UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

TRONCO COMUN DIVISIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Y DE LA SALUD.
MODULO: ENERGIA Y CONSUMO DE SUSTANCIAS
FUNDAMENTALES.
PRACTICA No. 2
DETERMINACIN DE PROTENAS.
METODO DE BIURET
INTEGRANTES:

Feria Zarate Nataly Citlalli

Hernndez Garca Juan Carlos
Martnez Martnez Sharon Elideth
Martnez Zamora Eugenia Alejandra
Prez Ros Daniela Lizeth

OBJETIVO:

Manejar en el laboratorio el mtodo de Biuret para determinar protenas.

Observar y determinar experimentalmente el efecto del pH sobre las
protenas de la leche.

GENERALIDADES:

Investigacin bibliogrfica de los estudiantes sobre colorimetra y

punto isoelctrico de protenas.

MATERIAL POR EQUIPO:

1 probeta de 50 ml
2 gradillas
2 pipetas de 10 ml
3 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
Tubos de 15 x 100 12 piezas
1 vaso de precipitados de 100 ml
12 tubos de 16 x 150
1 balanza granataria
Papel parafilm para 10 tubos
Si es necesario, 1 embudo y papel filtro.

REACTIVOS POR EQUIPO:

Agua destilada.
Solucin de cido actico 0.1 N Solucin de acetato de sodio 0.1 N
Solucin de casena (concentracin 4 mg/ml) Reactivo de Biuret 50 ml.
APARATOS POR EQUIPO:

1
1
2
4

centrfuga clnica
balanza granataria
espectrofotmetros
celdas

LOS ALUMNOS DEBERAN TRAER POR EQUIPO:

6 gr. Aproximadamente de leche en polvo descremada

1 plumn indeleble
Masking tape.
Jabn y franela para limpiar.

DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO.

Punto isoelctrico:
El punto isoelctrico es el pH al que un poli anfolito tiene carga neta cero. El
concepto es particularmente interesante en los aminocidos y tambin en
las protenas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para

calcularlo se deben utilizar los pKa.

Para la determinacin del punto isoelctrico se prepar en una serie de tubos

solucin amortiguadora de acetatos junto con cido actico y acetato de sodio
a la siguiente concentracin:
TUBO
1
2
3
4
5
6

Solucin cido
actico 0.1 N
5 ml
4 ml
3 ml
2 ml
1 ml

Solucin acetato
de sodio 0.1 N
1
2
3
4
5

ml
ml
ml
ml
ml

Posteriormente se prepar la mezcla de leche en polvo descremada y agua

destilada para la determinacin del punto isoelctrico la concentracin final de
la leche diluida es de 1:5
A la solucin preparada anteriormente (Tubos 1-6) se le agrego a cada tubo 1ml
de la leche diluida (1:5) y se mezcl por inversin cada tubo, dejndolo reposar
por 10 minutos
En este punto se observa el aspecto de las mezclas preparadas, se nota que el
tubo #3 presenta grumos de leche suspendidos en la solucin, esto se debe a
que las protenas de la leche se han insolubilizado debido al pH de la solucin
este pH es nuestro punto isoelctrico.
Punto Isoelctrico:
Tubo
#3

Solucin cido
actico 0.1 N: 3ml.

Solucin acetato de
sodio 0.1 N: 2ml.

DETERMINACIN DE PROTENAS CON EL METODO DE BIURET.

Mtodo de Biuret:

Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos

NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de
protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera
que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo
se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy
concentrados en este caso la disolucin de leche en polvo.
Para esta determinacin, la solucin preparada anteriormente, y pasado los 10
minutos de reposo se centrifugaron los tubos a 2500 r.p.m. durante 10 minutos
y se separ el sobrenadante transfirindolos a tubos limpios de 15 x 100
rotulados con el nmero de tubo que les corresponde.
Aparte se preparan tubos numerados del I al V, se aaden los reactivos como
se indica en la siguiente tabla
Tubo
Solucin
Patrn 4
mg/ml
Sobrenada
nte
Sobrenada
nte
Sobrenada
nte
Sobrenada
nte
Sobrenada
nte
Sobrenada
Aguante

II
I
0.
6
m
l
0

0
ml

0.
4
ml

0.
2
m
l
0

0.
8
m
l
0

1
ml

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

1
ml

0.
8
m

0.
6
m

0.
4
m

0.
0.
5
5
m
m
los tubos

0.
5
m

0.
5
m

0.
5
m

0.
5
ml

Reactivo
de Biuret
(ml)

II

IV

0.
0
2
ml
m
4.0 ml a todos

Se mescla cuidadosamente cada reactivo y se deja en reposo 30 minutos para

favorecer el desarrollo de color.
Posteriormente se calibra el espectrofotmetro con el tubo 0 y se dispone a
calcular la absorbancia o densidad ptica a cada tubo, obteniendo as los
siguientes resultados:
RESULTADOS

TUBO
I
II
III
IV
1
2
3
4
D.O 0.018 0.045 0.08 0.118 0.067 0.082 0.042 0.04
0.4
0.6
0.8
1
0
0.7
0.8
Gr DE 0.2

0.31
0

0.29
0

PROTEIN
A
Protena

Mg/ml

Mg/100ml

Sobrenadante 1

0.024

2.4

Sobrenadante 2

0.023

2.3

Sobrenadante 3

0.049

2.4

Sobrenadante 4

0.0245

2.45

Sobrenadante 5

0.03

Sobrenadante 6

0.235

2.35

Posterior se calcula el PH del tubo con mayor precipitacin de casena usando

la ecuacin de Heenderson-Haselbach.
ECUACIN DE HENDERSON-HASSELBALCH
Desarrollo:
Supngase un cido AH con disociacin parcial. El equilibrio es:

Y la constante de disociacin asociada ser:

Despejando

de la constante de disociacin:

Tomando logaritmos a ambos lados y aplicando la propiedad de los logaritmos

para un producto se llega a:

E invirtiendo el cociente:

Resultado
Pka= 4.35
3x10-4/ 4x10-4 0.75 log=
-0.1249+4.35= 4.22 pH= 4.22
PH resultante: PH cido
LEY DE RAMBERT-BEER
La absorbancia de radiacin electromagntica producida por una especie
absorbente es directamente proporcional a la trayectoria de la radiacin a
travs de la disolucin y a la concentracin en sta de la sustancia que
produce la absorcin.
La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a su
concentracin (a mayor nmero de molculas mayor interaccin de la luz con
ellas); tambin depende de la distancia que recorre la luz por la solucin (a
igual concentracin, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra ms
molculas se encontrar); y por ltimo, depende de , una constante de

proporcionalidad (denominada coeficiente de extincin) que es especfica de

cada cromfobo.
a=constante de proporcionalidad, absortividad, es una propiedad
intensiva de la materia y por tanto relacionada nicamente con la
naturaleza de la misma.
b=trayectoria de la radiacin a travs de la muestra (cm)
c=concentracin (g/l) , entonces a tiene unidades de lg-1 cm -1
La absortividad pasa a denominarse absortividad molar y se expresa con el
smbolo , cuando la concentracin est en (moles/litro) y b en (cm), siendo sus
unidades lmol-1 cm -1.
Como A es adimensional, las dimensiones de dependen de las de c y l. La
segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se
hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de resultan
ser M-1cm-1. Este coeficiente as expresado, en trminos de unidades de
concentracin molar (o un submltiplo apropiado), se denomina coeficiente de
extincin molar (M). Cuando, por desconocerse el peso molecular del soluto,

la concentracin de la disolucin se expresa en otras unidades distintas de M,

por ejemplo gL-1, las dimensiones de resultan ser distintas, por ejemplo g1Lcm-1, y al coeficiente as expresado se denomina coeficiente de extincin
especfico (s).
Limitaciones:
La ley de Lambert-Beer se encuentran frecuentes desviaciones con relacin a
la proporcionalidad directa entre absorbancias y concentraciones que limitan la
aplicacin de la ley. Las principales causas son:
La concentracin. Slo es aplicable a disoluciones diluidas (menor 10-2
M); en disoluciones concentradas la distancia entre partculas
absorbentes es tan pequea que se produce una modificacin en la
distribucin de cargas de las mismas, lo que se traduce en una
alteracin en la capacidad de absorcin a una longitud de onda
determinada. Este efecto se puede eliminar mediante dilucin.
La interaccin entre el soluto y la radiacin debida a mecanismos
diferentes a la absorcin pero que producen alteraciones en la
intensidad de la luz, tales como la dispersin, reflexin, la fluorescencia,
etc.
Utilizacin de radiacin no monocromtica, puesto que la ley est
definida para radiaciones con una sola longitud de onda. Sin embargo, si
la calidad del equipo no es buena, se obtienen bandas de radiaciones
con un estrecho intervalo de longitudes de onda.
Falta de uniformidad de la muestra o especie absorbente, o presencia de
impurezas.
Desviaciones qumicas, debidas a reacciones del absorbente con el
disolvente