Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian senyawa dari

campuran dengan memakai kolom. Kromatografi kolom termasuk kromatografi preparatif. Kromatografi
kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal yang pertama kali di lakukan oleh D.T.Davy yaitu
untuk membedakan komposisi minyak bumi. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan
kromatografi serapan atau adsorbsi. Kromatografi kolom digolongkan kedalam kromatografi cair padat
(KCP) atau kolom pak dan kolom terbuka.
Dalam kromatografi gas, kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan. Untuk kromatografi
gas, dikenal dua jenis kolom yaitu jenis pak (packed column) dan jenis terbuka (open tubular column). Jenis
pak terbuat dari stinless steel. Sedangkan jenis kolom terbuka terbuat dari pipa kapiler. Ke dalam kolom jenis
pak diisi zat pendukung dan fasa diam yang menempel pada zat pendukung.
a. Kolom pak (packed column).
Kolom pak terbuat dari stainless steel atau gelas dengan garis tengah 3-6 mm dan panjang 1-5 m. kolom
diisi dengan serbuk zat padat halus atau zat padat sebagai zat pendukung yang dilapisi zat cair kental yang
sukar menguap sebagai fasa diam. Jenis kolom pak ini lebih disukai untuk tujuan preparatif karena dapat
menampung jumlah cuplikan yang banyak.
b. Kolom terbuka (open tubular column).
Kolom terbuka (kolom kapiler) ukurannya lebih kecil dan lebih panjang dari pada kolom pak. Diameter
kolom terbuka berkisar antara 0,1-0,7 mm dan panjangnya berkisar antara 15-100 m. kromatografi kolom
terbuka biasa dipakai secara luas karena caranya yang sederhana. Untuk mempermudah penyimpanan,
biasanya kolom terbuka di bentuk spiral dengan garis tengah 18 cm. kolom terbuka bisa sampai 100 m
panjangnya di karenakan bagian dalam kolom tidak terhalang oleh fasa diam. Tetapi kolom terbuka tidak
dapat menampung volume cuplikan yang banyak. Semakin panjang kolom, di harapkan kolom akan lebih
efisien. Dengan kolom terbuka, efisiensi, selektivitas dan retensi akan bertambah.
Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran
dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada
cara pemisahan cair-padat. Substrat padat (adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut
dalam fase cair. Fase bergeraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran
sepanjang kolom. Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa komponen komponen
dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang berbeda-beda terhadap adsorben dalam
kolom. Apabila kita mengalirkan cairan ( elutor ) secara kontinyu melalui kolom yang berisi zat contoh yang
telah diadsorpsikan oleh penyarat kolom, maka yang pertama tama dihanyutkan elutor ialah komponen
yang paling lemah terikat kepada adsorben. Komponen komponen lainnya akan dihanyutkan menurut
urutan afinitasnya terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan daripada komponen komponen tersebut.
Pemisahan tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di antara butiranbutiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fase bergeraknya. Antara molekulmolekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga

menimbulkan proses dinamis. Keduanya secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan
masuk kembali pada fase bergerak. Pada saat teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase
bergerak yang ditambahkan secara kontinyu. Akibatnya hanya komponen yang mempunyai afinitas lebih
besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan. Komponen dengan afinitas paling kecil akan bergerak
lebih cepat mengikuti aliran pelarut.
Teknik pemisahan kromatografi kolom partisi sangat mirip dengan kromatografi kolom adsorpsi.
Perbedaan utamanya terletak pada sifat dari penyerap yang digunakan. Pada kromatografi kolom partisi
penyerapnya berupa materi padat berpori seperti kieselguhr, selulosa atau silika gel yang permukaannya
dilapisi zat cair (biasanya air). Dalam hal ini zat padat hanya berperan sebagai penyangga (penyokong) dan
zat cair sebagai fase diamnya. Fase diam zat cair umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat yang sejauh
mungkin inert terhadap senyawa-senyawa yang akan dipisahkan. Zat padat yang penyokong harus penyerap
dan menahan fase diam serta harus membuat permukaannya seluas mungkin untuk mengalirnya fase
bergerak. Penyangga pada umumnya bersifat polar dan fase diam lebih polar dari pada fase bergerak. Dalam
kromatografi partisi fase bergeraknya dapat berupa zat cair dan gas yang mengalir membawa komponenkomponen campuran sepanjang kolom. Jika fase bergeraknya dari zat cair, akan diperoleh kromatografi
partisi cair-cair. Teknik ini banyak digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik maupun anorganik.
Resin penukar ion adalah suatu bahan padat yang memiliki bagian (ion positif atau negatif) tertentu
yang bisa dilepas dan ditukar dengan bahan kimia lain dari luar. Berdasarkan jenis ion/muatan yang
dipertukarkan, resin dapat dibagi menjadi 2 yaitu resin penukar kation adalah ion positif yang dipertukarkan
dan resin penukar anion adalah ion negatif yang dipertukarkan. Ion Exchange adalah proses penyerapan ion
ion oleh resin dengan cara Ion-ion dalam fasa cair (biasanya dengan pelarut air) diserap lewat ikatan
kimiawi karena bereaksi dengan padatan resin. Resin sendiri melepaskan ion lain sebagai ganti ion yang
diserap. Selama operasi berlangsung setiap ion akan dipertukarkan dengan ion penggantinya hingga
seluruh resin jenuh dengan ion yang diserap.
Besarnya nilai kapasitas penukar dari resin penukar ion tergantung pada jumlah gugus ion yang dapat
ditukarkan yang terkandung dalam setiap gram bahan resin tersebut. Semakin besar jumlah gugus-gugus
tersebut, maka semakin besar pula nilai kapasitas resinnya. Besarnya nilai kapasitas resin diketahui agar
dapat memperkirakan berapa banyaknya resin yang diperlukan dalam analisa kimia dengan menggunakan
metode kromatografi kolom. Apabila resin telah mengikat jumlah ion yang sama dengan kapasitas
maksimumnya maka resin tersebut dikatakan telah exchausted. Dalam keadaan demikian resin dapat
dikembalikan ke keadaan semula dengan jalan menuangkan larutan asam yang agak pekat ke dalamnya

sehingga terjadi reaksi kebalikan dari reaksi penukaran ion. Resin penukar anion dapat berupa ko-polimer
stiren dan divinil benzen tetapi tidak mengandung gugusan-gugusan amin yang bersifat basa dengan resin
penukar anion terjadi pengubahan yang jumlahnya ekuivalen.
Parameter yang di gunakan dalam mengevaluasi kinerja kolom, setelah mengoptimumkan
efesiensi pemisahan secara kromatografi, mutu kromatografi dapat di kendalikan dengan menerapkan uji
kesesuian sistem tertentu. Salah satu diantaranya adalah perhitungan pelat pelat teoritis untuk suatu kolom
dan terdapat dua parameter utama lainnya untuk menilai kinerja.

Persyaratan kolom
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di sembarang tempat suddah tentu

sedapat mungkin harus sama. Keseragaman ini dapat dicapai dengan memilih adsorben yang ukuran butir
butirnya sama ( diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik. Makin kecil ukuran butir adsorben, makin
cepat keseimbangan adsorpsi akan tercapai, dan makin besar pula kecepatan elusi yang boleh dipergunakan.
Tetapi dilain pihak, makin kecil butir adsorben, makin besar hambatan bagi cairan yang harus mengalir
melalui kolom. Apabila kecepatan lintas bagi cairan elutor terlalu kecil, dapat dipergunakan pompa vakum
yang menimbulkan tekanan rendah dalam ruang di bawah kolom sehingga cairan dapat mengalir lebih cepat
melalui kolom. Cara yang lain ialah menambahkan tekanan dalam ruang di atas kolom dengan menggunakan
pompa pneumatic.

Bentuk kolom
Penempatan adsorben dalam kolom secara uniform betul sangat sukar dilaksanakan. Sebagai

akibatnya, zona zona komponen yang dipisahkan menjadi kurang teratur bentuknya. Bagi kolom yang lebar
hal ini dapat menyebabkan pembauran. Tetapi bagi kolom kecil bahaya ini seberapa besar. Namun di lain
pihak, kolom yang lebar dan pendek itu lebih memudahkan dalam pemakaiannya. Oleh karena itu, tinggi
kebanyakan kolom ialah 20 kali diameternya. Di bawah tabung yang umumnya terbuat dari gelas terdapat
lempengan meduk yang terbuat dari porselen atau dari serbuk gelas yang dipanaskan hingga melengket jadi
satu. Lempengan yang berbentuk cakram ini bergawai sebagai penahan fasa yang stasioner. Di bagian tabung
yang paling bawah terdapat kapiler penyulur dilengkapi dengan pancur. Kapiler beserta pancur dirakitkan
dengan kolom memakai suku asah sehingga mudah dilepaskan guna membersihkan kolom dan untuk meniup
kolom sehingga menjadi bersih dari cairan. Ruang antara pancur dan cakram penyaring harus sekecil
mungkin supaya tidak terjadi pembauran antara cairan cairan yang keluar dari kolom.

Kecepatan arus

Semakin rendah kecepatan arus cairan, semakin baik akibatnya bagi tercapainya keseimbangan
adsorpsi dan akan semakin baik pula pemisahannya. Bentuk zona pun menjadi lebih teratur. Tetapi kecepatan
arus yang terlalu rendah dapat menimbulkan efek difusi axial dalam fasa mobil yang harus dihindarkan
sejauh mungkin. Jadi dapat dikatakan bahwa pemisahan yang terbaik dapat dicapai dengan mempergunakan
kolom yang panjang dan sempit, diisi dengan adsorben yang berbutir halus, dan arus yang lambat. Elusi
dapat dimulai apabila campuran yang harus dipisahkan sudah dimasukan dalam kolom. Elusi ini dilakukan
dengan memasukan cairan elutor berenyai renyai melalui kolom dan harus dijaga supaya arusnya tidak
berhenti. Komponen komponen yang telah diadsorpsikan oleh adsorben akan bergerak dalam bentuk gelang
gelang atau zona dengan kecepatan yang berbeda beda melalui kolom dan ditampung di bawah kolom
secara terpisah memakai beberapa tabung yang dibubuhi tanda tanda. Tabung tabung ini ditempatkan
dalam sebuah fraksikolektor. Setelah itu fraksi fraksi yang diperoleh mulai dapat diselidiki.

Perolehan data
Suatu integrator, jika berdasarkan mikroprosesor atau perakat lunak pc, hanya mengukur jumlah total

arus yang mengalir melewati lebar puncak suatu kromatografi. Untuk melakukan hal ini , integrator
mengukur laju peningkatan tegangan lebih kurang 30 kali melintasi lebar puncak tersebut. Parameter yang
menunjukan waktu pengukuran harus di mulai adalah ambang batas puncak tersebut, yang menentukan
tingkat ketika tegangan sinyal tersebut harus di naikkan sebelum akumulasi sinyal terjadi. Untuk mencegah
penyimpanan aliran garis dasar, kemiringan kenaikan harus memiliki ketajaman tertentu sebelum di anggap
suatu puncak.

Perhitungan Efesiensi Kolom

Semakin lebar suatu puncak kromatografi yang sebanding dengan waktu retensinya, semakin kurang

efesien kolom pengelusinya.

Persamaan 1
dengan n adalah jumlah pelat teoretis.
Efesiensi kolom biasanya dinyatakan dalam pelat teoretis per meter:
n x 100/L
Pengukuran efesiensi kolom yang lebih ketat, terutama jika waktu retensi analit tersebut singkat, di
nyatakan dengan persamaan 2.
Persamaan 2
Dengan N eff adalah jumlah pelat yang efektif dan mencerminkan berapa kali analit berpartisi antara fase
gerak dan fase diam selama pergerakannya melalui kolom dan tr =tr t0
N eff = 5, 54 (tr : W1/2)
Persamaan lain yang di gunakan sebagai pengukuran adalah H, tinggi pelat teoretis

H=L/N eff
Dengan h adalah panjang kolom yang di butuhkan untuk berlangsungnya satu tahap partisi. (Watson 2005)

Pemisahan pada kolom

Pada pemisahan campuran-campuran pada kolom, solut di cirikan dengan waktu retensi (tR) dan

faktor retensi (k) yang berbanding lurus dengan D. Waktu retensi merupakan lamanya waktu yang di
butuhkan solut untuk melewati kolom. Waktu retensi dan faktor retensi di hubungkan oleh persamaan
berikut:
tR=tM(1+k)
tM terkadang di tulis t0 dan di kenal sebagai waktu mati merupakan waktu yang di butuhkan oleh solut yang
tidak tertahan untuk melewati kolom. Solut yang tidak tertahan akan bermigrasi dengan kecepatan yang sama
dengan fase gerak, karenanya perbandingan distribusi (D) dan faktor retensinya adalah 0 akan tertahan
secara profosional dan akan mempunyai waktu retensi yang lebih besar dari pada tM, misal:
jika k = 1 maka tR= 2tM
jika k = 2 maka tR = 3tM
kondisi kromatografi umumnya di atur sedemikian rupa sehingga nilai k lebih kecil dari pada 20 untuk
menghindari waktu retensi yang terlalu panjang. Nilai k dapat di hitung dengan menyusun ulang persamaan
di atas:
tR=tM (1=k) maka k = (tR-tM) / tM
dalam kromatografi ukuran eksklusi, solut di karakterisasi dengan volume retensi (Vr) yang merupakan
volume fase gerak yang di butuhkan untuk mengelusi solut dari kolom. Waktu retensi berbanding langsung
dengan volume retensi pada kecepatan alir yang konstan sehingga persamaan di atas dapat di tulis kembali:
Vr=Vm (1+k)
Sementara nilai k dapat di ganti dengan:
k=D(Vs / Vm)
dengan menggabungkan kedua persamaan ini maka akan di peroleh:
Vr=Vm(1+D Vs / Vm)
Atau
Vr=Vm+DVs
Vs dan Vm masing-masing merupakann volume fase diam dan volume vase gerak dalam kolom.
Persamaan tersebut merupakan persamaan pundamental pada kromatografi kolom karena berhubungan
dengan volume retensi solut terhadap perbandingan distribusinya.
Dalam kromatografi kolom di kenal beberapa istilah yaitu:
1. Fase gerak

Fase gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Eluen di pilih sedemikian rupa sehingga faktor
retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisasi penggunaan waktu dan jumlah eluen
melewati kolom. Jenis eluen yang digunakan dalam kromatografi kolom dipiih supaya senyawa yang
berbeda dapat dipisahkan secara efektif.
2. Fase diam
Umumnya fase diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah adsorben padat. Biasanya
berupa silica gel atau alumina. Fasa diam berbentuk serbuk microporous untuk meningkatkan luas
permukaan.
Metode yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah:
a. Metode kering
Pada metode kering, diisi dengan fasa diam kering, di ikuti dengan penambahan fasa gerak yang
disirangkan pada kolom sampai benar-benar basah.
b. Metode basah
Pada metode basah, bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk fasa diam dan
dimasukkan dengan hati-hati, supaya tidak ada gelembung udara. Larutan senyawa organic di pipet di
bagian atas fasa diam, kemudian eluen dituangkan pelan-pelan melewati kolom.
Cara kerja kromatografi kolom:
Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adsorben karena telah terikat. Ketika eluen di alirkan,
maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masingmasing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama
proses berlangsung, akan di dapati beberapa fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung
senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat di amati menggunakan
KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati
lebih lanjut menggunakan spektroskopi.
Proses kromatografi dapat diamati pada gambar: