Anda di halaman 1dari 21

KROMATOGRAFI KOLOM

I. TUJUAN
Mempelajari cara pemisahan suatu campuran dengan kromotografi
kolom.

II. TEORI
Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan
pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa,
baik

pengotornya

maupun

hasil isolasinya.

Sebelumnya

dilakukan

percobaan tarhadap kromatografi lapis tipis sebagai pencari kondisi


eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut yang baik sehingga
antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara sempurna.
Alat yang diinginkan adalah kolom gelas yang diisi dengan zat
padat aktif sepertialumino dan selika gel sebagai fase diam. Zat yang
dimasukan lewat puncak kolom akan mengalir kedalam zat penyerap. Zat
diserap dari larutan secara sempurna oleh zat penyerapan berupa pita
sempit pada ujung kolom dengan kecepatan yang berbeda, sehingga
terjadi

pemisahan

kromatogram.

dalam

kolom.

Hasil

pemisahan

ini

disebut

Umumnya pada kromatografi kolom digunakan campuran homogen


seperti campuran gas dilakukan pada suatu penyerap (absorbent).
Komponen penyusun campur akan diserap oleh adsoben adalah 1 : 50.
Metode ini dapat memisahkan zat dari 100 mg sampai 5 mg
bahkan lebih. Pemisahan campuran baik bila harga Rf = 0.6. Teknik
kromatografi kolom paling sesuai untuk pemisahan hasil isolasi dari
pengotornya.
Pemisahan

dengan

kromatografi kolom biasanya

digunakan

absorben yang paling umum : alumunium oksida (Al 2O3) yang mempunyai
daya absorsi atau kereaktifan yang diatur secara cepat sehingga
penggunaan memberikan hasil yang baik. Seberapa jauh komponen itu
dapat diserap absorben tergantun pada sifat fisika komponen tersebut.
Bila campuran cairan dilakukan dengan kolom yang berisikan
absorben, komponen cairan lainya akan mengalir kebawah . Jadi semakin
lemah kemungkinan cairan itu teradsopsi semakin cepat komponen itu
mengalir ke bawah. Bila kecepatan gerak cairan itu lebih besar dari pada
kecepatran absorbsi oleh absorben.
Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan
daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji,
dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan
dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar

akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non
polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari
larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masin-masing
zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi
pemisahan dalam kolom.
Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat
dibedakan :

Kromatografi Fase Normal


Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal
bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non
polar.

Kromatografi Fase Terbalik


Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar,
sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.
Cara pengisian kolom terbagi dua , yaitu :
1. Cara basah

Isi dasar kolom dengan kapas

Masukkan eluen

Campurkan dengan rata sebagai adsorben dan eluen menjadi homogen

Jangan tersentuh atau diguncangkan 6 jam

Setelah stabil, masukkan eluen dan zat, lalu keluarkan eluen


2. Cara kering

Isi tabung dengan kapas

Masukkan eluen

Masukkan adsorben kering sedikit demi sedikit

Lalu di aduk

Faktor yang mempengaruhi kecepatan


gerak zat:
- Daya serap adsorben.
- Sifat pelarut.
- Suhu sistem kromotografi.

Kecepatan turunan sampel dipengaruhi


oleh :
Tekanan didalam kolom semakin besar
semakin cepat.
Panjang absorben, makin panjan makin
cepat turunnya senyawa.
Ukuran artikel absorben.
Rongga udara dalam absorben.

Jika ada rongga udara dalam adsorben


maka jalannya senyawa akan
terganggu.
Faktor yang mempengaruhi proses
pemisahan:
-

Daya serap adsoben.

Jenis / sifat eluen.

Suhu kromatografi.

Pelarut yang digunakan.

III. PROSEDUR KERJA


3.1 Alat dan Bahan
Adapun bahan-bahan dan peralatan yang digunakan pada praktikum ini
adalah sebagai berikut :
a.

Alat

Kolom kromatografi, alat gelas berupa kolom sebagai tempat fase diam
dan media proses kromatografi.
Botol vial, botol kecil dengan volume 10 mL sebagai wadah penampung
hasil pemisahan.
Standar dan klem, sebagai alat bantu untuk rangkaian alat kromatografi.

Gelas piala, sebagai wadah pelarut.


Batang pengaduk dan corong, sebagai alat bantu untuk mengalirkan
pelarut ketika memasukkannya ke dalam kolom.
b. Bahan
Hasil ekstrak buah naga (pada objek sokletasi) sebagai sampel uji.
Silika sebagai bahan untuk fase diam.
Eluent / fase gerak, berupa campuran heksan dengan etil asetat dengan
perbandingan tertentu.
Kapas, sebagai bahan pembatas dan penahan pada serbuk silika

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN


4.1 Hasil dan Data
Dari praktikum Kromatografi Kolom yang dilakukan didapatkan data-data
sebagai berikut :
Sampel

: ekstrak buah naga (hasil dari objek sokletasi).

Jenis Eluen

: campuran heksan dengan etil asetat, dengan sistem SGP


(step gradien polarity)

Tabel Pengamatan.

No

Perbandinga

Heksan : Etil

Warna Zat

Asetat
1

10:0

bening

8:2

bening

6:4

Orange muda

4:6

orange muda

2:8

orange

0:10

orange

4.2 Pembahasan
Pemisahan ekstrak buah naga ini dilakukan dengan metode kromatografi
kolom, dengan sistem pelarut SGP (Step Gradieny Polarity). Langkah ini
diambil

karena

belum

diketahui

jenis

eluen

yang

cocok

dengan

pemisahan ini.
Sistem pelarut SGP dilakukan dengan cara menggantikan /
mengubah kepolaran dari eluen yang digunakan secara bertahap. Eluen
tersebut merupakan campuran dua jenis pelarut dengan kepolaran
berbeda. Dengan mengubah perbandingan campurannya kita dapat
menggeser tingkat kepolaran dari eluen ini. Pada pengerjaannya di awali
dengan satu jenis pelarut yaitu berupa heksan saja, kemudian digeser
tingkat kepolarannya dengan mencampurkannya dengan pelarut etil
asetat. Pencampuran dilakukan dengan perbandingan yang divariasikan
secara bertahap, hingga diakhiri dengan hanya menggunakan etil asetat
saja sebagai eluen. Dengan ini diharapkan dapat memberikan pemisahan
yang lebih baik.
Eluen dialirkan untuk pemisahan komponen dengan kecepatan alir
sekitar 100 tetesan per menitnya. Aliran eluen diatur agar tidak terlalu
cepat agar komponen dapat terpisah dengan. Alirannya pun diusahakan
tidak terlalu lambat agar proses tidak terlalu lama. Eluen mengalir

mengelusi sampel menyusuri fase diam di sepanjang kolom dengan


memanfaatkan gaya gravitasi.
Dengan adanya perubahan tingkat kepolaran secara bertahap,
keterikatan komponen terhadap pelarut dan keterikatan masing-masing
komponen terhadap fase diam akan berubah-ubah, sesuai dengan sifatsifat masing-masing komponen.. Komponen ini dibawa oleh pelarut dan
tertampung

pada

vial

penampung.

Hasil

pemisahan

dapat

diakumulasikan dan masih dalam keadaan terlarut dalam pelarut. Kita


bisa

saja

mendapatkan

komponen

murninya

dengan

pemekatan,

meskipun hasilnya tidak terlalu banyak.


Untuk lebih memastikan tingkat kemurnian dari hasil pemisahan
dapat kita uji dengan metode Kromatografi Lapisan Tipis. Hasil yang ada
pada masing-masing vial tersebut kita uji dengan KLT sehingga bisa kita
lihat apakah pada masing-masing benar-benar hanya mengandung satu
komponen.
Kelebihan dari metode ini jika dibandingkan dengan KLT adalah
bahwa kita dapat melakukan pemisahan untuk sampel dengan jumlah
yang lebih banyak. Di samping itu, kita juga bisa memperoleh hasil
pemisahan tersebut dan menampungnya.
Proses pemisahan pada kromatografi kolom ini bisa dikatakan
sebagai bentuk sederhana dari teknik kromatografi yang dilakukan

dengan instrument kinerja tinggi. Kita juga bisa melakukan pemisahan


dengan jenis eluen lain, atau dengan jenis absorben lainnya. Kolom di
sini hanya sebatas berfungsi sebagai wadah. Bahan yang digunakan
sebagai fase diam dapat berupa macam, baik itu dengan memanfaatkan
prinsip partisi ataupun absorbsi.

V. KESIMPULAN DAN SARAN


5.1 Kesimpulan
Setelah melakukan praktikum ini dapat disimpulkan bahwa dengan
kromatografi kolom kita dapat memisahkan komponen penyusun dari
suatu sampel bahan alam. Hasil pemisahannya disimpan dalam 6 botol
vial secara terpisah untuk masing-masing jenis eluen.
5.2 Saran
Belum dapat dipastikan apakah pada masing-masing vial benar-benar
hanya terdapat satu jenis komponen. Untuk lebih memastikan kita dapat
menguji masing-masing vial dengan menggunakan metode Kromatografi
Lapisan Tipis.

Tugas Sebelum Pratikum


1. Bagaimana cara memilih eluen untuk kromatografi kolom?
Jawab :
Dengan meneteskan pada plat lapis tapis, jika KLT hasilnya bagus dari
totolan suatu zat dan berbentuk bulatan maka eluen tersebut baik untuk
kromatografi kolom.
2. Faktor-faktor apa saja yang mempengaruhi proses pemisahan?
Jawab :

Pemilihan adsorben sebagai fase diam

Kepolaran pelarut yang akan dipisahkan

Laju elusi atau aliran fase gerak

3. Jelaska metoda pengelusian yang digunakan pada kromatografi kolom!


Jawab :
a.

Step graden polarity, dimana noda yang tampak sehingga hasil


kromatografi kolom pada plat KLT sangat berdekatan.

b. Kokratik, dimana noda yang tampak sehingga hasil kromatografi kolom


pada plat KLT berimpit dengan kepolaran.

DAFTAR PUSTAKA
http://asyharstf08.wordpress.com/2010/02/25/kromatografi-kolom-danlapis-tipis

http://wiro-pharmacy-blogspot.com/2009/10/kuliah-kromatografi-kolombagian
1.html

http://www.chem-istry.org/materi_kimia/kimia_dasar/pemurnian_material/
kromatografi

http://www.chem-is-try.org/wp-content/migrated_images/analisis/
column1.gif

LAPORAN LENGKAP KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS


BAB I
PENDAHULUAN

Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran


menjadi komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida yang terdapat
pada tahu, tempe, bubuk isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa kelabihan
senyawa isoflavon yang potensial bagi kesehatan manusia, diantaranya adalah
sebagai antioksidan, antitumor / antikanker, antikolestrol, antivirus, antialergi, dan
dapat mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja berdasarkan
metode kromatografi.
Kromatografi telah didefinisikan terutama sebagai suatu proses pemisahan
yang digunakan untuk pemisahan campuran yang pada hakekatnya molekuler.
Kromatografi bergantung pada pembagian-ulang molekul-molekul campuran antara
dua fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi mencakup kromatografi adsorbs,
kromatografi partisi cairan, dan pertukaran ion. Sistem utama yang digunakan dalam
kromatografi partisi adalah: partisi gas, partisi cairan yang menggunakan alas tak
bergerak (misalnya kromatografi kolom), kromatografi kertas dan lapis tipis. Dalam
tiap kasus terjadi distribusi antara fase cair yang terserap secara stasioner dan

zat-alir bergerak yang kontak secara karib dengan fase cair itu. Dalam kromatografi
partisi cairan, fase cair yang bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang
diserapkan pada suatu pendukung; dalam kromatografi kertas pendukung itu adalah
kertas atau kertas terolah, sedangkan dalam kromatografi lapisan tipis adsorbennya
disalutkan pada lempeng kaca atau lembaran plastic. Hanya akan dibahas aspekaspek yang dipilih dari kromatografi partisi pada selulosa dengan rujukan khusus ke
analisis anorganik.
Maksud percobaan adalah untuk mengetahui metode penentuan kima
secara kromatografi lapis tipis.
Tujuan percobaan adalah untuk memisahkan campuran senyawa fase
dengan metode kromatografi lapis tipis dan untuk mengetahui nila Rf
Prinsip percobaan adalah adsorbs dan partisi dimana adsorbs adalah
penyerapan pada pemulaan, sedangkan partisi adalah penyebaran atau
kemampuan suatu saat yang ada dalam larutan untuk berpisah kedalam pelarut
yang digunakan.

BAB II
PEMBAHASAN

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan


kecepatan peramabatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi,
komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan
fase gerak.
Pemisahan KLT dikembangkan oleh Ismailoff dan Schraiberpada tahun
(1938). Tekniknya menggunakan penyokong fase diam berupa lapisan tipis sepreti
lempeng kaca, aluminium atau plat inert.
Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai
factor resensi, Rf:
Pada fase diam, jika dilihat mekanisme pemisahan, fase diam
dikelompokkan:
a. Kromatogarfi serapan (Silika gel, alumina, keiselguhr)
b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika gel)
c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina penukat ion)
d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel)
Pada fase gerak, pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan
silika gel, alumina dan fase diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan
kromatografi kolom serapan. System tak berair paling banyak digunakan dan contoh
pelarut organik dalam seri pelarut mikroskop diberikan dalam Tabel 25, yang meliputi
(sifat hidrofob menaik) methanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter,
kloroform (perlu diperhatikan pada kloroform yang distabilkan dengan etanol)
benzene, sikloheksana, dan eter petroleum.
KLT mempunyai beberapa kelebihan, yaitu:
1. Waktu pemisahan lebih cepat
2. Sensitive, artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi.
3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna.

Aspirin, phenacetin dan kofein (APC) sering digunakan dalam kombinasi


sebagai sediaan antipiretik analgetik. Penentuan dan identifikasinya sangat penting
yang dapat dilakukan secara kromatografi lapis tipis.
Prosedur di sini mengikuti Ganshirt dan Malzachur dan penyiapan lempeng
sederahan menurut metode Less dan De Muria. Noda ditampakkan dengan
semprotan permanganat dalam suasana asam, yang akan mengoksidasi senyawa
sampel hingga menghilangkan warna permanganate.

BAB III
METODE KERJA
A. Alat-alat yang digunakan
1. Batang pengaduk
2. Bejana KLT (chamber) + tutup
3. Botol semprot
4. Erlenmeyer
5. Gelas kimia
6. Gelas objek / plat KLT
7. Isolasi
8. Pipa kapiler
B. Bahan-bahan yang digunakan
1. Asam asetat glacial
2. Asam kromat
3. Asam sulfat
4. Benzene
5. Dietileter
6. Kalium permanganate
7. Kloroform
8. Methanol absolute
9. Sampel
10. Silika gel
11. Zat pembanding
C. Cara kerja
1. Penyiapan lempeng
1.1 Disiapkan alat dan bahan yang digunakan
1.2 Dibersihkan 8 glas objek (25mm x 75mm) dengan larutan asam kromat. Kemudian
asam sulfat, dibilas dengan air dan dikeringkan
1.3 Dibuat bubur, dari 3gram silika gel G dan 6 ml air diaduk dengan mortis.
1.4 Bubur yang sudah jadi dilapiskan pada plat (glas objek) dengan menggunakan
batang pengaduk dengan ketebalan sekitar 0,1mm sampai 0,3mm.

1.5 Dikeringkan, setelah kering dipindahkan glas objek ke oven dan diaktifkan pada suhu
1000C Selma 1 jam.
1.6 Plat atau lempeng yang sudah diaktifkan disimpan dalam desikator.
2. Penyiapan pengembang kromatografi
2.1 Disiapkan alat dan bahan yang digunakan
2.2 Dipipet 1ml methanol absolute, 18,090 ml asetat glacial, 60,301ml, dietileter, dan
120,60ml benzene
2.3 Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan dihomogenkan
2.4 Dimasukkan ke dalam chamber secukupnya
2.5 Dijenuhkan chamber dengan menutup sambil digoyang kemudian didiamkan.
3. Penotolan sampel
3.1 Disiapkan alat dan bahan
3.2 Sampel dilarutkan dalam kloroform 5-10mg/ml, kemudian ditotolkan pada ujung
lempeng (kurang lebih 1,5cm dari ujung) menggunakan pipet halus (pipa kapiler
untuk penentuan titik leleh). Diameter totolan boleh lebih dari 3cm.
3.3 Dianginkan sampai kering.
4. Eluen dengan larutan pengembang
4.1 Disiapkan alat dan bahan
4.2 Lempeng yang sudah ditotol dengan sampel dimasukkan ke dalam chamber,
kemudian ditutup dengan segera.
4.3 Setelah permukaan pelarut naik kurang lebih 5cm atau kira-kira 1cm dari ujung atas,
diangkat lempeng dari chamber.
4.4 Diberi tanda posisi pelarut lalu dikeringkan di ujung
4.5 Dimasukkan ke dalam oven beberapa menit untuk menghilangkan pelarut organik.

URAIAN BAHAN
1. Asam asetat (FI edisi III, hal 42)
Nama resmi

: ACIDUM ACETICUM GLACIALE

Nama lain

: Asam asetat glacial

Rumus molekul

: C2H2O2

Berat molekul

: 60,05

Pemerian

: Cairan jernih, tidak berwarna, bau khas, tajam, jika

diencerkan dengan air, rasa asam


Kelarutan

: Dapat campur dengan air, dengan etanol (95%) P

dan dengan gliserol P


Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup rapat

Kegunaan

: Zat tambahan

2. Asam kromat (FI edisi III, hal 650)


Larutkan 84gram kromtrioksida P dalam 700ml air, tambahan 400ml asam sulfat P
perlahan-lahan sambil diaduk.
3. Asam sulfat (FI edisi III, hal 58)
Nama resmi

: ACIDUM SULFURICUM

Nama lain

: Asam sulfat

Rumus molekul

: H2SO4

Berat molekul

: 98,07

Pemerian

: cairan kental seperti minyak, korosit, tidak berwarna, jika

ditambahkan ke dalam air menimbulkan panas.


Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup rapat.

Kegunaan

: Zat tambahan

4. Benzen (FI edisi III, hal 658)


Benzen P C6H6, cairan tidak berwarna, transparan mudah terbakar pemerian cairan
transparan: tidak berwarna, mudah menyala.
5. Coffeinum (FI edisi III, hal 175)
Nama resmi

: COFFEINUM

Nama lain

: kofein

Rumus molekul

: C8H10N4O2

Berat molekul
Pemerian

: 194,19
: serbuk hablur berbentuk jarum, meningkat biasanya

menggumpal putih, tidak berbau, rasa pahit.


Kelarutan

: agak sukar larut dalam air dan etanol 95% P,

mudah larut dalam kloroform P.


Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup baik.

Kegunaan

: Stimulan saraf pusat kardiafik.

6. Dietil eter (FI edisi III, hal 650)


Nama resmi

: DIETIL ETER

Nama lain

: Dieti, eter

Rumus molekul
RJ
Jarak didih

: C2H5O
: 0,714 gram 0,78 gram
: Tersuling sempurna pada suhu antara 340C dan 360C.

7. Methanol (FI edisi III, hal 706)


Nama resmi

: METANOLUM

Nama lain

: methanol

Rumus molekul

: CH2OH

Berat jenis

: 0,796 0,798

Pemerian

: Cairan jernih tidak berwarna, bau khas

Kelarutan
jernih tidak berwarna.

: Dapat bercampur dengan air membentuk cairan

Pembahasan
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan fitokimia dengan
adsorbs pada lapisan tipis adsorben dikenal dengan namaThin Lager
Chormatografi ( TLC). Prinsip kerja KLT adalah partisi dan adsorbs dimana aleum
sebagai fase gerak dan lempeng KLT sebagai fase diam.
KLT sebagai salah satu metode instrumental yang sering digunakan, karena
mempunayi keuntungan antara lain sebagai berikut :
1. Peralatan yang diperlukan sedikit
2. Waktu analisis yang cepat
3. Hasil pemisahan lebih baik
4. Daya pemisahan tinggi
5. Pengerjaannya sederhana dan mudah
6. Harganya terjangkau
Dalam praktikum yang telah digunakan fase gerak yaitu eluen dan terdiri dari
methanol absolute, asam asetat glacial, dietil eter, dan benzene dengan
perbandingan 1 : 18 : 60 : 120, dan fase diam digunakan lempeng KLT yang mana
telah dilapisi dengan silika gel yang berfungsi sebagai penyerap atau penyangga
atau sampel dan eluen. Sebelum lempeng yang dielusi dengan sampel dimasukkan
kertas saring. Chamber yang berisi eluen yang akan merambat keluar melalui kertas
saring. Alasan mengapa eluen harus dijenuhkan yaitu agar tekanan dalam chamber
sama agar noda yang dihasilkan sesuai dengan diinginkan