akan menghasilkan larutan berwarna
merah atau violet.34
4.5.3. Sterilisasi Alat
Sebelum memulai penelitian tangan dan meja terlebih dahulu disemprot
menggunakan alkohol 70%, agar cemaran mikroba dapat minimal. Seluruh alat
yang tahan panas, seperti gelas ukur, jarum ose, batang L, cawan petri, tabung
reaksi, dan labu Erlenmeyer dicuci bersih dan dikeringkan. Alat-alat tersebut
kemudian dibungkus menggunakan aluminium foil. Sterilisasi dilakukan dalam
sterilisator pada suhu 160oC selama 2 jam.33
4.5.4. Pembuatan

Media

A.

actinomycetemcomitans

Growth

Medium

(AaGM) Agar
Media AaGM agar dibuat dengan cara melarutkan Trypticase Soy Broth
(TSB) 30 gram, yeast extract 6 gram, sodium bicarbonate 4 gram, dextrose 8
gram dan agar 15 gram dengan 1 liter akuades di dalam labu Erlenmeyer. Lalu
dihomogenkan dan dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih. Kemudian
dilakukan sterilisasi media di dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit
dengan tekanan 2 atm. Media tersebut dituang ke dalam cawan petri setelah agak
dingin secara asepsis yang kemudian digunakan sebagai media pertumbuhan A.
actinomycetemcomitans.36

Universitas Syiah Kuala

23

4.5.5. Kultur Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Sampel yang telah diidentifikasi A. actinomycetemcomitans sebelumnya
diambil dan dikultur ulang pada media AaGM agar, lalu digoreskan pada
permukaan AaGM dengan teknik goresan T (streak T). Cawan petri dibagi
menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker. Jarum ose dipanaskan dan
ditunggu hingga dingin, kemudian bakteri diinokulasikan pada bagian 1 dengan
goresan (streak) zig-zag. Lalu dilanjutkan goresan (streak) zig-zag pada bagian 2.
Hal yang sama juga dilakukan pada bagian 3. Setelah itu, cawan petri ditutup
rapat dan dimasukkan ke dalam candle jar kemudian dilakukan inkubasi di dalam
inkubator selama 48 jam pada suhu 37o C.36
4.5.6. Pewarnaan Gram
Cara melakukan pewarnaan Gram adalah dengan terlebih dahulu membuat
preparat ulasan dari bakteri. Bakteri yang telah dikultur pada media AaGM
diambil menggunakan jarum ose. Jarum ose dipanaskan, kemudian ditunggu
hingga dingin. Bakteri diambil dari koloni yang terpisah dan diratakan pada kaca
preparat yang sebelumnya telah ditetesi NaCl, lalu difiksasi di atas lampu spiritus.
Ditetesi crystal violet sebagai pewarna utama dan ditunggu selama lebih kurang 1
menit. Dicuci dengan air mengalir, lalu preparat ditetesi Lugols iodine (iodin
Gram), ditunggu sekitar 1 menit. Dicuci kembali dengan air mengalir, kemudian
dilunturkan dengan alkohol 96% selama 5-10 detik. Dicuci dengan air mengalir,
ditetesi safranin dan ditunggu sekitar 1 menit, dicuci kembali dengan air mengalir.
Setelah itu, preparat dikeringkan dengan kertas tisu yang ditempelkan di sisi
ulasan dan dibiarkan diamati di bawah mikroskop pada pembesaran 1000x. A.
actinomycetemcomitans akan tampak berwarna merah muda.33
4.5.7. Pembuatan Suspensi Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Pembuatan suspensi A. actinomycetemcomitans dengan cara mengambil
sebanyak 1 ose koloni bakteri, dan disuspensikan dalam larutan NaCl 0,9%
sebanyak 5 ml. Suspensi bakteri kemudian dihomogenkan dengan vortex sampai
diperoleh kekeruhan sesuai standar Mc Farland 0,5 (3 x 106 CFU/ml).36
4.5.8. Pengenceran Bertingkat Aggregatibacter actinomycetemcommitans
dengan Metode Serial Dilution

Universitas Syiah Kuala

24

Disiapkan 8 tabung reaksi yang sudah diisi dengan 9 ml NaCl 0,9%.

Kemudian dari tabung yang telah disesuaikan tingkat kekeruhannya dengan
larutan standar Mc Farland diambil 1 ml suspensi A. actinomycetemcomitans lalu
dicampurkan dengan tabung pengenceran 1 (10-1) dan dihomogenkan. Kemudian
dari tabung 1 diambil 1 ml dengan pipet pasteur kemudian dipindahkan ke tabung
2 (10-2) dan dihomogenkan. Dari tabung 2 diambil 1 ml dengan pipet pasteur
kemudian dipindahkan ke tabung pengenceran 3 (10-3) lalu dihomogenkan.
Seterusnya hingga tabung ke-8 (terakhir) dari seri pengenceran dilusi. Setelah itu,
diambil sebanyak 0,1 ml dari semua tabung diteteskan ke media MHA dengan
metode spread plate dengan menggunakan batang L, kemudian dimasukkan ke
dalam candle jar dan diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu
37oC pada suasana anaerob. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan
melakukan penghitungan koloni A. actinomycetemcomitans menggunakan colony
counter dengan syarat jumlah koloni yang tumbuh pada media adalah 30-300
CFU/ml.37
4.5.9. Pembuatan Variabel Konsentrasi Ekstrak
Ekstrak murni buah kapulaga dilakukan pengenceran dengan akuades
menjadi konsentrasi 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5% dan 15% (konsentrsi 100%
tidak mengalami pengenceran). Akuades tanpa dicampur ekstrak buah kapulaga
digunakan sebagai kontrol negatif dan ciprofloxacin 10g digunakan sebagai
kontrol positif. Hasil pengenceran dihomogenkan menggunakan vortex. Rumus
yang digunakan:

C1.V1=C2.V2
C1 =Konsentrasi awal bahan uji
V1=Volume awal bahan uji
C2=Konsentrasi bahan uji yang mau dibuat
V2=Volume bahan uji yang ingin dibuat

Universitas Syiah Kuala

25

Sedangkan untuk volume bahan pengencer yang ingin ditambahkan dihitung

menggunakan rumus:
V2=V1+Vpengencer
4.5.10. Uji Antibakteri (Penentuan KHM dan KBM)
Delapan tabung reaksi disiapkan dan ditandai sesuai konsentrasi yang
digunakan. Tabung 1 diisi dengan 1 ml ciprofloxacin 10g/ml (kontrol positif),
tabung 2 diisi 1 ml akuades steril (kontrol negatif), selanjutnya tabung 3 diisi
ekstrak buah kapulaga konsentrasi 2,5%, tabung 4 diisi ekstrak buah kapulaga
konsentrasi 5%, tabung 5 diisi ekstrak buah kapulaga konsentrasi 7,5%, tabung 6
diisi ekstrak buah kapulaga konsentrasi 10%, tabung 7 diisi ekstrak buah kapulaga
konsentrasi 12,5% dan tabung 8 diisi ekstrak buah kapulaga konsentrasi 15%.
Masing-masing tabung tersebut diisi sebanyak 1 ml ekstrak buah kapulaga
(Amomum compactum) dan ditambahkan 1 ml Trypticase Soy Broth (TSB).
Kemudian setiap tabung diisi 0,1 ml suspensi A. actinomycetemcomitans yang
sudah dilakukan pengenceran dengan metode serial dilution menggunakan pipet
pasteur dan dimasukkan ke dalam masing-masing tabung lalu dihomogenkan
menggunakan vortex.38
Selanjutnya dari masing-masing tabung diambil 0,1 ml suspensi A.
actinomycetemcomitans menggunakan pipet pasteur dan diteteskan pada cawan
petri yang telah diberi label sesuai dengan label pada tabung dan diteteskan ke
media MHA dengan metode sebar (spread plate) menggunaan batang L. Lalu
dimasukkan ke dalam candle jar dan diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam
pada suhu 37oC dengan suasana anaerob. Pengamatan efek antibakteri dilakukan
setelah 24 jam dengan menghitung koloni A. actinomycetemcomitans yang
tumbuh pada media dengan colony counter. Konsentrasi Hambat Minimum
(KHM) dari ekstrak buah kapulaga (Amomum compactum) adalah cawan petri
yang memiliki jumlah koloni bakteri yang lebih kecil dibandingkan cawan petri
kelompok kontrol negatif. Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dari ekstrak buah
kapulaga (Amomum compactum) adalah cawan petri yang tidak terdapat
pertumbuhan koloni bakteri.36
4.6. Analisis Data

Universitas Syiah Kuala

26

Analisis data hasil penelitian dilakukan dengan metode one way ANOVA
untuk mengetahui apakah terdapat pengaruh atau tidak pada tiap kategori
perlakuan. Jika terdapat pengaruh maka dilanjutkan dengan uji lanjut Least
Significant Difference (LSD) untuk mengetahui kelompok yang memiliki
perbedaan yang bermakna.

4.7.

Alur Penelitian

Pembuatan ekstrak buah

kapulaga (Amomum
compactum)

Uji fitokimia

Pembuatan media A.
actinomycetemcomitans
Growth Medium
(AaGM) agar
Kultur A.
actinomycetemcomitans

Universitas Syiah Kuala

27

Pewarnaan Gram

Pengenceran bertingkat
Pembuatan suspensi A.
dengan metode serial
actinomycetemcomitans
dilution setara dengan Mc Farland 0,5
Dilakukan pengenceran ekstrak
buah kapulaga (Amomum
compactum) menjadi
konsentrasi 2,5%, 5%, 7,5%,
10%, 12,5%, 15%

Uji penentuan Konsentrasi Hambat Minimum

(KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum
(KBM) ekstrak buah kapulaga (Amomum
compactum) terhadap A. actinomycetemcomitans

Kelompok Kontrol

P6:
Positif:
15%
ciprofloxacin

Negatif:
Akuades

Kelompok Perlakuan

P1:
2,5%

P3:
7,5%

P2:
5%

P4:
10%

P5:
12,5%

Kultur pada media MHA dengan metode spread plate dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 37oC dalam suasana anaerob
Pengamatan hasil kultur
KHM

Pengolahan data

KBM

Analisis data

Gambar 4.1. Alur Penelitian

Universitas Syiah Kuala