TD 5 : GNTIQUE BACTRIENNE

Exercices et solutions
I - : TAUX DE MUTATION
Soit une culture d'E.coli, sensible la streptomycine, dont la dilution 10-7 , tale
raison de 0,1 ml sur un milieu glos en bote de Ptri, donne aprs incubation, 10
colonies.
1) 0,1 ml de cette culture est tal sur un milieu glos additionn
d'un antibiotique, la streptomycine, une dose suprieure la CMI. Aprs
incubation, la bote de Ptri montre 4 colonies.
Quel est le taux de mutation des rsistants la streptomycine?
9 Lopration effectue consiste taler un volume de 0,1 ml de la dilution
10-7 dune culture dE. coli sur de la glose nutritive. Aprs incubation,
nous avons compt 10 colonies dans la boite ensemence. Cette opration
va nous permettre de dterminer le titre ou la concentration bactrienne de
la culture dE. coli (C).
C = 10 colonies x 107 (facteur de dilution) = 108 UFC/ 0,1 ml = 109 UFC/ml
9 Lorsquon a tal 0,1 ml de la culture non dilue dE. coli (108 UFC) sur de
la glose nutritive additionne de la streptomycine une concentration
suprieure la CMI (GN + Stp), nous avons obtenu, aprs incubation, 4
colonies.
Quel est le phnotype de ces quatre colonies ?
Les quatre colonies sont des E. coli rsistant la streptomycine. Cette rsistance
est apparue spontanment au sein de la population analyse (108 UFC).
Quel est le taux de mutation des rsistants la streptomycine?
Tm1 = Nombre de mutants / nombre total des individus composant la population analyse

Tm1 = 4 UFC / 108 UFC ;

Tm1 = 4x10-8

NB : le taux de mutation est sans unit

2) La culture initiale est traite par un agent mutagne, la nitrosoguanidine, puis tale comme prcdemment raison de 0,1 ml sur le mme
milieu glos la streptomycine (GN + Stp). Aprs incubation, la bote de Ptri
montre 40 colonies.
Calculez le taux de mutation (Tm2) des rsistants. Comparez cette
valeur celle trouve prcdemment et conclure.

On appelle agent mutagne tout facteur qui peut entraner une mutation. Il peut
s'agir dun facteur physique (radiations ionisantes, par ex) ou chimique (ex
nitroso-guanidine).
Dans cette deuxime opration, nous avons trait la culture dE. coli (Stp S) par un
agent mutagne chimique (la nitroso-guanidine). Ensuite 0,1 ml de la culture traite
est tal sur glose nutritive + streptomycine (GN + Stp). Aprs incubation, nous
avons dnombr 40 colonies.
Combien de germes bactriens traits la nitroso-guanidine a t-on dpos sur la GN
+ Stp ?
Rponse : nous avons dpos 0,1ml de la culture non dilue dE. coli cest dire un
nombre quivalent 108 UFC.
Quel est le taux de mutation (Tm2) aprs traitement la nitroso-guanidine ?
Tm2 = 40 / 108;

Tm2 = 4x10-7

On remarque que Tm2 > Tm1

Au niveau de la dernire exprience, nous avons en plus des mutants spontans,
dautres mutants induits par lagent mutagne. La nitroso-guanidine a augment
la probabilit des modifications de lADN et par consquent le nombre de bactries
devenues rsistantes la streptomycine.

II: MUTANTS DFICIENTS (AUXOTROPHES)

Six clones d'E.coli numrots de 1 6, sont cultivs sur milieu minimum MM

additionn de thronine (Thr), leucine (Leu), Phnylalanine (Phe) et cystine
(Cys), puis repiqus par la technique du tampon de velours sur huit milieux
minima MM diversement additionns d'un ou de plusieurs de ces quatre acides
amins, comme indiqu sur la figure. Les clones qui poussent sur les botes de
Ptri sont indiqus par leurs numros.

6
4

2
3

2
3

MM +Thr

MM + Cys

MM + Leu

2
3

MM+ Thr + Leu

1
MM + Cys +Phe

MM + Phe

MM + Thr
+ Phe + Leu

1
MM + Cys
+ Phe +Leu

Indiquer quels sont les phnotypes qui correspondent ces 6 clones

Solutions :

La technique de velours consiste en : (velours = elmoubra en arabe)

Un morceau de velours strile est tendu sur un cylindre de mtal ou de bois dont
le diamtre est lgrement plus petit que celui dune bote de Ptri. En appuyant
lgrement le velours sur une glose en bote de Ptri contenant des colonies
bactriennes, une fraction de chaque colonie est transfre sur le velours. En
appliquant ensuite la surface du velours sur une autre glose vierge, on obtient
d'un seul coup un repiquage colonie par colonie de la premire glose, et en
rptant les rpliques , on peut repiquer l'ensemble des colonies d'une bote de
Ptri sur de multiples botes.

Sur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe), les six clones se dveloppent.

Ceci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun dentre eux est peut
tre prototrophe

ou auxotrophe (pour 1 acide amin, deux, trois ou tous les

quatre).
Nous allons essayer de traiter clone par clone pour dterminer leurs phnotypes
correspondants : chaque clone est peut tre prototrophe ou auxotrophe (pour 1
acide amin, deux, trois ou tous les quatre).

Clone n1
Ce clone se dveloppe sur le MM+Thr : Cela veut dire quil est capable de

pousser en absence de la Cystine, de la Leucine et de la Phnylalanine

(Il nest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amins).
Il faut voir sil exige la Thronine (Thr) pour sa croissance ou non. Or nous

remarquons quil se dveloppe sur les autres milieux (en absence de la

Thr).
Ce clone est donc prototrophe : Thr+ Cys+ Leu+ Phe+

Clone n2 : Ce clone se dveloppe sur le MM+Thr : Cela veut dire quil est capable de

pousser en absence de Cys, Leu et Phe (Il nest pas donc auxotrophe pour
ces trois derniers acides amins).
Il faut voir sil exige la Thronine (Thr) pour sa croissance ou non. Nous

remarquons quil ne se dveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de

Thr.
Ce clone est donc auxotrophe pour la Thronine : Thr

Cys+ Leu+ Phe+

Clone n3 :
Ce clone se dveloppe sur le MM+Cys : Cela veut dire quil est capable de

pousser en absence de Thr, Leu et Phe (donc, Il nest pas auxotrophe pour
ces trois derniers acides amins).
Il faut voir sil exige la Cystine (Cys) pour sa croissance ou non. On note

quil ne se dveloppe pas sur les autres milieux quand la cystine est
absente.

Ce clone est donc auxotrophe pour la Cystine : Thr+ Cys Leu+ Phe+

Clone n4 :
Ce clone ne se dveloppe pas sur le MM avec un seul acide amin : Cela

veut dire quil exige au moins deux acides amins diffrents. Il se

dveloppe uniquement sur MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu.
Rien quon nous basant sur ce rsultat, nous pouvons dduire facilement

que ce clone nest auxotrophe ni pour la Phnylalanine (Phe) ni pour la

Cystine (Cys).
Ce clone est donc auxotrophe pour la Thronine et la Leucine :

Thr Cys+ Leu

Phe+

Clone n5 : Il est peut tre prototrophe ou auxotrophe (pour un, deux, trois ou
tous les quatre).
Ce clone ne se dveloppe pas sur le MM avec un seul acide amin : Cela

veut dire quil exige au moins deux acides amins diffrents. Il se

dveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu.
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe, nous
pouvons dduire que ce clone nest pas auxotrophe pour la Thronine (Thr)
ni pour la Leucine (Leu) . Labsence de lun des deux autres acides amins
(Cys ou Phe)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cystine et la Phnylalanine :
+

Thr Cys Leu

Phe

Clone n6 :
Ce clone ne se dveloppe pas sur le MM avec un seul acide amin : Cela

veut dire quil exige deux ou trois acides amins diffrents.

Autrement-dit, il pourrait tre Cys- Phe- ; Phe- Leu- ; Cys- Leu- ou Cys- PheLeu-.
Vrification : Sur MM+Cys+Phe, il ne se dveloppe pas ; sur MM+Phe+Leu, il ne
se dveloppe pas non plus ; mais nous navons pas test MM+Cys+Leu. Il pourrait
donc tre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-.
Pour trancher il faut repiquer le clone n6 sur un milieu minimum additionn

de Cystine et de Leucine.
Sil se dveloppe cest quil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ ; sil ne se dveloppe pas
cest quil est Thr+ Cys- Leu- Phe-

III: CONJUGAISON INTERROMPUE

On mlange une souche d'E.coli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ): pouvoir
de synthtiser la thronine et la leucine, (T1s): sensible au phage T1, (Lac+):
fermentant le lactose, (Gal +): fermentant le galactose, (Strs): streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-), (T1r), (Lac-), (Gal-), et
(Strr). On interrompt la conjugaison aux temps indiqus ci-contre et on tale pour
chaque temps des chantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants. Les rsultats sont:
10 mn : (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn : (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn : (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn : (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Dterminez l'ordre des gnes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s).
Cette exprience consiste en un transfert dADN par conjugaison (passage du
matriel gntique dune bactrie (donatrice) vers une bactrie (rceptrice) aprs
contact troit.
Il existe des souches qui transmettent leur ADN avec une frquence de
recombinaison

leve:

ce

sont

des

souches

Hfr

(haute

frquence

de

recombinaison). Les souches Hfr possdent des pili sexuels. Les bactries
rceptrices sont en gnral F-.
Les expriences de conjugaison interrompue permettent d'tablir la carte gntique
de la bactrie.
Principe: On ralise un croisement (conjugaison) entre une souche bactrienne :
Hfr : StrS a+ b+ c+ d +...
et une souche F- : Strr a - b - c - d On prlve des chantillons des intervalles de temps dtermins. L'agitation
violente du milieu permet dinterrompre le transfert gntique entre les deux souches
(donatrice et rceptrice).
Chaque chantillon est mis en culture dans un milieu spcifique appel milieu de
criblage.
Un milieu de criblage est un milieu qui permet la slection des recombinants ou
trans-conjugants (rceptrice ayant reu du matriel gntique de la donatrice).

Les chantillons sont placs sur 5 milieux diffrents, supplments chacun avec des
mlanges de substances diffrentes:
un milieu sans A, mais avec B, C et D permet la croissance des cellules qui auront
intgr le gne a+ .
un milieu sans B, mais avec A, C et D permet la croissance des cellules ayant intgr
le gne b+ .
Le chromosome Hfr est transfr la cellule F- d'une manire linaire, commenant
en un point spcifique pour chaque souche, l'origine O. Plus un gne est loign de
O plus il est tardivement transfr F-.
Ceci permet l'tablissement de cartes de liaison, utilisant comme mesure de la
distance entre les gnes le temps de pntration.

Dans notre exprience nous avons travaill avec les souches ci-dessous :
Hfr : ( T+ L+), (T1s), (Lac+), (Gal+), et (Strs) : Donatrice
F- :

( T- L-), (T1r), (Lac-), (Gal-), et (Strr).

: Rceptrice

Nous avons dfini les recombinants comme tant des rceptrices ayant reu du
matriel gntique de la donatrice. Par consquent, les gnotypes des recombinants
vont correspondre celui de la rceptrice avec lacquisition dun ou de plusieurs
caractres de la donatrice.
9 Aprs 10 minutes de contact entre la donatrice et la rceptrice, la rceptrice

a reu les gnes (T+L+)

9 Aprs 15 min : elle a reu les gnes (T+L+) et le gne (T1s)

9 Aprs 20 min : elle a reu les gnes (T+L+), le gne (T1s) et le gne (Lac+)
9 Aprs 28 min : elle a reu les gnes (T+L+), le gne (T1s), le gne (Lac+) et

le gne (Gal+)
Lordre des gnes est le suivant :

Notez quon peut par ailleurs, estimer la distance entre les gnes par les temps
ncessaires leur passage dans la rceptrice.