Anda di halaman 1dari 13

PERCOBAAN VIII

BRINE SHRIMPS LETHALITY TEST

I.

Tujuan Percobaan
1. Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan menggunakan metode BSLT
2. Mengetahui cara perhitungan LD50 dengan metode BSLT
3. Mampu melaksanakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan menggunakan
metode BSLT
4. Mampu menetapkan LC50 sebagai parameter ketoksisan akut berdasarkan analisa
probit.

II.

Tinjauan Pustaka
Senyawa yang diduga memiliki aktifitas anti kanker, harus di ujikan terlebih
dahulu pada hewan percobaan. Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan
menggunakan larva udang Artemia salina Leach sebagai hewan uji merupakan salah
satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa antikanker baru yang
berasal dari tanaman. Hasil uji toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki
korelasi dengan daya sitotoksis senyawa anti kanker. Selain itu,metode ini juga
mudah dikerjakan, murah, cepat dan cukup akurat (Meyer, 1982).
Lebih dari itu uji larva udang ini juga digunakan untuk praskrining terhadap
senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor. Dengan kata lain, uji ini
mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai antikanker (Anderson,
1991). Artemia salina Leach merupakan komponen dari invertebrata dari fauna pada
ekosistem perairan laut. Udang renik ini mempunyai peranan yang penting dalam
aliran energi dan rantai makanan. Spesies invertebrata ini umumnya digunakan
sebagai organisme sentinel sejati berdasarkan pada penyebaran, fasilitas sampling,
dan luasnya karakteristik ekologi dan sensifitasnya terhadap bahankimia (Calleja
M.C, Persoone G, 1992).
Pengujian Lethalitas telah digunakan dengan sukses untuk isolasi biomonitor dari
cytotoxic (Siqueira, M. J et. al., 1998), antimalaria (Perez, H, et.al., 1997), insektisida
(Oberlies, N.H.,et.al., 1998), dan antifeedent (Labbe, C., et.al., 1993) campuran dari
ektrak tumbuhan. Hasil dari skrining dari air, hydroalcoholic dan ekstrak alkohol dari
beberapa tumbuhan obat penting yang digunakan dalam pengobatan tradisional untuk

lethalitas merujuk pada larva Artemia salina yang diperkenalkan.Suatu konsentrasi


mematikan (Lethal Concentration) adalah analisa secara statistik yangmenggunakan
uji Whole Effluent Toxicity (WET) untuk menaksir lethalitas sampel effluen.
Testakut digunakan di Wisconsin untuk menaksir kondisi "akhir dari pipa" (yaitu,
effluent

yang

tidak dilemahkan,

sebagai

adanya

dibebaskan

pada

lingkungan). Konsentrasi effluen dimana 50% dari organisme mati selama test
(LC50) digunakan sebagai pemenuhan titik akhir (endpoint) untuk Test Whole
Effluent Toxicity (WET) akut. Dalam rangka mengkalkulasi LC50, salah satu dari
konsentrasi test harus menyebabkan > 50% kematian. LC50 yang lebih rendah berarti
semakin beracun effluent tersebut. Sebagai contoh, LC50 > 100% berarti kekuatan
penuh effluent tersebut tidak membunuh lebih dari separuh organisme. LC50 sama
dengan 50% berarti separuh effluent mempunyai kekuatan membunuh 50% dari
organismetersebut.
Uji toksisitas dimaksudkan untuk memaparkan adanya efek toksik dan atau
menilai bataskeamanan dalam kaitannya dengan penggunaan suatu senyawa.
Pengukuran toksisitas dapatditentukan secara kuantitatif yang menyatakan tingkat
keamanan dan tingkat berbahaya zattersebut (Cassaret dan Doulls, 1975).
Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT) merupakan salah satumetode skrining untuk menentukan ketoksikan suatu
ekstrak ataupun senyawa. Kematian Artemia salina Leach digunakan sebagai
parameter untuk menunjukkan adanya kandungan zat aktif tanaman yang bersifat
sitotoksik. Apabila harga LC50 _ 1000 g/mL ekstrak tersebut dapat dikatakan toksik.
Bila kematian sebagai responnya, maka dosis penimbul kematian pada
50% populasi dengan spesies yang sama dalam waktu spesifik dan kondisi percobaan
sesuai diistilahkan sebagai median lethal dose atau LD50. Obat yang diberikan
sebagai konsentrasi diistilahkan sebagai Median Lethal Concetration atau LC50
(Cassaret dan Doulls, 1975). Menurut Meyer dkk. (1982) tingkat toksisitas dari
ekstrak tanaman dapat ditentukan denganmelihat harga LC50-nya. Apabila harga
LC50 lebih kecil dari 1000 g/ml dikatakan toksik,sebaliknya apabila harga LC50
lebih besar dari 1000 g/ml dikatakan tidak toksik. Tingkat toksisitas tersebut akan

memberi makna terhadap potensi aktivitasnya sebagai antitumor. Semakin kecil harga
LC50 semakin toksik suatu senyawa.
KLASIFIKASI Artemia salina, Leach.
Klasifikasi Artemia salina Leach adalah udang tingkat rendah yang hidup sebagai
zooplankton. Artemia pada tahun 1778 diberi nama cancer salinus, yang kemudian
diubah menjadi Artemia salina pada tahun1819 oleh Leach Klasifikasi Artemia pada
dunia hewan adalah sebagai berikut:
Divisi : Animal
Phylum : Arthropoda
Kelas : Crustaceae
Subkelas : Branchiopoda
Ordo : Anostraca
Familia : Arthemidae
Genus : Artemia
Species : Artemia salina Leach( Mudjiman, 1995)
b. Morfologi Artemia salina, LeachArtemia salina, Leach diperdagangkan dalam
bentuk telur istirahat yang dinamakan kista. Kista ini bentuk bulatan-bulatan kecil
berwarna kelabu kecoklatan dengan diameter berkisar 200-300 m(Mudjiman,1995).
Kista berkualitas baik, apabila diinkubasi dalam air berkadar garam 5-70 permilakan
menetas sekitar 18-24 jam. Artemia yang baru menetas disebut nauplius, berwarna
orange, berbentuk bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 mikron, lebar 170 mikron
dan berat 0,002 mg. Nauplius berangsur angsur mengalami perkembangan dan
perubahan morfologis dengan 15 kali pergantian kulit hingga menjadi dewasa. Pada
setiap pergantian kulit dis ebut instar (Mujiman, 1995).Ada beberapa tahap penetasan
Artemia yaitu tahap hidrasi, tahap pecah cangkang, dan tahap payungatau tahap
pengeluaran. Tahap hidrasi terjadi penyerapan air sehingga kista yang diawetkan
dalam bentuk kering tersebut akan menjadi bulat dan aktif bermetabolisme. Tahap
selanjutnya adalah tahap pecah cangkang dan disusul dengan tahap payung yang terjadi
beberapa saat sebelum nauplius keluar dari cangkang (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995).

Tahap penetasan telur Artemia


Artemia dewasa biasanya berukuran panjang 1-2 cm yang ditandai adanya tangkai
mata yang jelas terlihat pada kedua sisi bagian kepala, antena sebagai alat sensori, saluran
pencernaan yang terlihat jelas, dan 11 pasang thorakopoda. Pada Artemia jantan, antena
berubah menjadi alat penjepit,sepasang penis terdapat dibagian belakang tubuh,
sedangkan pada Artemia betina antena mengalami penyusutan. Sepasang indung telur
atau ovarium terdapat di kedua sisi saluran pencernaan, dibelakangthorakopoda
(Mujiman,1995).
Morfologi nauplius Artemia salina(Mujiman, 1995)c. Lingkungan hidup Artemia
salina hidup planktonik di perairan berkadar garam tinggi antara 15-30 permil, suhu yang
dikehendaki berkisar antara 25C-30C, oksigen terlarut sekitar 3 mg/L dan pH antara
7,3-8,4.Artemia salina, Leach tidak dapat mempertahankan diri dari pemangsa musuhmusuhnya karena tidak mempunyai alat atau cara untuk membela diri, salah satu cara
untuk menghindarkan diri dari pemangsa hewan lain dengan berpindah kekondisi alam
berupa lingkungan hidup berkadar garamtinggi. Pada umumnya pemangsa tidak dapat
hidup lagi pada kondisi itu (Mudjiman,1995). Makanan Artemia salina terdiri atas
ganggang renik, bakteri dan cendawan. Dalam pemeliharaan makanan yang diberikan
adalah katul padi, tepung terigu, tepung kedelai, dan ragi (Mudjiman,1995).
d. Perkembangbiakan dan siklus hidup
Perkembangbiakannya yaitu jenis biseksual dan jenis partenogenenetik Keduanya
dapat terjadi ovovivipar atau ovipar. Pada ovovivipar keluar dari induknya sudah berupa
anak yang dinamakan nauplius, sedangkan pada ovipar anak keluar dari induknya berupa
telur, bercangkang tebal yangdinamakan siste. Perkembangbiakan jenis biseksual harus
melalui proses perkawinan antara induk jantan dengan induk betina. Pada jenis
parthenogenesis tidak ada perkawinan karena memang tidak pernah ada jantannya. Jadi,
betina akan beranak dengan sendirinya tanpa perkawinan(Mudjiman,1995).
e. Penetasan telur Artemia salina LeachTelur yang siap menetas berwarna coklat keabuabuan. Untuk media penetasan dapat digunakan air laut biasa (kadar garam 30 permil).
Tapi untuk mencapai hasil penetasan yang lebih baik, kita perlu menggunakan air

berkadar garam 5 permil. Ini dapat dibuat dengan mengencerkan air laut dengan
air tawar. Sebelum ditetaskan telur-telur tersebut perlu dicuci terlebih dahulu, yakni
dengan direndam didalam air tawar selama 1 jam, baru kemudian dimasukkan dalam
wadah penetasan. Suhu air yang baik selama proses penetasan adalah antara 25-30 C.
Sedangkan kadar oksigennya harus lebih dari 2 mg/L. Untuk merangsang proses
penetasannya media penetasan tersebut perlu disinari dengan lampu yang dipasang di
samping wadah. Dalam waktu 24-36 jam setelah pemasukan telur, biasanya telur-telur itu
sudah menetas menjadi anak Artemia yang dinamakan nauplius (Mudjiman,1995).
f. Penggunaan Artemia salina Leach dalam penelitian Suatu metode uji hayati yang tepat
dan murah untuk skrining dalam menentukan toksisitas suatu ekstrak tanaman aktif
dengan menggunakan hewan uji Artemia salina Leach. Artemia sebelumnya telah
digunakan dalam bermacam macam uji hayati seperti uji pestisida, polutan,
mikotoksin,anestetik, komponen seperti morfin, kekarsinogenikan dan toksikan dalam air
laut. Uji dengan organisme ini sesuai untuk aktifitas farmakologi dalam ekstrak tanaman
yang bersifat toksik. Penelitian menggunakan Artemia salina memiliki beberapa
keuntungan antara lain cepat, mudah, murah dan sederhana. Penelitian dengan larva
Artemia salina Leach telah digunakan oleh Pusat Kanker Purdue, Universitas Purdue di
Lafayette untuk senyawa aktif tanaman secara umum dan tidak spesifik untuk zat anti
kanker. Namun demikian hubungan yang signifikan dari sampel yang bersifattoksik
terhadap larva Artemia salina Leach ternyata juga mempunyai aktifitas sitotoksik.
Berdasarkan hal tersebut maka larva Artemia salina Leach dapat digunakan untuk uji
toksisitas (Meyer et al., citWahyuni,S.,2002).

III.

Alat dan Bahan


a. Alat yang digunakan
Vial 3 buah
Spuit
Media pembiakan Artemia salina Leach
b. Bahan yang digunakan
Artemia salina Leach
Larutan sampel dengan 3 variasi konsentrasi

IV.

Prosedur Kerja
1. Persiapan larva udang
- Kista udang Artemia salina Leach dimasukkan dalam wadah penetasan yang
-

berisi air laut dan telah dilengkapi dengan aerasi dan lampu.
Biarkan 48 jam hingga menjadi larva.

2. Persiapan larutan sampel


- Sampel 40 mg dilarutkan dalam 4 ml methanol (Larutan induk 10.000 g/ml).
- Pipet 0,5 ml larutan induk dan masukkan ke dalam vial kosong
- Lakukan pengenceran dengan mengambil 0,5 ml larutan induk dan tambahkan
-

methanol hingga 5 ml (Larutan dengan konsentrasi 1000 g/ml)


Pipet 0,5 ml larutan di atas dan masukkan ke dalam vial kosong
Pipet 0,5 ml larutan di atas dan lakukan pengenceran dengan menambahkan

methanol hingga 5 ml (Larutan dengan konsentrasi 100 g/ml)


Pipet larutan di atas sebanyak 0,5 ml dan masukkan ke dalam vial
Masing-masing larutan di dalam vial biarkan pelarutnya menguap
Tambahkan 50 l dimetilsulfoksida (DMSO)
Tambahkan air laut hingga mencapai batas kalibrasi (5 ml)

3. Pengujian BSLT
- Masukkan 10 ekor larva ke masing-masing vial uji
- Lakukan pengamatan terhadap larva yang mati selama 24 jam
- Hitung nilai LC50

V.

Ke
l
1
2

Hasil
a. Data Pengamatan
Konsentras

Konsentrasi

i Larutan

larutan

Induk

sampel

10.000
g/ml
10.000
g/ml

Jumla
h larva

1000 g/ml

10

1000 g/ml

10

1000 g/ml

100 g/ml

10

1000 g/ml

100 g/ml

10

100 g/ml

10 g/ml

10

100 g/ml

10 g/ml

10

Konsentrasi
1000 g/ml
100 g/ml
10 g/ml

Log Konsentrasi
3
2
1

Jumlah
larva
mati
10
9
8
9
9
8
6
4
5
4
3
4
0
1
1
1
2
1

%
Kematian
100 %
90 %
80 %
90%
90 %
80 %
60 %
40 %
50 %
40 %
30 %
40 %
0%
10 %
10 %
10 %
20 %
10 %

Nilai Probit
6,282
5,000
3,445

Rata-rata %
pengulanga
n

Nilai
probit

90 %

6,282

86,67 %

6,080

50 %

5,000

36,67 %

4,642

6,67 %

3,445

13,33 %

3,874

Log Probit
0,79
0,69
0,537

b.

Perhitungan LC50
x = Log Konsentrasi
y = Nilai Probit

Persamaan regresi:

y = 1,418x + 2,072
5 = 1,418x + 2,072
1,418 x = 5 2,072
x=

2,928
1,418

x = 2,064

LC50

LC50 = an log 2,064


LC50 = 125,87 g/ml

c. Kurva

N
i
l
a
i
P
r
o
b
i
t

f(x) = 1.42x + 2.07


R = 1

0
0.5

1.5

Log

2.5

3.5

VI.

Pembahasan
Bioassay adalah suatu test atau uji yang menggunakan organisme hidup untuk
mengetahui efektifitas suatu bahan hidup ataupun bahan organik dan anorganik
terhadap suatu organisme hidup. Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis
tinggi, oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa terhadap organisme hewan
dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas dan
juga memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian. Salah satu
organisme yang sesuai untuk hewan uji adalah brine shrimp (udang laut).
Brine Shrimp Lethality Test (BST) merupakan metode yang menggunakan udang
laut Artemia salina Leach yang mana diajukan sebagai suatu bioassay sederhana
untuk penelitian produk alamiah. Metode ini menggunakan hewan uji Artemia salina
Leach yang merupakan udang-udangan primitif, sederhana dan efektif dalam ilmu
biologi dan toksikologi. Prosedur penentuan LC50 dalam g/ml dari ekstrak dilakukan
dalam medium air asin. Besarnya aktivitas dari ekstrak ditunjukkan sebagai toksisitas
terhadap larva udang.
Uji toksisitas dengan metode BSLT ini merupakan uji toksisitas akut dimana efek
toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu
selama 24 jam setelah pemberian dosis uji. Prosedurnya dengan menentukan nilai
LC50 dari aktivitas komponen aktif tanaman terhadap larva Artemia salina Leach.
Suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC < 1000 g/
ml.
LC50 adalah konsentrasi dari suatu senyawa kimia di udara atau dalam air yang
dapat menyebabkan 50% kematian pada suatu populasi hewan uji atau makhluk hidup
tertentu. Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan
perlakuan terhadap hewan uji secara berkelompok yaitu pada saat hewan uji

dipaparkan suatu bahan kimia melalui udara maka hewan uji tersebut akan
menghirupnya atau percobaan toksisitas dengan media air. Nilai LC 50 dapat
digunakan untuk menentukan tingkat efek toksik suatu senyawa sehingga dapat juga
untuk memprediksi potensinya sebagai antikanker.
Pada praktikum kali ini dilakukan pengujian efek sitotoksik ekstrak kulit buah
salah terhadap larva udang Artemia Salina Leach. Alasan digunakannya larva udang
Artemia Salina Leach karena telur atau kista Artemia akan menetas menjadi embrio
setelah 15-20 jam, kemudian dalam waktu beberapa jam embrio ini akan berubah
menjadi naupli yang berwarna kecoklatan. Hal ini dapat dianalogikan dengan sel
kanker yang membelah secara cepat dan tak terkendali. Di samping itu larva udang
juga merupakan general biossay sehingga semua zat dapat menembus masuk
menembus dinding sel larva tersebut.
Pengujian dilakukan dengan metode Brine Shrimps Lethality Test, di mana larva
udang yang telah dibiakkan dimasukkan ke dalam larutan sampel dan diamati larva
yang mati selama 24 jam. Alasan digunakannya metode ini karena metode ini hanya
memakai rentang waktu singkat untuk pengamatan yaitu 24 jam. Selain itu metode ini
juga tidak mahal, mudah dalam pengerjaannya dibanding pengujian lainnya karena
tidak membutuhkan peralatan dan latihan khusus, serta sampel yang digunakan relatif
sedikit.
Sampel yang digunakan pada percobaan kali ini ialah larutan ekstrak kulit buah
salak. Di mana ekstrak kulit buah salak diduga memiliki efek sitotoksik yang dapat
mengendalikan pertumbuhan sel kanker yang tumbuh secara cepat dan tak terkendali.
Larutan dibuat dalam 3 konsentrasi yang berbeda yaitu 1000 g/ml, 100 g/ml, dan
10 g/ml.
Pada praktikum kali ini kami tidak melakukan praktek BSLT secara langsung
dikarenakan larva udang yang akan digunakan sebagai hewan uji gagal dibiakkan.
Hal ini sangat disayangkan sekali. Namun untuk hasil praktikum diberikan contoh
data pengamatan agar mahasiswa dapat mempelajari cara menentukan LC 50 dari suatu
ekstrak.
Dalam percobaan ini digunakan air laut karena merupakan media hidup bagi larva udang
atau dengan kata lain larva udang hanya dapat hidup dalam air laut. Pada percobaan ini
dilakukan juga pengulangan sebanyak 3 kali dengan maksud untuk mendapatkan hasil yang
lebih akurat.

Dari hasil pengamatan dan setelah dilakukan perhitungan terhadap data, didapatkan hasil
LC50 yaitu 125,87 g/ml. Hal ini berarti bahwa pada konsentrasi 125,87 g/ml, ekstrak

kuliat buah salak sudah dapat menyebabkan kematian 50 % dari hewan uji yaitu larva
udang.
VII.

Kesimpulan
Dari percobaan kali ini, dapat disimpulkan bahwa:
- Brine Shrimp Lethality Test (BST) merupakan metode yang menggunakan udang
laut Artemia salina Leach yang mana diajukan sebagai suatu bioassay sederhana
-

untuk penelitian produk alamiah.


Alasan digunakannya larva udang Artemia Salina Leach karena telur atau kista
Artemia ini dapat dianalogikan sebagai sel kanker yang membelah secara cepat
dan tak terkendali. Di samping itu larva udang juga merupakan general biossay

sehingga semua zat dapat menembus masuk menembus dinding sel larva tersebut.
Alasan digunakannya metode BSLT ini karena metode ini hanya menghabiskan
waktu 24 jam. Selain itu metode ini juga tidak mahal, mudah dalam
pengerjaannya dibanding pengujian lainnya karena tidak membutuhkan peralatan

dan latihan khusus, serta sampel yang digunakan relatif sedikit.


Pada pengujian BSLT dibuat larutan dengan konsentrsi yang berbeda-beda mulai
dari 1000, 100, dan 10 g/ml. Ini bertujuan untuk melihat pengaruh konsentrasi

dari ektrak terhadap aktivitasnya (LC50)


Nilai LC50 dapat digunakan untuk menentukan tingkat efek toksik suatu senyawa

sehingga dapat juga untuk memprediksi potensinya sebagai antikanker.


Pada hasil percobaan didapat LC50 sebesar 125,87 g/ml. Dapat diketahui bahwa
ektrak dari kulit buah salak memilki akvitas yang toksik (persyaratan toksik
1000 g/ml).

DAFTAR PUSTAKA

Soedibyo, Mooryati. 1998. Alam Sumber Kesehatan Manfaat dan Kegunaan. Jakarta.
BalaiPustaka2.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. 1978. Materia Medika Indonesia II.Jakarta.
Departemen Kesehatan3.
World

Health

Organization.

1998.

Quality

Control

Method

for

Medicinal

Plant

Materials.Geneva4.
Hariana H. Arief, Drs. 2008. Tumbuhan Obat dan Khasiatnya ed. III. Jakarta5.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta.6.
Petunjuk Praktikum Teknologi Bahan Alam. 20107.
Anonimous.

1994.

Hasil

Penelitian

Dalam

Rangka

Pemanfaatan

Pestisida

Nabati.

ProsidingSeminar di Bogor 1 2 Desember 1993. Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat.
Bogor.8.
Anonimous. 1989. Vademekum Bahan Obat Alam. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Jakarta.

Anda mungkin juga menyukai