3.1.4.5.

Alternatif Agregasi Kovalen

Meskipun bentuk paling umum dari agregasi kovalen karena pembentukan ikatan disulfida,
agregasi juga dapat terjadi melalui amino bebas, karbonil, karboksil, atau kelompok
fungsional hidroksil dengan ester atau amida hubungan, misalnya. agregat tersebut telah
didokumentasikan untuk insulin dan juga ditemukan selama analisis relaxin.
3.1.5. Deglikosilasi dan Desialilasi
Ada sejumlah protein terapeutik glikosilasi yang memiliki molekul asam gula dan sialic
kovalen melekat pada tulang punggung peptida. Runkel et al. melaporkan bahwa IFN- beta
diproduksi dalam kultur sel mamalia sebagai protein glikosilasi, identik dengan molekul
manusia, memiliki stabilitas yang lebih besar untuk agregasi dari protein yang sesuai yang
dihasilkan oleh fermentasi bakteri dalam bentuk nonglikosilasi.
Umumnya, obligasi melampirkan gula dengan protein yang stabil, dan modifikasi dalam
struktur karbohidrat karena proses perubahan selama pembuatan produk. Namun
Desialylation dapat terjadi pada pH asam di penyimpanan. Modifikasi struktur karbohidrat,
atau perubahan dalam glikosilasi protein terapeutik, dapat mengakibatkan perubahan
signifikan dalam farmakokinetik molekul. Berbeda kandungan asam sialat telah terbukti
bertanggung jawab untuk variabilitas dalam bioaktivitas sangat murni hipofisis manusia
isoform hormon luteinizing.
Perubahan glikosilasi dapat dideteksi dengan berbagai metode gel termasuk fluorophore
dibantu karbohidrat elektroforesis dan MS. Perubahan kandungan asam sialat dapat dideteksi
dengan pengukuran asam sialic gratis. metode baru untuk quantitate oligosakarida sedang
dikembangkan. Misalnya, resolusi tinggi dari fase normal kromatografi-pH tinggi pertukaran
anion dan fase normal metode HPLC dikombinasikan dengan MS dapat menyediakan
teknologi yang efektif untuk menganalisis repertoar macam struktur oligosakarida.
3.1.6. Photodegradasi Protein
Kedua pengion dan non ion radiasi dapat menyebabkan inaktivasi protein. Tirosin, triptofan,
dan sistein sangat rentan terhadap radiasi non ion, seperti ultraviolet (UV) cahaya.
Penyerapan foton mengarah ke photoionization dan pembentukan produk fotodegradasi baik
melalui interaksi langsung dengan asam amino atau tidak langsung melalui berbagai agen
kepekaan, seperti oksigen. Umumnya diamati produk fotodegradasi dalam soda, netral-pH,
larutan protein berair termasuk SS obligasi fisi, konversi tirosin untuk DOPA, 3- (4
hidroksifenil) asam laktat, dan dityrosine, serta fragmentasi oleh-produk dan konversi
triptofan residu untuk kynurenine dan N-formil-kynurenine. Posisi residu sensitif dalam
struktur tiga dimensi protein yang juga mempengaruhi reaktivitas menuju fotolisis. Hal ini
juga penting untuk memperhitungkan potensi kerusakan protein selama analisis
menggunakan dichroism melingkar (CD), UV, atau neon pengukuran di mana radiasi insiden
sedang digunakan.

3.2. Ketidakstabilan Fisik

Ketidakstabilan fisik, untuk tujuan ini, telah dikategorikan sebagai reaksi-reaksi yang tidak
melibatkan pembentukan atau perusakan ikatan kovalen. Agregasi protein, dibahas terutama
sebagai ketidakstabilan fisik, juga dapat terjadi sebagai hasil dari pembentukan ikatan
disulfida antarmolekul atau transamidation seperti yang dibahas sebelumnya.
Perubahan konformasi (yaitu, perubahan struktur sekunder dan tersier) dalam protein dapat
terjadi sebagai akibat dari paparan perturbants struktural atau stres lingkungan. Seringkali,
studi stabilitas protein melibatkan perubahan suhu dan pH, yang keduanya dapat
menyebabkan modifikasi struktural yang dapat dideteksi oleh teknik spektroskopi standar
seperti CD, fluoresensi dan inframerah (IR) spektroskopi.
3.2.1. Agregasi dan Pengendapan
Agregasi jangka protein mencakup jangkauan yang sangat luas dari reaksi dan hasil, beberapa
di antaranya telah dipelajari secara ekstensif untuk protein tertentu sedangkan yang lain tetap
menantang untuk belajar dan menentukan. Bentuk monomer protein umumnya diinginkan
spesies aktif secara fisiologis (dengan pengecualian dari spesies multimeric), tetapi ada
beberapa protein yang tidak rentan terhadap beberapa bentuk baik agregasi larut atau tidak
larut, reversibel atau ireversibel.
Mekanisme yang paling umum dari agregasi protein diyakini melibatkan denaturasi protein
dan asosiasi nonkovalen melalui antarmuka hidrofobik. Denaturasi biasanya diinduksi pada
gas-cair, cair-cair (seperti selama proses mikroenkapsulasi) atau antarmuka kontainer-cair,
meskipun panas, variasi pH, pelarut, garam, dan eksipien dapat juga berkontribusi.
Studi stres termal sering digunakan untuk mengevaluasi kemampuan pangkat formulasi untuk
menstabilkan protein. Chan et al. menunjukkan, melalui diferensial scanning kalorimetri
(DSC), bahwa kalsium klorida dan gula stabil deoksiribonuklease manusia rekombinan (rh
DNAse) terhadap denaturasi termal sementara kation divalen, urea, dan guanidin hidroklorida
mengguncang protein. Sebuah studi baru pada ligan agregasi Flt3 manusia rekombinan
memaparkan pentingnya reversibilitas termal karena berkaitan dengan minimalisasi agregasi
ligan dan peran potensial untuk menentukan kondisi solusi yang dapat mencapai stabilitas
jangka panjang terbesar. Bukti bahwa unfolding didahului pembentukan agregat
disediakan oleh CD jauh-UV.
Mekanisme nonkovalen lain dari agregasi termasuk kompleksasi ionik, penggaraman, biaya
netralisasi dekat dengan pH isoelektrik, dan membatasi kelarutan molekul. jenis agregat,
seperti agregat hydrobic, harus reversibel, misalnya dengan pengenceran.
Seiring dengan studi dipercepat, sejumlah kegiatan pembangunan terkait farmasi lainnya
telah ditemukan untuk menginduksi denaturasi. Studi pada stres spray drying dan pengabutan
pada protein telah diterbitkan, dan investigasi ke dalam efek beku-mencair bersepeda juga

didokumentasikan. Perumusan dan mengisi kegiatan bersama dengan pengiriman formulasi

cair sering mengakibatkan eksposur yang signifikan dari protein untuk interface gas-cair.
Surfaktan seperti Tween 80, Pluronic F-68, dan Brij 35 telah terbukti menstabilkan agregasi
antarmuka-diinduksi hormon pertumbuhan manusia (hGH).
tapi tidak stabil hGH terhadap stres termal dalam studi DSC. Bahkan, konsentrasi yang lebih
tinggi dari surfaktan ditemukan untuk mengacaukan molekul. Formulasi dengan gula juga
dikenal untuk menstabilkan sejumlah protein terhadap agregasi.
agregat larut tetap dalam larutan sering multimers berat molekul dimer atau rendah. Secara
umum, jenis agregat dapat dideteksi dengan kinerja tinggi eksklusi ukuran kromatografi (HPSEC) dan telah ditemukan dengan metode ini dalam banyak protein termasuk hGH, insulin,
interleukin-2 (IL-2), antitrypsin - 1, IFN -y, faktor pertumbuhan fibroblast dasar, dan IFN-.
metode HP-SEC konvensional juga dapat dimodifikasi untuk memberikan pemisahan yang
lebih akurat. Misalnya, guanidin hidroklorida sering ditambahkan ke fase gerak untuk
membedakan protein asli dan terdenaturasi. Secara umum, rendahnya tingkat agregat larut
dalam produk farmasi dapat ditoleransi asalkan produk tetap stabil dan larut
agregat tidak berkembang menjadi bentuk larut. Ada kekhawatiran bahwa peningkatan
tingkat agregat larut mungkin bertanggung jawab untuk perubahan imunogenisitas protein
terapeutik.
agregat larut biasanya bermanifestasi sebagai partikulat terlihat, meskipun pada kesempatan
tingkat dan ukuran partikel sangat kecil sehingga identifikasi visual bisa sulit. agregat larut
telah didokumentasikan untuk insulin dan IL-1. agregat larut dapat dievaluasi oleh sejumlah
teknik solid-state seperti Fourier transform infrared (FTIR) dan Raman dan spin elektron
spektroskopi resonansi. teknik hamburan cahaya seperti penyerapan UV sederhana pada 320
dan 360 nm dapat berguna untuk evaluasi perbandingan sederhana. Protein konsentrasi tekad
menggunakan absorbansi UV sering digunakan dengan latar belakang pengurangan untuk
memperhitungkan tingkat rendah bahan tidak larut.
3.2.2. Adsorpsi
Adsorpsi ke berbagai permukaan telah dieksploitasi untuk keuntungan dalam banyak disiplin
ilmu seperti teknologi analitis dan pemisahan. Ada banyak penelitian-penelitian adsorpsi
dalam literatur analitis dan biomaterial. Kecenderungan untuk protein untuk menyerap
umumnya merupakan masalah yang harus diatasi dalam perumusan dan kontainer pilihan
penutupan produk farmasi. Perawatan juga harus diambil untuk mengevaluasi administrasi
set parenteral untuk kompatibilitas untuk memastikan bahwa dosis yang ditargetkan
disampaikan. Umumnya, adsorpsi lebih merupakan masalah bagi terapi dosis rendah di mana
bagian signifikan dari dosis bisa hilang untuk wadah / penutupan atau administrasi set
permukaan.
Secara umum, penambahan molekul surfaktan untuk formulasi yang dikenal untuk
mengurangi kerugian adsorpsi. Kalsitonin telah terbukti menyerap ke kaca dengan isoterm
adsorpsi Langmuir dan Freundlich jenis, tergantung pada pH. Penambahan surfaktan
nonionik, seperti Pluronic F68 dan Tween 80, untuk kalsitonin solusi menunjukkan

penghambatan adsorpsi dan pengurangan laju adsorpsi.

Adsorpsi protein untuk antarmuka cair-gas, serta antarmuka padat-cair, baru-baru ini menjadi
area yang menarik menggunakan teknik baru seperti x-ray atau refleksi neutron. Studi telah
menyertakan evaluasi dari jumlah terserap, ketebalan total lapisan teradsorpsi, dan pengaruh
pH dan eksipien pada parameter ini. Mikroskop kekuatan atom dalam mode kekuatanspektroskopi telah digunakan untuk menyelidiki kinetika proses adsorpsi fibrinogen mol.
Metode yang berguna untuk Mendeteksi Protein Degradasi / Inaktivasi

4. Metode Analytical
Meskipun metode analisis digunakan untuk mendeteksi dan menjelaskan mekanisme
degradasi polipeptida telah disinggung di bagian yang relevan dari bab ini, Tabel 4
memberikan daftar yang cukup komprehensif metode ini. Biasanya, evaluasi stabilitas
polipeptida akan memerlukan penggunaan beberapa metode (misalnya, salah satu metode
sensitif terhadap perubahan kimia dan satu metode sensitif terhadap modifikasi konformasi).
5. Kesimpulan
Kesimpulannya, polipeptida dan protein yang unik dalam tingkat yang lebih tinggi dari
struktur menunjukkan. Hilangnya struktur tingkat yang lebih tinggi biasanya menghasilkan
aktivitas biologis dengan atau tanpa kehilangan komposisi kimia molekul.
1. Tuliskan agregasi kovalen dapat terjadi dimana saja
Jawab:
Paling umum dari agregasi kovalen terjadi pada pembentukan ikatan disulfida, namun
agregasi juga dapat terjadi melalui amino bebas, karbonil, karboksil, atau kelompok
fungsional hidroksil dengan ester atau amida hubungan, misalnya. Agregat tersebut telah
didokumentasikan untuk insulin dan juga ditemukan selama analisis relaxin.
2. Jelaskan mengenai photodegradasi protein
Jawab:
Kedua pengion dan non ion radiasi dapat menyebabkan inaktivasi protein. Tirosin,
triptofan, dan sistein sangat rentan terhadap radiasi non ion, seperti ultraviolet (UV)
cahaya. Penyerapan foton mengarah ke photoionization dan pembentukan produk
fotodegradasi baik melalui interaksi langsung dengan asam amino atau tidak langsung
melalui berbagai agen kepekaan, seperti oksigen. Umumnya diamati produk fotodegradasi
dalam soda, netral-pH, larutan protein berair termasuk SS obligasi fisi, konversi tirosin
untuk DOPA, 3- (4 hidroksifenil) asam laktat, dan dityrosine, serta fragmentasi olehproduk dan konversi triptofan residu untuk kynurenine dan N-formil-kynurenine. Posisi
residu sensitif dalam struktur tiga dimensi protein yang juga mempengaruhi reaktivitas
menuju fotolisis. Hal ini juga penting untuk memperhitungkan potensi kerusakan protein
selama analisis menggunakan dichroism melingkar (CD), UV, atau neon pengukuran di
mana radiasi insiden sedang digunakan.

3. Jelaskan mekanisme umum dari agregasi protein

Jawab:
Mekanisme yang paling umum dari agregasi protein diyakini melibatkan denaturasi
protein dan asosiasi nonkovalen melalui antarmuka hidrofobik. Denaturasi biasanya
diinduksi pada gas-cair, cair-cair (seperti selama proses mikroenkapsulasi) atau antarmuka
kontainer-cair, meskipun panas, variasi pH, pelarut, garam, dan eksipien dapat juga
berkontribusi.
4. Sebutkan minimal 3 surfaktan yang dapat menstabilkan induksi antarmuka
Jawab:
Tween 80, Pluronic F-68, dan Brij 35
5. Jelaskan mengenai deglikosilasi dan desialilasi
Jawab:
Ada sejumlah protein terapeutik glikosilasi yang memiliki molekul asam gula dan sialic
kovalen melekat pada tulang punggung peptida. Runkel et al. melaporkan bahwa IFNbeta diproduksi dalam kultur sel mamalia sebagai protein glikosilasi, identik dengan
molekul manusia, memiliki stabilitas yang lebih besar untuk agregasi dari protein yang
sesuai yang dihasilkan oleh fermentasi bakteri dalam bentuk nonglikosilasi. Umumnya,
obligasi melampirkan gula dengan protein yang stabil, dan modifikasi dalam struktur
karbohidrat karena proses perubahan selama pembuatan produk. Namun Desialylation
dapat terjadi pada penyimpanan di pH asam.