Anda di halaman 1dari 9

ARTIKEL ILMIAH

PRAKTIKUM BIOKIMIA

PENGARUH WAKTU HIDROLISIS PROTEIN GELATIN OLEH ENZIM PROTEASE


TERHADAP VOLUME NaOH DAN mg NITROGEN ASAM AMINO MELALUI
TITRASI FORMAL ASAM AMINO
Oleh:
Ni Wayan Sri Ratmini (1313031046)

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA


FAKULTAS MATEMATIKA DAN PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA
SINGARAJA
2016

PENGARUH WAKTU HIDROLISIS PROTEIN GELATIN OLEH ENZIM PROTEASE


TERHADAP VOLUME NaOH DAN mg NITROGEN ASAM AMINO MELALUI
TITRASI FORMAL ASAM AMINO
Oleh
Ni Wayan Sri Ratmini (1313031046)
Jurusan Pendidikan Kimia, FMIPA, Universitas Pendidikan Ganesha
Jalan Udayana Singaraja, Bali
e-mail: wayansriratmini@gmail.com
ABSTRAK
Tujuan percobaan ini adalah untuk menghidrolisis protein dengan enzim protease dan untuk membuat kurva
hubungan antara volume NaOH terhadap waktu hidrolisis pada titrasi formal asam amino. Percobaan ini dilakukan
dengan metode kuantitatif yaitu titrasi formal asam amino. Hasil yang diperoleh dari percobaan ini adalah volume
NaOH yang dibutuhkan pada titrasi menit ke-0, 15, 30, 45, 60, 75, dan 90 berturut-turut sebanyak 0,7 mL, 0,9 mL,
1,5 mL, 1,6 mL, 1,7 mL, 1,8 mL dan 1,9 mL. Berdasarkan perhitungan yang dilakukan, jumlah mg nitrogen yang
dihasilkan pada sampel menit ke-0, 15, 30, 45, 60, 75, dan 90 berturut-turut sebanyak 1,96 mg, 2,52 mg, 4,2 mg,
4,48 mg, 4,76 mg, 5,04 mg dan 5,32 mg. Derajat hidrolisis protein gelatin berdasarkan percobaan dan perhitungan
yang dilakukan adalah 0,0133. Kurva hubungan antara waktu dengan volume NaOH dan mg Nitrogen adalah
berbanding lurus. Semakin lama waktu hidrolisis, maka volume NaOH yang digunakan dalam titrasi dan jumlah mg
nitrogen yang dihasilkan akan semakin banyak.
Kata Kunci : asam amino, enzim protease, gelatin, hidrolisis, titrasi formal

ABSTRACT
The objectives of these experiments was to hydrolyze the protein with protease enzymes and to make the curve of the
relationship between the volume of NaOH and hydrolysis time on formal titration of amino acids. This experiment
was conducted using a quantitative formal titration of amino acids. The results obtained from this experiment is the
volume of NaOH used to titrate sample from minute 0, 15, 30, 45 60, 75, and 90 respectively as 0,7 mL, 0,9 mL, 1,5
mL, 1,6 mL, 1,7 mL, 1,8 mL dan 1,9 mL. Based on calculations performed mg amount of nitrogen produced in
minute samples of 0, 15, 30, 45, 60, 75, and 90 respectively as much as 1,96 mg, 2,52 mg, 4,2 mg, 4,48 mg, 4,76
mg, 5,04 mg dan 5,32 mg. The degree of protein hydrolysis of gelatin based on experiments conducted is
0,0133.Curve relationship between time with the volume of NaOH and mg Nitrogen is directly proportional. The
longer the time of hydrolysis, the volume of NaOH used in titration and the amount of nitrogen mg produced will be
more
Keywords: amino acids, formal titration, gelatyn, hydrolyze, protease enzymes.

PENDAHULUAN
Protein berasal dari akar kata protos dari
bahasa Yunani yang berarti yang paling
utama. Protein adalah senyawa organik
kompleks dengan berat molekul tinggi yang
merupakan polimer dari monomer-monomer
asam amino yang dihubungkan satu sama lain
dengan ikatan peptida. Molekul protein
mengandung unsur karbon, hidrogen, oksigen,

nitrogen dan kadang sulfur serta fosfor. Suatu


molekul protein disusun oleh sejumlah asam
amino tertentu dengan susunan yang sudah
tertentu dan bersifat turunan (Aisjah Girindra
dalam Tika, 2010).
Asam amino merupakan ion dipolar yang
pada umumnya mempunyai dua atau lebih

pKa. Asam amino yang menyusun suatu


protein tertentu, kadar asam aminonya tidak
sama. Protein jika dihidrolisis akan
menghasilkan asam amino bebas. Asam amino

tidak larut di dalam eter karena merupakan


senyawa dipolar dan dalam air menunjukkan
struktur kutub ganda (Zwitter ion) yaitu:

H
R

H
COOH

(aq)

NH2

COO -

(aq)

NH3+

Gambar 1. Struktur dipolar asam amino


Dari gambar tersebut, gugus amino
diprotonasi dan hadir sebagai ion
ammonium, sedangkan gugus karboksil
kehilangan protonnya dan hadir sebagai
anion karboksilat. Struktur ini konsisten
dengan sifat asam amino yang seperti
garam, yang memiliki titik leleh agak tinggi.
Asam amino bersifat amfoterik artinya
berperilaku sebagai asam dan mendonasikan
proton pada basa kuat atau dapat juga
berperilaku sebagai basa dan menerima
proton dari asam kuat.
Bila suatu protein dihidrolisis, akan
didapatkan asam aminonya. Hidrolisis
protein
dapat
dilakukan
dengan
menggunakan enzim protease dari tripsin.
Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan
asam amino bebas. Asam amino bebas ini
bila direaksikan dengan formaldehid
berlebih akan membentuk derivate metilol.
Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas
bentuk isoelektrik kehilangan satu proton
dari gugus NH3+ (Tika, 2010).
H+ yang dilepaskan pada reaksi ini
dapat dititrasi langsung dengan NaOH
sampai dengan pH 8,0 (titik akhir indicator
ekuivalen). Titrasi asam amino atau
campuran asam amino dalam keberadaan
formaldehid disebut dengan titrasi formal
asam amino. Titrasi ini merupakan metode
analisis untuk mengikuti pembentukan asam
amino bebas yang dihasilkan pada proses
hidrolisis protein oleh enzim proteotik (Tika,
2010).

Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi


dari asam amino yang diperoleh dari hasil
hidrolisis protein dengan menggunakan
enzim protease dari tripsin. Tripsin adalah
suatu enzim proteolitik atau enzim yang
mengkatalisis hidrolisis protein. Tripsin
mengkatalisis hidrolisis ikatan amida di
bagian karboksil dari lisin atau arginin
(Fessenden, 2010). Selama hidrolisis suatu
protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus
amino bertambah terus. Penentuan secara
kuantitatif salah stau gugus akan dapat
memberikan indikasi untuk mengetahui
derajat hidrolisis protein. Menurut teori
zwiiterion, kalau suatu asam amino dalam
larutan dititrasi dengan basa, berarti ion
hydrogen dari ammonium yang dititrasi.
Gugus ammonium dari asam amino yang
bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di
atas pH 11, sehingga tidak mungkin dititrasi
sampai titik akhir. Hal yang sama juga
terjadi pada gugus karboksil yang bersifat
buffer pada pH rendah sehingga tidak
mungkin juga dititrasi dengan basa (Tika,
2010).
Untuk mengatasi hal tersebut, maka
formaldehid ditambahkan ke dalam larutan
asam amino agar bereaksi dengan gugus
amino yang tidak bermuatan sehingga
memungkinkan
gugus
ammonium
membuffer pada daerah pH yang lebih
rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir
secara kuantitatif menggunakan indicator
(Tika, 2010).

Penambahan formalin ke dalam larutan


asam amino akan membentuk dimetilol.
Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus
amino dari protein sudah terikat dan tidak
akan mempengaruhi titik akhir titrasi
sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan
dengan tepat. Indikator yang digunakan
adalah fenolptalein (Tika, 2010).

diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen.


Gelatin merupakan protein yang larut dan
bersifat gelling agent (bahan pembuat gel).
Sumber bahan baku gelatin dapat berasal
dari tulang dan kulit dari sapi atau babi.
Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi
besar, protein dan 4-hidroksi residu.
Struktur gelatin adalah sebagai berikut:

Pada praktikum ini digunakan gelatin


yang merupakan produk alami yang

O
N
H

H
C

O
C

H
N

H2
C C

CH 3

H
N

H
N

H
C

O
C

H
N

O
H2
C C

H
N

H
C

CH2

CH 2

CH2

CH 2

NH

NH

O
C

H
N

O-

NH 2

OH
C

NH

CH2
C
NH

O
O
C

Gambar 2. Struktur Gelatin (Sumber: Tika, 2010)

MATERI DAN METODE


Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam percobaan ini
adalah gelas kimia 100 mL, labu Erlenmeyer
100mL, buret 50 mL, statif dan klem, spatula,
batang pengaduk, labu ukur 100 mL, kaca
arloji, termometer, pipet tetes dan labu ukur 25
mL. Bahan yang diperlukan dalam percobaan
ini adalah larutan glisin 1%, NaOH 0,2 M,
HCl 0,1 M, indikator PP 1%, larutan
formaldehid 40%, larutan tripsin 1% dan
aquades.
Prosedur Kerja
Penyiapan Larutan Gelatin
Sebanyak 250 mL larutan gelatin
ditambahkan 1 mL fenolftalein dan NaOH 0,2

M tetes demi tetes hingga timbul warna merah


muda. Setelah itu larutan gelatin ditambahkan
tetes demi tetes larutan HCl 0,1 mL sampai
warna merah mudanya hilang. Larutan
kemudian direndam pada inkubator air dengan
suhu 38oC selama beberapa menit.
Penyiapan Larutan Tripsin
Larutan tripsin sebanyak 25 mL
ditambahkan dengan 1 mL larutan
fenolftalein dan tetes demi tetes larutan
NaOH 0,2 M sampai timbul warna merah
muda. Larutan tripsin yang berwarna merah
muda direaksikan dengan tetes demi tetes
larutan HCl 0,1 M sampai hilang warna
merah mudanya hilang. Larutan kemudian
diinkubasi dalam inkubator air pada suhu
38oC selama beberapa menit.

Titrasi Formal Asam Amino


Larutan tripsin dan larutan gelatin
dicampurkan dan diaduk perlahan. Setelah
tercampur merata, 10 mL campuran diambil
dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 100
mL. Larutan ini digunakan sebagai kontrol
atau waktu nol. Larutan kemudian dididihkan
untuk merusak enzim kemudian didinginkan.
Larutan yang sudah dingin ditambahkan 15
mL formalin netral dan 3 tetes indikator PP,
kemudian dititrasi menggunakan NaOH 0,2

M. Langkah di atas diulang pada interval


waktu 15, 30, 45, dan 60 menit dari waktu
nol. Data yang didapat digunakan untuk
membuat kurva titrasi.

HASIL DAN PEMBAHASAN


Berdasarkan percobaan yang telah
dilakukan pada proses penyiapan larutan
gelatin dan tripsin, diperoleh hasil pengamatan
seperti yang disajikan dalam tabel berikut.

Tabel 1. Hasil Pengamatan pada Proses Penyiapan Larutan Gelatin dan Tripsin
Larutan
Gelatin
Gelatin + PP
Gelatin + PP + NaOH

Warna yang larutan


Bening kekuningan
Bening kekuningan
Merah muda

Gelatin + PP + NaOH + HCl

Bening kekuningan

Tripsin
Tripsin + PP
Tripsin + PP + NaOH
Tripsin + PP + NaOH + HCl

Putih kekuningan
Putih kekuningan
Merah muda
Putih kekuningan

Penambahan larutan fenolftalein (PP)


berfungsi
sebagai indikator yang akan
menunjukkan perubahan warna ketika pH
lingkungannya berubah. Penambahan larutan
NaOH bertujuan agar larutan bersifat sedikit
basa. setelah ditambahkan NaOH,larutan
berubah warna menjadi merah muda (lihat

gambar 3b). Campuran kemudian ditambahkan


HCl tetes demi tetes hingga warna merah muda
hilang (lihat ambar 2c). Tujuan penambahan
HCl ini adalah agar pH menjadi 8 karena pada
pH ini enzim tripsin mampu bekerja secara
optimal.

Gambar 3. (a) Larutan Gelatin bening kekuningan, (b) Gelatin +PP + NaOH berwarna merah muda, (c)
Gelatin + PP + NaOH setelah ditambah HCl berwarna bening kekuningan
Hal yang sama juga dilakukan pada
larutan tripsin. Larutan tripsin berwarna putih

kekuningan (lihat gambar 4a). Setelah


ditambahkan indikator PP dan NaOH larutan

berubah warna menjadi merah muda (lihat


gambar 4b). Penambahan NaOH bertujuan
untuk membuat larutan menjadi bersifat sedikit

basa. Selanjutnya dilakukan penambahan HCl


yang menyebabkan larutan kembali berwarna
putih kekuningan (lihat gambar 4c).

Gambar 4. (a) larutan tripsin berwarna putih kekuningan, (b) tripsin + indikator PP + NaOH
berwarna merah muda, (c) tripsin + indikator PP + NaOH setelah ditambah HCl
berwarna putih kekuningan
Selanjutnya dilakukan inkubasi terhadap
larutan gelatin dan tripsin dengan inkubator air
suhu 38oC agar enzim protease dapat bekerja
secara optimal. Suhu dijaga jangan sampai
melebihi 38oC karena bisa terjadi pembentukan
gel yang sangat mempengaruhi proses
degradasi untuk menghasilkan asam amino.
Selanjutnya setelah diinkubasi, maka kedua
larutan ini dicampur. Tujuan pencampuran ini
adalah untuk mengdegradasi larutan gelatin
dengan menggunakan enzim tripsin. Tripsin
merupakan enzim proteolitik yang hanya terdiri
dari suatu rantai polipeptida. Enzim ini akan
mendegradasi gelatin menghasilkan asam
amino penyusunnya.
10 mL larutan campuran tripsin dan
gelatin ini diambil dan dididihkan untuk
merusak enzim, kemudian didinginkan
(digunakan sebagai sampel kontrol atau waktu
nol). Setelah didinginkan larutan ditambahkan
15 mL formalin netral dan 3 tetes indikator PP.
Pada titrasi ini dipilih indikator PP karena
trayek pH indikator PP adalah 8,3-12, sehingga
sesuai dengan pH larutan yaitu pH=8. Larutan
kemudian dititrasi dengan NaOH 0,2 M.
Larutan ini digunakan sebagai kontrol atau
sampel waktu nol. Prosedur yang sama diulangi
dalam selang waktu 15 menit sampai menit ke-

60. Data hasil titrasi kemudian dicatat


kemudian dapat dibuat kurva titrasinya.
Penambahan formalin netral dilakukan
agar gugus karbonil dalam formalin bereaksi
dengan asam amino yang tidak bermuatan
sehingga memungkinkan gugus amonium
bereaksi dengan NaOH dan membuffer pada
pH yang lebih rendah. Reaksi yang terjadi
secara keseluruhan dalam titrasi formal asam
amino dapat dilihat dalam gambar 5.
H
R

COOH

( aq)

H
-

COO

(aq)

( aq)

NH3 +

NH 2

COO -

+
H

(aq)

NH3+

COOH

CH2OH

(aq)

O
C
H

H
R
HOH2 C
H

H
R

COOH

HOH2 C

CH2OH (aq)

NaOH

(aq)

COOH

CH2OH

(aq)

dimethilol

COO-Na+

HOH 2C

CH2OH (aq)

Natrium dimethilol

Gambar 5. Reaksi Keseluruhan dalam Titrasi


Formal Asam Amino

H 2O (l)

Volume NaOH yang dibutuhkan dalam titrasi


sampel waktu ke-0, 15, 30, 45, 60, 75, dan 90
menit disajikan dalam tabel 2. Berdasarkan
data yang terdapat pada tabel 2, dapat dibuat

kurva hubungan antara volume NaOH


terhadap waktu pada titrasi formal asam amino
(lihat gambar 6).

Tabel 2. Data Volume NaOH yang Digunakan dalam Titrasi

Waktu (menit)
0
15
30
45
60
75
90

Volume NaOH (mL)


0,7
0,9
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9

Gambar 6. Kurva Hubungan Volume NaOH terhadap Waktu

Berdasarkan grafik di atas, dapat


dinyatakan bahwa semakin lama larutan
dibiarkan, maka semakin banyak volume
NaOH yang digunakan untuk proses titrasi.
Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis
gelatin oleh tripsin menghasilkan sejumlah
asam amino yang konsentrasinya bertambah
seiring dengan bertambahnya kontak antara
larutan gelatin dengan larutan tripsin. Derajat
hidrolisis dari enzim tripsin juga dapat
dihitung berdasarkan kurva di atas, yaitu
dengan perhitungan sebagai berikut:

Derajat hidrolisis
Derajat hidrolisis

V NaOH
t
(1,9 0,7)
(90 0)

0,0133

Jadi, derajat hidrolisis dari asam amino


adalah 0,0133
Dengan mengasumsikan 1 mL NaOH
ekivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino,
maka dapat dihitung jumlah mg asam amino
pada tiap volume NaOH saat titrasi seperti
perhitungan berikut;

Pada waktu t = 0
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 13,00
mL
Mol NaOH = 13,00 mL x 0,02 M = 0,26 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg
nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,26
mmol NaOH ekuivalen dengan:
0,1 mmol
1,4 mg

0,26 mmol
x mg

0,26 mmol
1,4 mg 3,64 mg
0,1 mmol

nitrogen asam amino


Dengan perhitungan yang sama dapat
dihitung pula miligram nitroen pada menit ke15, 30, 45, 60, Data mg asam amino untuk tiap
volume NaOH dapat dilihat pada tabel 3.
Berdasarkan data tabel 3, dapat dibuat
kurva hubungan antara massa nitrogen terhadap
waktu (lihat gambar 7).

Tabel 3. Jumlah Miligram Nitrogen untuk Masing-masing Volume NaOH


Waktu (menit)
Volume NaOH (mL)
mg Nitrogen Asam Amino
0
0,7
1,96
15
0,9
2,52
30
1,5
4,2
45
1,6
4,48
60
1,7
4,76
75
1,8
5,04
90
1,9
5,32

Gambar 7. Kurva Hubungan mg Nitrogen terhadap Waktu


Berdasarkan kurva pada gambar 7, dapat
dilihat bahwa jumlah mg Nitrogen semakin
banyak seiring dengan bertambahnya waktu.

SIMPULAN
Berdasarkan uraian pembahasan di atas dapat
dibuat simpulan sebagai berikut:
1. Larutan
gelatin
(protein)
dapat
dihidrolisis dengan menggunakan tripsin
(enzim protease) dan menghasilkan asam
amino.
2. Berdasarkan kurva pada gambar 6 dan
gambar 7 diperoleh bahwa semakin lama
waktu inkubasi larutan campura gelatin
dan tripsin, maka volume NaOH yang
diperlukan dalam titrasi dan milligram
Nitrogen yang dihasilkan akan semakin
banyak.
UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., sebagai

dosen pengampu dan I Dewa Subamia selaku


laboran di Jurusan Pendidikan Kimia atas
masukan dan sarannya sehingga percobaan
ini dapat dilaksanakan dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA
Fessenden dan Fessenden. 1994. Kimia
Organik Jilid 2. Edisi Ketiga. Jakarta :
Erlangga.
Redhana, I Wayan dan Siti Maryam. 2003.
Penuntun Praktikum Biokimia.
Singaraja : IKIP Negeri Singaraja
Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun Praktikum
Biokimia.
Singaraja:
Universitas
Pendidikan Ganesha
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Praktikum
Biokimia.
Singaraja:
Universitas
Pendidikan Ganesha
Wirahadikusuma,
Muhamad.
2001.
Biokimia :Protein, Enzim, dan Asam
Nukleat.
Bandung : PenerbitITB