Plasmid, vektor, enzim

restriksi, kloning gen

Dalam bioteknologi, teknik yang digunakan sering
disebut dengan Teknologi DNA rekombinan
Teknologi DNA rekombinan merupakan teknologi
untuk memasukkan fragmen DNA asing ke dalam
suatu jasad hidup (sel mikroba, sel tumbuhan dan
hewan)

Teknologi rekombinan DNA memerlukan

bahan dan teknik, sbb.:
1.

Sumber DNA: berasal dari jasad donor (DNA hasil ekstraksi),

DNA hasil sintesa (diantaranya dengan tehnik PCR), dan atau
cDNA (yg berasal dari mRNA yg diisolasi dari jaringan organ
tertentu)

2.

enzim : restriksi endonuklease dan ligase

3.

Vektor : plasmid, virus dan bakteriofag

4.

Teknik pemasukan hibrid DNA serta teknik seleksi keberadaan

hibrid di dalam sel inang

1. Sumber DNA

1. Sintesa DNA dapat terjadi secara alami di dalam tubuh mahluk hidup atau
dilakukan secara sintetis (molekul DNA buatan).
Di dalam tubuh mahluk hidup, molekul DNA disintesa melalui proses
replikasi DNA
2. DNA juga bisa dibuat dengan menggunakan tehnik
polymerase chain reaction (PCR). Dengan tehnik ini DNA disintesis secara
enzimatik menggunakan mesin thermocycler yang dapat mengubah suhu
reaksi pemanasan (heating) dan pendinginan (cooling) secara cepat untuk
memungkinkan terjadinya denaturasi dan renaturasi DNA untuk terjadinya
proses replikasi DNA.
3. DNA juga bisa dibuat dengan menggunakan RNA sebagai template.
Reaksi enzimatik dengan template RNA dan menggunakan tehnik PCR
menghasilkan DNA yang disebut complementary DNA (cDNA)

2. ENZYME

Type II restriction
endonuclease:
Cleaves DNA at a specific base
sequence
DNA ligase:
Binds two DNA molecules or
fragments

DNA polymerase I:
Fills single-stranded gaps in duplex
DNA by stepwise addition of
nucleotides to 3' ends
[removes RNA primer
Reverse Transcriptase:
Makes a DNA copy of an RNA
molecule

Polynucleotide Kinase:
Adds a phosphate to the 5'-OH end
of a polynucleotide, to label it or
permit ligation.
Terminal transferase:
Adds homopolymer tails to the 3'OH ends of a linear duplex

Alkaline phosphatase:
Removes terminal phosphates
from the 5' end, the 3' end, or
both.

Exonuclease III:
Removes nucleotide residues from
the 3' ends of a DNA strand
Bacteriophage {lamda}
exonuclease:
Removes nucleotides from the 5'
ends of a duplex to expose 3'
single-stranded ends

Restriction enzymes
Restriction enzymes are DNA-cutting
enzymes found in bacteria (and
harvested from them for use). Because
they cut within the molecule, they are
often called restriction endonucleases.

Restriction enzymes are enzymes isolated

from bacteria that recognize specific
sequences in DNA and then cut the DNA to
produce fragments, called restriction
fragments. Restriction enzymes play a very
important role in the construction of
recombinant DNA molecules, as is done in
gene cloning experiments. Another
application of restriction enzymes is to map
the locations of restriction sites in DNA.

Berbagai endonuklease restriksi serta spesifitasnya

Mikrobe

Enzim

Sisi pemotongan

BamHI

G GATCC
CCTAG G

BalI

TGG CCA
ACC GGT

Escherichia coli RY13

EcoRI

G AATTC
CTTAA G

Haemophillus algyptus

HalII

Pu GCGC Py
Py CGCG Pu

Haemophillus aegyptius

Hae III

GG CC
CC GG

Haemophillus influenzae

HindII

GTPy PuAC
CAPu PyTG

Haemophillus paraingfluenza

HpaII

Bacillus amylotiquefaciens H
Brevibacterium albidium

CC GG
GG CC

3. VECTOR

 Vektor adalah replikon yang akan melakukan replikasi DNA di

dalam sel atau membawa gen asing ke dalam resipien, atau
Molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan
yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam
sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi
fragmen DNA asing tersebut.
Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot :
khususnya E. coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan
fasmid.
Vektor YACs dan YEps dapat digunakan pada khamir.
Vektor yang dapat digunakan pada sel inang eukariot :
Plasmid Ti, baculovirus, SV40

Syarat-syarat Vektor:
1. Harus mampu melakukan replikasi secara mandiri
di dalam sel inang (plasmid, bakteriofag seperti fag
lamda E-coli dan virus
2. Harus ada cara tertentu untuk masuknya vektor
DNA ke dalam sel
3. Harus dapat diketahui dg mudah keberadaanya di
dalam sel
4. Harus aman untuk digunakan

PLASMID
Molekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang dapat
melakukan replikasi sendiri.
Plasmid tersebar luas diantara organisme prokariot dengan
ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb hingga lebih
Salah satu contoh plasmid buatan yang banyak digunakan
dalam kloning gen adalah pBR322.Urutan basa lengkapnya
telah ditentukan sehingga baik tempat marker maupun
pengenalan restriksinya juga telah diketahui.

Sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi

Syarat
1. Mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan
dengan pori dinding sel inang sehingga dapat
dengan mudah melintasinya,
2. Mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker
yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke
dalam sel inang,
3. Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurangkurangnya di dalam salah satu marker yang dapat
digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen
DNA, dan
4. Mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat
melakukan replikasi di dalam sel

Replication of Plasmid

Cloning

Plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens

Suatu bakteri, yaitu Agrobacterium tumefaciens, yang
membawa plasmid berukuran 200 kb dan disebut plasmid
Ti(tumor inducing atau penyebab tumor).
Ketika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid Ti, yang
disebut T-DNA, akan terintegrasi ke dalam DNA
kromosomtanaman, mengakibatkan terjadinya pertumbuhan
sel-sel tanaman yang tidak terkendali, sehingga terbentuk
tumor atau crown gall.
Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang
disisipkan pada daerah T-DNA dapat mengintegrasikan gen
tersebut ke dalam DNA tanaman. Gen target ini selanjutnya
akan dieskpresikan menggunakan sistem DNA tanaman.

Bakteriofag
Adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri.
Dengan daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik
bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor cloning pada sel
inang bakteri
Bakteriofag merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri
E. coli.
DNA yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi
linier untai ganda dengan panjang 48,5 kb.
Masing-masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal sepanjang
12 pb yang komplementer satu sama lain sehingga
memungkinkan DNA untuk berubah konformasinya menjadi
sirkuler.
Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnya kedua untai tunggal
sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos.

Transfer Gen pada Bakteri

Transformasi
Proses perpindahan genetik dimana sel resipien
membutuhkan molekul DNA bebas (DNA yg
berada di luar sel dan sudah dimurnikan).
Transformasi dapat terjadi secara alami atau di
laboratorium.
Pada prinsipnya transfer sel bakteri akan terjadi
apabila sel resipien mampu menerima DNA
asing dari sel donor. Keadaan ini disebut
kompeten

TRANSFER GEN KE TANAMAN