Anda di halaman 1dari 15

LAPORAN GENETIKA MOLEKULER

Identifikasi Bakteri Berdasarkan Gen Penyandi 16s rRna

Oleh :
Hanni Tsaaqifah
BTK/ P051150071

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI


SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2015

PENDAHULUAN
1. Latar belakang
Secara tradisional identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan karakter
fenotipe. Metode tersebut memiliki kelemahan yaitu kerap terjadi kesalahan
dalam pembedaan spesies dan galur bakteri yang disebabkan hadirnya karakter
fenotipik bakteri yang tidak biasa. Terlebih karakter fenotipik bakteri tidak
bersifat statis dan dapat berubah seiring dengan perubahan kondisi organisme dan
lingkungan hingga menyebabkan evolusi (Ochman, 2005). Identifikasi bakteri
berdasarkan karakter fenotipik juga memiliki reproduksibilitas yang rendah
karena tergantung pada kondisi kultur di laboratorium yang berbeda (Nuroniyah,
2012).
Kemajuan teknologi telah melahirkan pendekatan secara molekuler, yang
memungkinkan untuk melakukan isolasi DNA atau RNA langsung dari sampel yang
diperoleh langsung dari lingkungan, sehingga dapat diperoleh gambaran menyeluruh
untuk suatu komunitas. Menurut Pangastuti (2006), pendekatan genomik lebih sering
dilakukan untuk penentuan spesies pada prokaryota termasuk bakteri. Pendekatan ini
memungkinkan untuk menganalisis spesies-spesies yang tidak dapat dikulturkan di
laboratorium.
Teknik identifikasi bakteri yang paling banyak digunakan sebagai penanda
molekuler adalah RNA ribosomal. Analisis gen penyandi 16S rRNA telah menjadi
prosedur baku untuk menentukan hubungan filogenetik dan menganalisis suatu
ekosistem (Pangastuti, 2006). Gen penyandi 16s rRNA hadir sebagai penanda
molekuler yang memiliki daerah dimana urutan basanya relatif konservatif dan
variatif. Daerah konservatif berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik
universal karena mengalami perubahan relatif lambat. Sebaliknya, urutan basa yang
bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galurgalur dalam satu spesies (Stackebrandt dan Goebel, 1995).
Analisis gen penyandi 16S rRNA praktis untuk definisi spesies, karena molekul
ini bersifat ubikuitus, sehingga dapat dirancang suatu primer yang universal untuk
seluruh kelompok. Penentuan spesies baru pun dapat dilakukan tanpa mengisolasi
mikroorganisme yang bersangkutan (Murray, 1995).

Mengingat pentingnya mengetahui identifikasi bakteri secara molekuler,


sehingga pada acara praktikum ini digunakan primer 63 F/1387 R dari gen

penyandi 16S rRNA yang bertujuan untuk mengetahui keragaman bakteri yang
digunakan sebagai sampel dalam praktikum ini.
2. Tujuan Praktikum
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan mempelajari teknik isolasi
DNA genom bakteri dan identifikasi bakteri secara molekuler menggunakan
primer forward/reverse dari gen pengkode 16S rRNA.

METODOLOGI
1. Waktu dan Tempat
Praktikum acara isolasi dna genom bakteri pada tanggal 22 September 2015,
sedangkan identifikasi bakteri dilakukan pada tanggal 10 Oktober 2015. Seluruh
kegiatan dilakukan di Laboratorium Biorin Pusat Antar Universitas IPB.
2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu collection tube (tabung
eppendorf), tabung PCR, mikropipet (ukuran 2P, 20P, 200P dan 1000P) dan tip,
erlenmeyer,

setrifuge, inkubator, pengering vakum, vortex, alat spin down,

Thermocycler, timbangan, hot plate, comb, cetakan agar, dan gel doc.
Bahan yang digunakan pada praktikum antara lain kultur Escherichia coli DH
5 , larutan CTAB, Chlorofom Isoamilalcohol (C:I, 24:1), Phenol Chlorofom
Isoamilalcohol (PCI), NaOAc (2M; pH 5,2), EtOH absolut dan 70%, ddH 2O,
Rnase, agarose, buffer TAE 1 x, dan pcr mix.
3. Cara Kerja
3. 1. Isolasi DNA, Pemurnian, dan Pengendapan DNA Genom
Sebanyak 1,5 ml kultur bakteri Escherichia coli DH 5 di masukkan ke
dalam tabung eppendorf. Kultur bakteri disentrifugasi pada kecepatan
10.000 rpm selama 2-5 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang,
sedangkan pelet yang berada pada tabung ditambahi sebanyak 600

larutan CTAB dan diresuspensi. Campuran pelet dan CTAB selanjutnya di


inkubasi pada suhu 65

selama 30 menit (tabung di bolak balik setiap

10 menit) kemudian didinginkan pada es selama 5 menit. Campuran


ditambahi dengan larutan kloroform isoamil alkohol (C:I; 24:1). Tabung
dibolak balik kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10

menit. Fase supernatan yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke tabung


eppendorf baru dengan menggunakan mikropipet untuk mengetahui volume
supernatan yang terambil.
Tahap selanjutnya, tabung ditambahkan larutan fenol kloroform isoamil
alkohol (P:C:I; 25:24:1) sebanyak 1 kali volume supernatan ke dalam
tabung. Tabung dibolak balik sampai homogen dan disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4

selama 10 menit. Supernatan yang

terbentuk dipindahkan ke tabung baru dan di tambahi NaOAc sebanyak 0,1


kali volume supernatan dan ditambah dengan EtOH 100% sebanyak 2 kali
volume. Tabung diinkubasi pada suhu -20 selama semalam.
Langkah berikutnya, tabung disentrifugasi selama 15 menit pada suhu 4
dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan dibuang, lalu pellet di cuci

dengan 500 l EtOH 70%. Tabung disentrifugasi kembali pada kecepatan


10.000 rpm selama 5 menit dengan suhu 4 . Supernatan dibuang dan
tabung dikeringkan dengan vakum selama 20 menit. Pellet yang berada pada
tabung ditambahi dengan 20

ddH2O dan Rnase sebanyak 3 l

dan

dihomogenkan dengan spin down. Tabung diinkubasi pada suhu 37


selama 10 menit.
3. 2. Deteksi DNA menggunakan Gel Agarosa
Ada tidaknya DNA genom diketahui dengan elektroforesis, yaitu
menjalankan DNA genom hasil isolasi pada gel agarose 1%. Sebanyak 5l
DNA genom ditambahi 1l loading dye sampai tercampur. Campuran
dimasukkan ke dalam sumur agarosa 1% (0,3 gram agarose dalam 30 ml
buffer TAE (Tris Acetic EDTA) 1X. DNA lambda digunakan sebagai marker.
Elektroforesis dilakukan selama 30 menit pada 100 Volt dengan buffer
TAE 1X sebagai running buffer. Gel direndam dalam larutan Ethidium
Bromida (EtBr). Gel dapat divisualisasi dengan meletakkan gel dalam gel
doc dengan bantuan sinar UV untuk melihat ada tidaknya pita DNA genom.
Agarose diambil dari alat elektroforesis kemudian direndam dalam larutan
Etidhium Bromida. Selanjutnya pergerakan DNA diamati di bawah sinar
UV.
3. 3. Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA
dengan menggunakan spektrofotometer. Suspensi DNA diencerkan dengan
mengambil 5 l dalam 695 l ddH2O. Suspensi DNA yang telah diencerkan

dibaca absorbansinya pada 260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada
panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1
OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. Konsentrasi DNA dihitung dengan
persamaan,
Konsentrasi DNA

=
g
FP x 50 g/ml x Abs. 260
Sedangkan untuk ml
mengetahui kualitas DNA berhubungan dengan
kemurnian

DNA terhadap

kontaminan

protein

dapat

dilihat

dari

perbandingan nilai absorbansi 260 nm terhadap nilai absorbansi 280 nm.


DNA dikatakan murni apabila nilai perbandingan berada pada rentang 1,82,0.
3. 4. Amplifikasi DNA Genom Bakteri
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. Teknik ini
merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA
target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang
berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim
dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler (Muladno,
2002). Setiap siklus dari teknik PCR terdiri dari 3 tahap yaitu tahap
denaturasi, pelekatan (annealing) dan pemanjangan (elongation) (Koolman
dan Roehm, 2004).
Pada reaksi amplifikasi digunakan Primer 63 Forward /1387 Reverse dari
16S rDNA (pada masing- masing sampel). Analisis PCR dilakukan dengan
total 1x reaksi sebanyak 10 l (Tabel 1). Campuran dihomogenkan kemudian
dimasukkan ke dalam mesin thermocycler.
Tabel 1. Komposisi PCR mix
Komposisi PCR
Template 100 ng/ l
Master mix
Primer (10 picomol/ l) 1387R
63 F
ddH2O
Total

1x
1 l
5 l
0.25 l
0.25 l
3.5 l
10 l

13x
13 l
65 l
3.25 l
3.25 l
45.5 l
130 l

Amplifikasi DNA genom bakteri dilakukan 35 siklus ( 2 jam) dengan


keterangan sebagai berikut :
Tabel 2. Proses amplifikasi DNA
No
.
1
2
3
4
5
6

Tahap

Suhu

Waktu

Siklus

Pre denaturasi
Denaturasi
Annealing
Extension
Post extension
Cooling

940C
940C
500C
720C
720C
250C

5 menit
1 menit
30 detik
1 menit
5 menit
10 menit

1
35
35
35
1
1

3. 5. Elektroforesis Gel Agarosa


Hasil

amplifikasi

divisualisasikan

menggunakan

elektroforesis

horizontal dengan gel agarose 1 % (w/v) dalam buffer 1x TAE. Sebanyak 10


l larutan DNA hasil amplifikasi dimasukkan ke dalam sumuran gel agrosa
kemudian dialiri arus listrik 100 volt selama 30 menit. Gel agarose
kemudian direndam dalam larutan EtBr, sehingga pola pita dapat dilihat di
bawah sinar ultraviolet. Etidium bromide nantinya akan berinteraksi dengan
basa dari molekul DNA dan memberikan warna orange flouresence dibawah
lampu UV.

HASIL DAN PEMBAHASAN


1. Isolasi DNA Genom Bakteri
Pada praktikum ini, dilakukan isolasi DNA genom terhadap Escherichia coli
DH 5 . Isolasi DNA genom bakteri dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu

pelisisan sel, presipitasi, pencucian, pemurnian, dan resuspensi. Secara tahapan


tersebut dilakukan dengan penambahan senyawa kimia.
Tahap pelisisan sel DNA genom bakteri dilakukan dengan menggunakan
metode buffer CTAB (Cetyltrimethyl Ammonium Bromide). Prinsip metode CTAB
adalah melisiskan membran sel bakteri yang memiliki komponen pospolipid
bilayer. CTAB merupakan senyawa detergen kation yang dapat merusak dan
melisiskan pospolipid. Apabila integritas barrier membran sel sudah rusak maka
semua isi sel dapat terekspos ke luar, sehingga DNA dapat dipisahkan dengan
komponen pengotor lainnya (gambar 1).

Gambar 1. Pelisisan sel bakteri dengan metode CTAB


DNA yang telah terpisahkan dari membran selanjutnya dilakukan 3 tahap
presipitasi dengan penambahan bahan-bahan kimia seperti fenol kloroform
isoamilalkohol, etanol, dan NaOAC. Metode presipitasi dengan kloroform
isoamilalkohol (C:I, 24:1) dilakukan untuk mendenaturasi protein dan melarutkan
komponen lipid. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CI) berdasarkan
perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan
kemampuannya

untuk

mendeproteinisasi

berdasarkan

kemampuan

rantai

polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase


antara kloroform-air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut
dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa
organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform. Fungsi lain dari penambahan
CI ini adalah untuk menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA
pada fase aquoeus. DNA kemudian diikat dari fase aquoeus dengan presipitasi
etanol (Surzycki, 2000).

Presipitasi tahap kedua dilakukan dengan menggunakan larutan fenolkloroform-isoamil

alkohol

(P:C:I,

25:24:1).

Campuran

pelarut

akan

mendenaturasi protein dan melarutkan komponen lipid. Penambahan PCI setelah


disentrifugasi membentuk 3 fase (gambar 2) yaitu fase aquoeus (lapisan paling
atas tempat DNA berada), fase protein (protein terkoagulasi di fase tengah), dan
fase kloroform (paling bawah karena sifat kloroform yang berat jenisnya besar).

Gambar 2. Presipitasi DNA genom dengan PCI


Tahap presipitasi selanjutnya adalah dengan penambahan NaOAc (2M pH
5,2). Larutan NaOAc berfungsi menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh
ion hidroksida pada tahap lisis sebelumnya. Ikatan-ikatan hidrogen antar basa utas
tunggal DNA terbentuk kembali. Muatan Na+ akan berinteraksi dengan DNA yang
bermuatan negatif. Interaksi tersebut menyebabkan DNA bersifat hidrofob.
Penambahan EtOH absolut juga dilakukan pada praktikum ini. EtOH absolut yang
memiliki sifat dielektrik lebih rendah dari air digunakan sebagai agen presipitasi
lanjutan yang akan memudahkan garam berinteraksi dengan DNA, sehingga DNA
akan mengendap (gambar 3).
Tahap pencucian pellet DNA dengan etanol 70%. Pencucian dilakukan untuk
menghilangkan kelebihan garam. Selanjutnya pellet dikeringkan dan setelah itu
dilakukan pemurnia DNA dari RNA dengan penambahkan RNAase sehingga akan
didapatkan DNA genom yang murni. Tahap resuspensi dilakukan dengan
menambahkan ddH2O yang berfungsi untuk menjaga stabilitas dan lama
penyimpanan DNA.

Gambar 3. Tahap presipitasi dengan EtOH absolut


2. Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer
DNA yang telah diisolasi, kemudian di cek kuantitasnya dengan metode
spektrofotometri untuk mengetahui kemurnian dan konsentrasinya. Prinsip
metode spektrofotometri adalah menghitung nilai absorbansi pada A260 dan A280.
Kemurnian DNA didapat dari perbandingan antara nilai absorbansi A260/ A280, dan
konsentrasi DNA didapatkan dengan mengalikan nilai absorbansi A260 dengan
faktor pengenceran serta mengonversikannya kedalam nanogram (ng) dengan
mengalikan nilai OD A260 yaitu 50 ng.
Tabel 3. Hasil kuantifikasi DNA genom bakteri dengan metode spektrofotometri
Kemurnian
Sample
260
280
(A260/A280)
Konsentrasi (ng/l)
1
0.398
0.253
1.573
2786
2A
0.058
0.050
1.16
406
2B
0.139
0.093
1.494
973
3
0.067
0.054
1.240
469
4
0.090
0.062
1.451
630
5
0.244
0.163
1.496
1708
6
0.046
0.044
1.045
322
7
0.099
0.076
1.302
693
8
0.135
0.092
1.467
945
9
0.062
0.050
1.240
434
10
0.287
0.176
1.630
2009

Berdasarkan data dari tabel 3, semua hasil perhitungan kemurnian DNA


menunjukkan nilai yang rendah karena berada dibawah 1,8. Menurut Fatchiyah
(2011), DNA dapat dikatakan murni apabila rasio absorbansi DNA yang diukur
pada (A260/A280) menunjukkan nilai 1,8- 2,0. Ketidakmurnian hasil isolasi
dikarenakan terdapat kontaminasi khususnya protein (nilai kemurnian DNA <
1,8). Adanya kontaminan protein hasil isolasi DNA praktikum ini dimungkinkan

karena saat pengambilan supernatan hasil purifikasi dengan PCI, protein yang
mengendap ikut terbawa. Hal lainnya dimungkinkan pada praktikum ini tidak
dilakukan penambahan enzim proteinase K (enzim pendenaturasi protein).
Konsentrasi DNA genom paling tinggi terdapat pada isolat sampel 1 (2786
ng/l) sedangkan konsentrasi terendah terdapat pada sampel 6 (322 ng/l).
Konsentrasi DNA pada hasil isolasi kali ini nilainya cukup besar sehingga
pengenceran harus dilakukan sebelum amplifikasi dengan mesin PCR. Pada
praktikum ini digunakan pengenceran sebanyak 100 ng/ l. Konsentrasi DNA
perlu diketahui untuk mendapatkan konsentrasi yang tepat untuk amplifikasi PCR.
3. Analisis Hasil Isolasi DNA Genom dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Analisis ini bertujuan mengetahui kualitas dan mengecek ada tidaknya DNA
dalam gel agarosa. Gambar 4 menunjukkan hasil visualisasi sampel DNA. DNA
penanda yang digunakan berupa lambda. Elektroforesis dilakukan sampai larutan
pewarna menjauhi sumuran.
Dari gambar 4 diketahui bahwa tidak terlihat adanya pita yang menandakan
keberadaan genom. Tidak adanya band DNA yang terdeteksi dimungkinkan
karena banyak faktor, antara lain ketidakmurnian hasil isolasi DNA genom yang
masih mengandung kontaminan atau pengotor lain (mengacu pada tabel 2
rendahnya kemurnian dari hasil isolasi DNA genom); konsentrasi DNA yang
dimasukkan ke dalam sumuran terlalu sedikit sehingga pita band DNA tidak
terdeteksi. Adanya pengotor berupa protein (kemurnian < 1,8 ) pada praktikum ini
dapat disebabkan karena saat pengambilan supernatan hasil purifikasi dengan
PCI, protein yang mengendap ikut terbawa. Hal lainnya dimungkinkan pada
praktikum ini tidak dilakukan penambahan enzim proteinase K (enzim
pendenaturasi protein).

Gambar 4. Elektroforegram hasil isolasi DNA genom bakteri; Marker


Lambda 3
Adanya pita marker lambda yang terlihat jelas menandakan proses
elektroforesis berjalan dengan benar. Sehingga faktor ini bukan pemicu
ketidakmunculannya pita DNA hasil isolasi.
4. Identifikasi Bakteri dengan Gen Penyandi 16S rRNA
Identifikasi bakteri menggunakan aplikasi PCR dapat menggunakan primer
spesifik prokariot yaitu sekuens penyandi sub unit kecil ribosom 16S. PCR
dilakukan dengan mengamplifikasi sekuens 16S rRNA. Pada sekuens ini terdapat
daerah berkonservasi tinggi yang identik pada setiap bakteri.

Gambar 5. Gen penyandi RNA.


Pada prokaryota terdapat tiga jenis RNA ribosomal (gambar 5), yaitu 5S, 16S,
dan 23S rRNA (May-Ping et al., 2009). Di antara ketiganya, 16S rRNA yang
paling sering digunakan sebagai penanda molekuler. Molekul 5S rRNA memiliki
urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak ideal dari segi analisis statistika,
sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup
panjang sehingga menyulitkan analisis (Amann et al., 1994).
Penggunaan urutan gen 16S rRNA untuk mempelajari filogeni dan taksonomi
mikroorganisme telah lama dilakukan dan merupakan penanda genetik yang

paling umum digunakan. Hal ini dikarenakan kehadiran gen 16S rRNA terdapat
hampir semua mikroorganisme,

sering ada sebagai keluarga multigene, atau

operon. Fungsi dari gen 16S rRNA tidak mengalami perubahan dari waktu ke
waktu. Gen ini relatif konstan dan tidak berubah atau dengan kata lain laju
mutasinya sangat kecil sehingga relevan bila digunakan sebagai objek penelitian.
Gen 16S rRNA berukuran cukup besar untuk diteliti yakni 1.500 bp (Janda dan
Abbott, 2007).
5. PCR menggunakan primer 16S rRNA
Isolat DNA diamplifikasi pada mesin PCR menggunakan primer 63F dan
1387R. Primer 63F memiliki urutan basa 5-CAG GCC TAA CAC ATG CAA
GTC-3 dan primer 1387R memiliki urutan basa 5-GGG CGG WGT GTA CAA
GGC-3. Primer 63Fdan 1387R merupakan primer universal yang digunakan
untuk amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR yang dirancang oleh Marchesi
(1998). Pada praktikum ini menggunakan konsentrasi DNA sebesar 100 ng/ l.
Hasil elektroforegram menunjukkan adanya pita tunggal yang berarti bahwa
pasangan primer yang digunakan bersifat spesifik menempel pada daerah yang
diharapkan. Pita tunggal tersebut mengandung kumpulan gen 16S rRNA dari
bakteri Escherichia coli DH 5 . Tebal dan tipisnya pita menunjukkan kuantitas
dari DNA template yang teramplifikasi. Elektroferogram amplikon DNA genom
bakteri pada praktikum ini terlihat jelas dan tebal mengindikasikan bahwa
konsentrasi molekul yang terseparasi pada wilayah ini tinggi. Namun secara
umum migrasi pita masih ada smear yang menujukkan bahwa kualitas DNA
masih belum murni. Pada sumuran nomor 10 didapat pita yang tipis. Pita DNA
yang tipis pada gambar 6 diatas bisa terjadi karena konsentrasi DNA yang
teramplifikasi nilainya rendah.

Gambar 6. Elektroforegram amplikon DNA bakteri penyandi gen 16S rRNA;


Marker 1 kb DNA ladder.
Dengan mengukur jarak migrasi pita-pita sumur marker maka diperoleh
persamaan yang akan digunakan untuk menentukan ukuran basa dari DNA genom
yang telah diamplifikasi. Hasil perhitungan secara manual menggunakan alat ukur
penggaris, maka diperoleh data sebagai berikut:
Tabel 4. Jarak migrasi marker 1 kb ladder
bp
100
00
800
0
600
0
500
0
400
0
350
0
300
0
250
0
200
0
150
0
100
0
750
500
250

Log bp

4
3,9030
9
3,7781
51
3,6989
7
3,6020
6
3,5440
68
3,4771
21
3,3979
4
3,3010
3
3,1760
91
3
2,8750
61
2,6989
7
2,3979
4

Jarak
(cm)
2,5
2,7

5
4
f(x) = - 0.24x + 4.49
R = 0.99

Linear ()

3,25

Linear ()

10

3,55
3,8
4,05
4,4
4,85
5
6,4
6,9
7,7
8,7

Gambar 7. Grafik perbandinganjarak migrasi marker 1 kb


ladder dengan log bp ukuran DNA bakteri dari marker 1 kb

Migrasi DNA bakteri dari semua sampel ketika diukur dengan penggaris,
jaraknya adalah 5,7 cm dari sumuran. Dari persamaan linier y = -0,239x + 4,488,
diperoleh ukuran DNA genom bakteri sebesar 1300 pasang basa.
KESIMPULAN
Pada praktikum ini isolasi DNA genom bakteri Escherichia coli DH 5
dilakukan

dengan

metode

CTAB.

Hasil

kuantifikasi

DNA

dengan

spektrofotometer pada semua sampel menunjukkan nilai kemurnian yang rendah


(kurang dari 1,8). Untuk konsentrasi DNA hasil isolasi, secara umum relatif cukup
tinggi, sehingga dilakukan pengenceran pada 100 ng/ l.
Hasil isolasi DNA genom pada semua sampel tidak menunjukkan adanya pita
DNA. Sedangkan identifikasi molekular bakteri yang dilakukan dengan
amplifikasi pada daerah 16S rRNA, pada semua sampel muncul adanya pita
DNA. Ukuran pita DNA yang dihasilkan sekitar 1300 pasang basa.

DAFTAR PUSTAKA
Janda, J. M. dan Abbott, S. L. 2007. 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial
Identification in the Diagnostic Laboratory: Pluses, Perils, and Pitfalls. Journal
Clin. Microbiol., 45(9): 2761-4.
Koolman, J., dan Roehm, K.H. 2004. Color Atlas of Biochemistry edisi kedua.
NewYork:: Thieme Stuttgart.
Lehninger, A. L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Alih Bahasa M. Thenawijaya. Jakarta: Erlangga.
Marchesi, J.R., T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom dan W.G.
Wade. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR
primersthat amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl. Environm.
Microbiol. 64: 795-799.
May Ping, Lee, C. Bussema III, dan T. M. Schmidt. 2009. rrnDB: Documenting The
Number of rRNA and tRNA Genes In Bacteria and Archaea. Nucleic Acids Res.,
37: D489D493.
Mulyani, Y. 2011. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini Koi.
Herpes Virus pada Ikan Mas. Jurnal AkuatikaI, 8 (11): 1-16.
Nuroniyah, T. dan Surya Rosa Putra. 2012. Identifikasi Spesies Isolat Bakteri S1 dengan
Metode Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA. Jurnal Teknik Pomits, 1(1): 16.

Ochman, H. 2005. Genome on The Shrink. Proc. Natl. Acad. Science. USA, 102: 1195911960.
Pangastuti, A. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Gen
Penyandi 16s rRNA dan Gen Penyandi Protein. Biodiversitas, 7(3): 292-296.
Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin,
Heidelberg, New York.