Abstract

Selama dekade terakhir penghambatan kolinesterase plasma (ChE) aktivitas

telah banyak digunakan sebagai biomarker untuk mendiagnosa organofosfat dan
eksposur karbamat. Kegiatan Plasma ChE adalah metode yang berguna dan noninvasif untuk memantau paparan burung untuk senyawa antikolinesterasi; tetap
beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa bentuk ChE (s) hadir dalam
plasma burung dapat sangat bervariasi di antara spesies. Dalam rangka
mendukung studi biomonitoring lebih lanjut dan memberikan data referensi bagi
satwa liar penilaian risiko, plasma cholinesterase dari gannet Utara (Morus
bassanus), bangau putih (Ciconia ciconia) dan Cangak Abu (Ardea cinerea) yang
ditandai dengan tiga substrat (acetylthiocholine iodida, propionil thiocholine
iodida, dan S-butyrylthiocholine iodida) dan tiga inhibitor ChE (eserine sulfat,
BW284C51, dan iso-OMPA). Selain itu, berbagai kegiatan ChE yang dapat
dianggap sebagai tingkat basal untuk individu non-terpapar ditentukan. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa dalam plasma dari tiga spesies yang dipelajari
bentuk cholinesterase utama sekarang adalah butyrylcholinesterase (BChE).
Kegiatan Plasma BChE pada individu non-terkena adalah 0,48 0,11 SD U / ml,
0,39 0,12 SD U / ml, 0,15 0,04 SD U / ml di gannet utara, bangau putih dan
heron abu-abu, masing-masing. Hasil ini sangat penting untuk penggunaan lebih
lanjut dari kegiatan BChE plasma spesies burung ini sebagai bioindikator
pencemaran agen anti-cholinesterase di kedua lahan basah dan lingkungan laut.
Temuan kami juga menggarisbawahi pentingnya plasma ChE karakterisasi
sebelum digunakan sebagai biomarker dalam studi biomonitoring dengan
burung.

Introduction
Cholinesterase (ChE) aktivitas telah secara rutin digunakan sebagai biomarker
untuk mendiagnosa paparan antikolinesterasi senyawa seperti organofosfat (OP)
dan karbamat (CB) pestisida. pestisida ini secara luas digunakan untuk
mengendalikan hama serangga dan vektor penyakit; Meskipun demikian, mereka
bisa sangat beracun untuk organisme non-target seperti mamalia dan burung
[1], [2], [3], [4]. Mereka bertindak dengan menghambat aktivitas kolinesterase,
yang menyebabkan akumulasi lebih dari asetilkolin pada sinapsis dan gangguan
akibat dari fungsi saraf, menyebabkan gangguan fisiologis berikutnya dan
akhirnya kematian [5]. Selain Ops dan CB, kontaminan lingkungan lainnya
seperti logam, deterjen dan produk turunan minyak bumi telah ditemukan untuk
menghasilkan efek penghambatan yang sama [6], [7], [8]. Serum atau plasma
telah secara luas digunakan untuk mengukur aktivitas ChE sebagai metode noninvasif untuk memantau paparan satwa liar untuk pestisida di lapangan karena
kepekaan terhadap ChE-menghambat senyawa [9], [10], [11], [12 ]. Meskipun
demikian, penggunaannya membutuhkan karakterisasi bentuk enzim (s) hadir
dalam jaringan diuji dan penentuan rentang normal dari aktivitas pada individu
non-terpapar [13].
Dua enzim membentuk keluarga kolinesterase: acetylcholinesterase (AChE; EC
3.1.1.7) dan butyrylcholinesterase (BChE; EC 3.1.1.8). Kedua mengkatalisis

hidrolisis asetilkolin neurotransmitter, namun berbeda dalam substrat

kekhususan dan inhibitor kerentanan [14], [15]; jaringan distribusi juga dapat
bervariasi, tergantung pada organisme diukur. AChE yang terutama ditemukan di
persimpangan neuromuskular dan sistem saraf pusat, memainkan kunci-peran
dalam neurotransmisi kolinergik, sementara BChE terutama ditemukan dalam
serum dan hati, tetapi peran fisiologis utama yang tetap tidak diketahui [14].
Mengenai paparan satwa liar untuk kontaminan lingkungan, burung air, seperti
mengarungi burung dan burung laut, merupakan indikator yang bermanfaat dari
variasi lingkungan pada skala temporal pendek dan panjang [16]. Spesies
burung terutama indikator kualitas lahan basah karena mereka dapat menempati
berbagai mencari makan relung, termasuk kolam pertanian, yang membuat
mereka sering spesies non-target untuk OP dan paparan CB melalui konsumsi
dan kontak kulit [12]. Dalam kasus burung laut, mereka banyak digunakan untuk
memantau terjadinya dan ekologi dampak kontaminan seperti minyak dan
merkuri di lingkungan laut [17]. Semua kemungkinan eksposur ini dapat
menyebabkan menjadi penurunan kegiatan ChE pada burung, dan karena itu
biomarker seperti ini mungkin juga merupakan indikator yang berguna untuk
mendeteksi kontaminasi di habitat burung '. Pada burung, AChE ditemukan
dalam otak sementara BChE terutama hadir dalam plasma; Meskipun demikian,
beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa AChE dan esterase lain (misalnya
carboxylesterase- CBE) juga mungkin terjadi dalam plasma burung dengan
perbedaan lebar antarspesies [3], [18].
Untuk menggunakan plasma ChE sebagai biomarker dari paparan di tiga spesies
burung asli Portugis, tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk: (i) mencirikan
bentuk ChE (s) hadir dalam plasma burung ', (ii) menentukan tingkat basal
aktivitas ChE pada individu non-terpapar dan (iii) membangun kondisi assay
sesuai untuk penggunaan aktivitas ChE plasma, menggunakan sebagai jenis
burung: jenis burung bangau abu-abu (Ardea cinerea) dan bangau putih (Ciconia
ciconia), dua mengarungi penduduk di Portugal, dan gannet utara (Morus
bassanus), burung laut bermigrasi umum di sepanjang pantai Portugal selama
musim dingin.
Bahan dan metode
pengumpulan sampel
Semua spesies burung yang digunakan untuk mengkarakterisasi plasma ChE
adalah individu dewasa yang mendiami Gaia Biological Park, sebuah cagar alam
yang terletak di Avintes (Porto, Portugal). C. ciconia individu yang hidup bebas di
taman sambil individu dari A. cinerea dan M. Bassanus berada di penangkaran.
Stres gangguan yang disebabkan oleh penanganan hewan diminimalkan dengan
membatasi kunjungan panjang, menghindari pengambilan sampel apapun
selama kondisi cuaca ekstrim (mis hujan lebat, suhu rendah) dan menggunakan
mantel kecil untuk menutupi kepala.
Darah diambil dari vena brakialis dengan steril jarum suntik 1 ml dan jarum 25ga, dan itu dikumpulkan ke dalam tabung kapiler dengan EDTA (Microvette CB

300, Sarstedt). Berikut sentrifugasi, plasma diekstraksi dan disimpan pada -80
C sampai analisis.
persiapan sampel dan penentuan ChE
sampel plasma diencerkan dalam buffer fosfat (0,1 M, pH 7,2), dan aktivitas ChE
ditentukan dalam rangkap empat menurut metode Ellman [19] disesuaikan
dengan lempeng [20] menggunakan microplate reader (Thermo Scientific
Multiskan Spectrum). Untuk semua spesies, pengenceran plasma untuk setiap
individu disusun menggunakan 2 ml plasma (2-ml mikropipet, Gilson) untuk
volume uji akhir dari 1 ml. Aktivitas enzimatik dinyatakan dalam unit (U) per ml
plasma (1 U adalah umol substrat dihidrolisis per menit).
karakterisasi cholinesterase
Plasma ChE ditandai dengan menguji preferensi substrat dari enzim dan
sensitivitas mereka terhadap inhibitor selektif. Dalam percobaan independen,
acetylthiocholine iodida (AcSCh), S-butyrylthiocholine iodida (Busch) dan
propionylthiocholine iodida (PrSCh) digunakan sebagai substrat untuk
meningkatkan konsentrasi (0,005-20,5 mM) dan aktivitas enzimatik ditentukan.
Eserine sulfat, 1,5-bis (4-allyldimethyl-ammonimphenyl) pentan-3-satu dibromida
(BW284C51) dan tetraisopropyl pyrophosphoramide (iso-OMPA) dipilih sebagai
inhibitor selektif semua ChE (s), AChE dan BChE, masing-masing [ 21], [22].
Untuk setiap inhibitor, larutan stok disiapkan dalam air ultra murni atau etanol,
yang sesuai, dengan konsentrasi berkisar 6,25-200 pM (eserine dan BW284C51)
dan 0,25-8,0 mM (iso-OMPA). Untuk setiap inhibitor, 5 ml larutan stok diinkubasi
dengan 495 ml dari sampel selama 30 menit, pada 25 1 C, sebelum
penambahan substrat. ChE kemudian diuji menggunakan kedua AcSCh dan
Busch sebagai substrat. air ultra murni ditambahkan ke kontrol dan kontrol
tambahan etanol digunakan dalam percobaan dengan iso-OMPA. Dalam semua
prosedur karakterisasi, tiga sampel plasma sesuai dengan tiga orang dewasa per
specie digunakan.
tingkat basal untuk aktivitas ChE dominan
Dalam rangka untuk menentukan rentang aktivitas normal dari bentuk dominan
ChE hadir dalam plasma dari M. bassanus, C. ciconia dan A. cinerea, sampel
plasma dari individu non-terpapar diuji seperti yang dijelaskan sebelumnya dan
substrat disesuaikan digunakan . Dalam hal ini, sebagai BChE adalah bentuk
dominan hadir (lihat detail di bagian Hasil) Busch digunakan sebagai substrat
pada konsentrasi 10,24 mM. Jumlah individu berkisar 4-5 per jenis burung; subulangan dari setiap individu berkisar 8-16.
Bahan kimia
5,5'-Dithiobis (asam 2-nitrobenzoic), AcSCh, Busch, PrSCh, eserine hemisulphate,
iso-OMPA, dan BW284C51 diperoleh dari Sigma-Aldrich Eropa (Belanda). Semua
bahan kimia lainnya yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dari Merck
(Jerman).

Analisis data
Analisis varians (ANOVA) dilakukan untuk membandingkan perbedaan antara
konsentrasi inhibitor ketika kriteria normalitas dan kesetaraan varians puas (bila
diperlukan, data ditransformasikan menggunakan log 10 atau akar kuadrat). Uji
Dunnet ini digunakan untuk membedakan perbedaan statistik antara perlakuan
dan kontrol. Semua analisis data yang dilakukan dengan menggunakan
SigmaStat 3.5 software (Systat Software Inc.).
pernyataan etika
Semua prosedur yang melibatkan penanganan burung dilakukan sesuai dengan
Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Laboratorium Hewan Uni Eropa - di
Portugal diwakili oleh Decreto de Lei n 129/92 de 06 de Julho, Portaria n 10051092 de 23 de Outubro de 1992. Persetujuan oleh bernama papan institusi atau
etika ulasan panitia tidak diperlukan sebagai model akhir untuk eksperimen etika
menggunakan hewan belum diterapkan di unit penelitian Portugis.
hasil
Dalam rangka untuk menyelidiki preferensi substrat ChE di plasma dari spesies
yang dipelajari, substrat AcSCh, PrSCh dan Busch diuji untuk meningkatkan
konsentrasi (Gbr. 1). aktivitas enzim maksimum M. bassanus diamati dengan
AcSCh di 10,24 mM (1,14 0,08 SE U / ml), sementara di C. ciconia dan A.
cinerea aktivitas maksimum diperoleh dengan PrSCh di 20,48 mM (0,97 0,11
SE U / ml ) dan 5.15 mM (0.32 0.03 SE U / ml), masing-masing. Enzim
parameter kinetik Vmax (tingkat maksimum hidrolisis mencapai ketika enzim
jenuh dengan substrat) dan Km (konsentrasi yang diperlukan untuk mencapai
satu-setengah dari kecepatan maksimum) untuk spesies yang dipelajari
digambarkan dalam Tabel 1. enzim afinitas tertinggi di M. bassanus diperoleh
dengan AcSCh (Km = 15,3 M), sedangkan di C. ciconia diperoleh dengan Busch
(Km = 4,8 M) dan A. cinerea dengan PrSCh (Km = 150,1 M).

Diskusi
Tujuan pertama dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi bentuk ChE
(s) hadir dalam plasma dari M. bassanus, C. ciconia dan A. cinerea. Untuk
mencapai itu, langkah pertama adalah untuk membedakan ChE bentuk (s) dari
esterases spesifik. Prosedur ini sangat penting untuk menghindari potensi
sumber kesalahan dalam penelitian biomarker karena jaringan mungkin
mengandung sejumlah besar esterases spesifik yang mungkin berkontribusi
terhadap total aktivitas enzim diukur, namun berbeda dalam kepekaan mereka
terhadap senyawa ChE-menghambat [13]. Kehadiran esterases spesifik
ditentukan dengan menggunakan eserine sulfat, yang merupakan inhibitor
selektif dari semua aktivitas cholinesterase di kisaran 10-6 untuk 10-5 M [21].
Dalam studi ini, aktivitas enzimatik diukur dalam plasma dari spesies yang
dipelajari hampir sepenuhnya dihambat oleh eserine dalam kisaran pM, yang
menunjukkan bahwa enzim dominan (s) sekarang adalah (yang) ChE (s), bukan
jenis lain dari esterases.

Dalam rangka untuk lebih membedakan mana ChE bentuk (s) adalah (yang)
hadir, preferensi substrat dari enzim dan kepekaan terhadap BW284C51 dan isoOMPA diuji. Kegiatan ChE diukur dalam plasma dari M. bassanus menunjukkan
preferensi untuk AcSCh (Gambar 1A.); Sebaliknya, plasma ChE C. ciconia dan A.
cinerea ditampilkan preferensi substrat terhadap PrSCh (Gambar. 1B dan 1C).
Juga, aktivitas enzimatik terpantau stabil pada konsentrasi substrat yang lebih
tinggi, dengan tidak ada penurunan aktivitas ChE. Tingkat yang lebih tinggi dari
aktivitas enzimatik terdaftar AcSCh di M. bassanus bisa ditafsirkan sebagai tanda
kehadiran AChE, meskipun enzim penghambatan pada konsentrasi substrat yang
lebih tinggi tidak diamati karena akan diharapkan untuk AChE vertebrata yang
khas; selain itu, aktivitas enzim yang relatif tinggi diperoleh ketika menggunakan
Busch (sekitar 76% dari aktivitas diperoleh dengan AcSCh di 5.12 mM), yang
dianggap sebagai substrat spesifik untuk BChE [23]. Dua jenis burung lainnya
menunjukkan preferensi terhadap PrSCh, tapi meskipun Busch adalah substrat
dibelah pada tingkat terendah, aktivitas enzim dengan substrat ini cukup tinggi
(sekitar 54% dan 78% dari aktivitas diperoleh dengan PrSCh di 20,5 mM, di C.
ciconia dan A. cinerea, masing-masing). Hasil ini tampaknya menunjukkan
kehadiran kedua bentuk ChE, AChE dan BChE. Hal ini sesuai dengan banyak
penelitian yang telah menunjukkan bahwa sebagian besar dari total aktivitas
ChE dalam plasma burung disebabkan BChE, meskipun aktivitas AChE juga dapat
terjadi pada tingkat yang signifikan dan rasio antara dua bentuk ChE mungkin
sangat bervariasi di antara spesies [ 3], [18], [24]. Setelah pendekatan pertama
ini, untuk lebih mencirikan ChE (s) hadir dalam plasma dari spesies yang
dipelajari, alat tes inhibisi dengan BW284C51 dan iso-OMPA dilakukan
menggunakan kedua AcSCh dan Busch, untuk memperjelas yang akan menjadi
bentuk yang paling dominan.
Dalam semua spesies yang dipelajari, tidak berpengaruh pada aktivitas ChE
diamati dengan BW284C51, inhibitor selektif AChE, menggunakan kedua AcSCh
dan Busch; Selanjutnya, aktivitas ChE plasma sangat dihambat oleh iso-OMPA
menggunakan kedua AcSCh dan Busch. Hal ini tampaknya menunjukkan
kehadiran di semua jenis enzim yang memotong kedua AcSCh dan Busch, yang
tahan terhadap BW284C51 (inhibitor AChE) tapi sangat sensitif terhadap isoOMPA (inhibitor spesifik aktivitas BChE) [22]. Oleh karena itu, hasil ini
menunjukkan bahwa enzim hadir dalam plasma dari spesies yang dipelajari
adalah BChE. Hasil ini sesuai dengan sebagian besar studi yang diterbitkan di
daerah penelitian ini untuk burung. Misalnya, Strum et al. [3] dan Fildes et al.
[24] juga menemukan BChE menjadi dominan ChE bentuk hadir dalam plasma
dari SparrowHawk (Accipiter nisus), burung hering Mesir (Neophron
percnopterus), yang songlark coklat (Cincloramphus cruralis) dan pipit
Australasia (Anthus novaeseelandiae).
Seperti vertebrata lainnya, dalam kegiatan BChE studi plasma sekarang dari
gannet Utara (M. bassanus), bangau putih (C. ciconia) dan Cangak Abu (A.
cinerea) menunjukkan perilaku Michaellis-Menten. Plasma BChE M. bassanus dan
C. ciconia menunjukkan afinitas yang lebih tinggi untuk Busch (Km = 19,4 dan
4,8 pM, masing-masing) dibandingkan vertebrata lain seperti bulu Mustela vison
(Km = 240 M) dan kadal Gallotia galloti (Km = 1 103 M), tetapi mirip dengan

merpati Columbia livia (Km = 32 M) dan tikus Rattus novergicus (Km = 13 M)

[25], [26]. Nilai Km dari Cangak Abu (A. cinerea) diperoleh dengan Busch lebih
tinggi daripada yang dilaporkan untuk dua spesies yang dipelajari lain, tetapi
lebih kecil dari yang diperoleh dengan M. vison, G. galloti dan mesopotamicus
Pioractus ikan (Km = 1,2 103 M) [25], [26].
Kegiatan Plasma BChE pada individu non-terpapar M. bassanus, C. ciconia dan A.
cinerea berada dalam rentang nilai yang dilaporkan dalam literatur selama
beberapa burung non-terpapar. Misalnya, berarti BChE nilai aktivitas diukur
untuk alap-alap (Falco Tinnunculus), burung pemakan bangkai yang (Buteo
Buteo) dan burung hantu cokelat (Strix aluco) yang 0,28 0,08 SD U / ml, 0,91
0,8 SD U / ml dan 1,49 0,36 SD U / ml, masing-masing [18]. Goldstein et al.
[27] juga mengukur aktivitas BChE rata-rata 0,41 0,09 SD U / ml di elang
Swainson (Buteo swainsoni), dan Strum et al. [3] berpendapat bahwa nilai BChE
0,83 0,01 SD U / ml dalam emas-Cerek Amerika (Pluvialis dominica) dan 1,15
0,45 SD U / ml di Killdeer yang (Charadrius gencar). Baseline plasma nilai BChE
dari spesies yang disajikan dalam penelitian ini akan memberikan alat yang
berguna di masa depan untuk perbandingan dengan potensi mabuk /
menekankan burung tetapi penggunaannya harus dilakukan dengan hati-hati.
Kegiatan ChE mungkin berbeda dengan beberapa faktor alam seperti musim,
suhu dan tahap kehidupan [15]. Selain itu, harus dipertimbangkan bahwa ukuran
sampel dari pengukuran diperoleh relatif rendah, meskipun tingginya jumlah
ulangan per individu dilakukan untuk mengurangi kesalahan eksperimental.
Untuk masa depan bekerja dengan spesies ini, itu dianjurkan penggunaan Busch
~ 10 mM, karena merupakan substrat khusus untuk BChE dan karena dalam
spesies yang dipelajari aktivitas enzim maksimum dengan substrat ini terpantau
stabil pada konsentrasi itu.
Kesimpulannya, variabilitas dalam kegiatan ChE dari spesies yang dipelajari
dibandingkan dengan spesies burung lain yang sebelumnya dipelajari
menggarisbawahi pentingnya plasma ChE karakterisasi sebelum digunakan
sebagai biomarker dalam studi biomonitorization dengan burung. Untuk
digunakan lebih lanjut dari kegiatan ChE plasma sebagai biomarker untuk
mendiagnosa paparan antikolinesterasi senyawa dalam M. bassanus, C. ciconia
dan A. cinerea, Busch tampaknya menjadi substrat yang paling cocok untuk
pengukuran enzimatik, karena BChE ditemukan menjadi bentuk ChE dominan
hadir dalam spesies yang dipelajari. Data yang disajikan di sini memberikan titik
awal untuk penggunaan aktivitas BChE plasma sebagai biomarker dalam spesies
burung asli Portugis, membantu investigasi lapangan dan memantau risiko
paparan non-target satwa liar untuk senyawa ChE penghambat. Selain itu,
pengukuran aktivitas BChE mungkin menjadi alat yang menjanjikan untuk
digunakan pada burung disimpan di penangkaran dan pulih dari stres fisik atau
kimia, untuk mengevaluasi kebugaran mereka dan kemungkinan rilis.
Ucapan Terima Kasih

pekerjaan ini telah dilakukan berkat kontribusi dari Gaia Biological Park (Avintes,
Portugal), khususnya Pusat Rehabilitasi Hewan Liar, yang membantu kita untuk
mendapatkan sampel unggas.
penulis Kontribusi
Disusun dan dirancang percobaan: CS MM. Melakukan percobaan: CS.
Menganalisis data: CS MM AS SL. Kontribusi reagen / bahan / alat analisis: AS SL.
Menulis kertas: CS.