Anda di halaman 1dari 16

LAPORAN GENETIKA MOLEKULER

IDENTIFIKASI TANAMAN MENGGUNAKAN MATK

Oleh :
Hanni Tsaaqifah
BTK/ P051150071

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI


SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2015

PENDAHULUAN
1. Latar belakang
Metode identifikasi spesies makhluk hidup telah berkembang dari identifikasi
morfologi sampai pada identifikasi molekuler berdasarkan potongan DNA pendek
yang disebut barcode DNA (Hebert et al. 2003). Barcode DNA memiliki
fungsi-fungsi aplikatif misalnya untuk survei ekologi (Dick dan Kress 2009),
identifikasi takson-takson kriptik (Lahaye et al. 2008), dan konfirmasi sampelsampel tanaman obat (Xue dan Li 2011).
Keragaman tingkat genetik merupakan tingkat keragaman yang paling rendah
dalam organisasi biologi. Keragaman genetik sangat penting bagi tanaman untuk
beradaptasi terhadap perubahan lingkungan yang terjadi disekitarnya. Informasi
keragaman genetik tanaman pada tingkat, individu, spesies maupun populasi perlu
diketahui, sebagai dasar pertimbangan dalam menyusun strategi konservasi,
pemuliaan, pengelolaan dan pemanfaatan sumberdaya genetik tanaman secara
berkelanjutan. Penilaian keragaman genetik tanaman dapat dilakukan dengan
menggunakan penanda morfologi, biokimia dan molekuler DNA (Zulfahmi,
2013).
Penilaian keragaman genetik tanaman secara morfologi dilakukan melalui uji
progeni, uji provenan dan pengujian lainnya dengan mengamati penampilan
fenotipik tanaman. Pengujian ini dilakukan pada lingkungan yang berbeda dengan
fokus utama adalah ciri kualitatif dan kuantitatif yang bernilai ekonomi serta ciri
yang secara biologi penting seperti kemampuan hidup (survive), sifat toleran
terhadap stres lingkungan, sifat produksi dan resistensi terhadap hama dan
penyakit. Sebagian diantara ciriciri tersebut bersifat poligenik dan ekspresinya
dipengaruhi oleh lingkungan. Studi secara tradisional dengan metode genetika
kuantitatif, penilaian keragaman dan distribusi keragaman dikelompokkan ke
dalam beberapa kelas pengaruh, seperti pengaruh fenotifik, genotipe, lingkungan
dan interaksi antara lingkungan dan genotipe. Penentuan keragaman genetik
tanaman secara konvensional ini membutuhkan waktu yang lama, relatif mahal,
dipengaruhi oleh lingkungan dan keragaman yang diperoleh terbatas dan tidak
konsisten.

Kemajuan teknologi telah melahirkan pendekatan secara molekuler, yang


memungkinkan untuk melakukan isolasi DNA atau RNA langsung dari sampel
yang diperoleh langsung dari lingkungan, sehingga dapat diperoleh gambaran
menyeluruh untuk suatu komunitas. The Consortium for the Barcode of Life
(CBOL Plant Working Group, 2009) merekomendasikan penggunaan dua gen
plastida yaitu ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase (rbcL) dan gen maturase K
(matK) sebagai barcode standar untuk DNA tumbuhan (Hollingsworth et al.
2009).
Mengingat pentingnya mengetahui identifikasi tanaman nanas secara
molekuler, sehingga pada acara praktikum ini digunakan primer matK3F dan
matK3R yang bertujuan untuk mengetahui keragaman tanaman nanas yang
digunakan sebagai sampel dalam praktikum ini.
2. Tujuan Praktikum
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan mempelajari teknik isolasi
DNA genom dan identifikasi tanaman nanas secara molekuler menggunakan
matK.

METODOLOGI
1. Waktu dan Tempat
Praktikum acara isolasi dna genom tanaman nanas dilakukan pada tanggal 29
September 2015, sedangkan identifikasi tanaman nanas dilakukan pada tanggal 10
Oktober 2015. Seluruh kegiatan dilakukan di Laboratorium Biorin Pusat Antar
Universitas IPB.
2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu collection tube (tabung
eppendorf), tabung PCR, mikropipet (ukuran 2P, 20P, 200P dan 1000P) dan tip,
mortar dan pestle, erlenmeyer, setrifuge, inkubator, pengering vakum, vortex, alat
spin down, Thermocycler, timbangan, hot plate, comb, cetakan agar, dan gel doc.
Bahan yang digunakan pada praktikum antara lain sampel tanaman nanas,
nitrogen cair, larutan CTAB,

-mercapto etanol, Chlorofom Isoamilalcohol

(C:I, 24:1), Phenol Chlorofom Isoamilalcohol (PCI), NaOAc (2M; pH 5,2), EtOH
absolut dan 70%, ddH2O, Rnase, agarose, buffer TAE 1 x, dan pcr mix.
3. Cara Kerja
3. 1. Isolasi DNA, Pemurnian, dan Pengendapan DNA Genom
Daun tanaman nanas (Ananas sp.) sebanyak 2,2 cm dipotong kecil
untuk digerus sampai halus menggunakan pestle dan mortar dengan
ditambah larutan nitrogen cair. Serbuk daun nanas dimasukkan ke tabung
eppendorf yang telah diisi 600
dan 1,2

larutan buffer CTAB (2 x 2% PVP)

-mercapto etanol. Tabung di bolak balik agar homogen

dan diinkubasi pada suhu 65

selama 30 menit. Pada saat inkubasi,

tabung dibolak balik setiap 10 menit sekali. Sampel pada tabung ditambahi
dengan 600

larutan kloroform isoamil alkohol (C:I; 24:1), kemudian

disentrifugasi kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang. Fase
supernatan yang terbentuk diambil, dipindahkan ke tabung baru dan
ditambahi larutan fenol kloroform isoamil alkohol (P:C:I; 25:24:1) sebanyak
1 kali volume supernatan. Tabung disentrifugasi pada 10.000 rpm selama
10 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke

tabung baru dan ditambahi NaOAc (2M; pH 5,2) sebanyak 1 kali volume
dan EtOH absolut sebanyak 2-3 kali volume. Campuran larutan di
diinkubasi selama semalam pada suhu -20 . Tahap selanjutnya, tabung
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 25 menit pada suhu 4
. Supernatan yang terbentuk dibuang, selanjutnya pellet ditambah

dengan 500

EtOH 70%. Tabung disentrifugasi pada kecepatan 10.000

rpm pada suhu 4

selama 10 menit. Supernatan dibuang dan tabung

yang berisi pelet dikeringkan dengan vakum. Pellet yang berada pada
tabung ditambahi dengan 20

ddH2O dan Rnase sebanyak 3 l

dan

dihomogenkan dengan spin down. Tabung diinkubasi pada suhu 37


selama 10 menit.
3. 2. Deteksi DNA menggunakan Gel Agarosa
Ada tidaknya DNA genom tanaman nanas diketahui dengan
elektroforesis, yaitu

menjalankan DNA genom hasil isolasi pada gel

agarose 1%. Sebanyak 5l DNA genom ditambahi 1l loading dye sampai


tercampur. Campuran dimasukkan ke dalam sumur agarosa 1% (0,3 gram
agarose dalam 30 ml buffer TAE (Tris Acetic EDTA) 1X. DNA lambda
digunakan sebagai marker.
Elektroforesis dilakukan selama 30 menit pada 100 Volt dengan buffer
TAE 1X sebagai running buffer. Gel direndam dalam larutan Ethidium
Bromida (EtBr). Gel dapat divisualisasi dengan meletakkan gel diatas UV
transiluminator untuk melihat ada tidaknya pita DNA genom. Agarose
diambil dari alat elektroforesis kemudian direndam dalam larutan Etidhium
Bromida. Selanjutnya pergerakan DNA diamati di bawah sinar UV.
3. 3. Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA
dengan menggunakan spektrofotometer. Suspensi DNA diencerkan dengan
mengambil 5 l dalam 695 l ddH2O. Suspensi DNA yang telah diencerkan
dibaca absorbansinya pada 260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada
panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1

OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. Konsentrasi DNA dihitung dengan
persamaan,
g
Konsentrasi DNA ml = FP x 50 g/ml x Abs. 260
Sedangkan untuk mengetahui kualitas DNA berhubungan dengan
kemurnian

DNA terhadap

kontaminan

protein

dapat

dilihat

dari

perbandingan nilai absorbansi 260 nm terhadap nilai absorbansi 280 nm.


DNA dikatakan murni apabila nilai perbandingan berada pada rentang 1,82,0.
3. 4. Amplifikasi DNA Genom Tanaman Nanas
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. Teknik ini
merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA
target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang
berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim
dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler (Muladno,
2002). Setiap siklus dari teknik PCR terdiri dari 3 tahap yaitu tahap
denaturasi, pelekatan (annealing) dan pemanjangan (elongation) (Koolman
dan Roehm, 2004).
Pada reaksi amplifikasi digunakan matK3F/matK3R dari matK (pada
masing- masing sampel). Analisis PCR dilakukan dengan total 1x reaksi
sebanyak 10 l (Tabel 1). Campuran dihomogenkan kemudian dimasukkan
ke dalam mesin thermocycler.
Tabel 1. Komposisi PCR mix untuk amplifikasi
Komposisi PCR
Template 100 ng/ l
Master mix
Primer (10 picomol/ l) matK3F
matK3R
ddH2O
Total

1x
1 l
5 l
0.25 l
0.25 l
3.5 l
10 l

13x
13 l
65 l
3.25 l
3.25 l
45.5 l
130 l

Amplifikasi DNA genom tanaman nanas dilakukan 35 siklus ( 2 jam)


dengan temperatur sebagai berikut :
a. Pre denaturasi = 940C; 5 menit

b. Denaturasi = 940C; 1 menit


c. Annealing = 500C; 30 detik
d. Extension = 720C; 1 menit
e. Post extension = 720C; 5 menit
f. Cooling = 250C; 10 menit
g.
3. 5. Elektroforesis Gel Agarosa
Hasil amplifikasi divisualisasikan

menggunakan

elektroforesis

horizontal dengan gel agarose 1 % (w/v) dalam buffer 1x TAE. Sebanyak 10


l larutan DNA hasil amplifikasi dimasukkan ke dalam sumuran gel agrosa
kemudian dialiri arus listrik 100 volt selama 30 menit. Gel agarose
kemudian direndam dalam larutan EtBr, sehingga pola pita dapat dilihat di
bawah sinar ultraviolet.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Isolasi DNA Genom Tanaman Nanas
Pada praktikum ini, dilakukan isolasi DNA genom terhadap tanaman nanas.
Isolasi DNA nanas diambil dari bagian daun tanaman tersebut selanjutnya isolasi
dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu pelisisan sel, presipitasi, pencucian,
pemurnian, dan resuspensi. Secara tahapan tersebut dilakukan dengan
penambahan senyawa kimia.
Pelisisan sel dari nanas dilakukan secara mekanis dan kimia. Pelisisan secara
fisik dilakukan dengan penggerusan daun nanas menggunakan bantuan nitrogen
cair. Penggerusan dilakukan untuk melisiskan diniding sel nanas. Tahap pelisisan
sel DNA genom nanas secara kimia menggunakan metode buffer CTAB
(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide). Prinsip metode CTAB adalah melisiskan
membran sel nanas yang memiliki komponen pospolipid bilayer. CTAB
merupakan senyawa detergen kation yang dapat merusak dan melisiskan
fospolipid, sehingga DNA dapat dipisahkan dengan komponen pengotor lainnya
(gambar 1).
Kandungan fenol pada tanaman, menyebabkan terdapat perbedaan perlakuan
pada isolasi DNA genom dari tanaman nanas jika dibandingkan dengan isolasi

DNA genom pada bakteri dan cendawan. Pada pelisisan sel tanaman nanas,
ditambah dengan larutan

-mercapto etanol.penambahan senyawa pereduksi

ini pada sel tanaman berfungsi untuk mencegah terjadinya proses oksidasi
senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan
oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Selain itu proses lisis juga dibantu
dengan menginkubasi sampel pada suhu 65oC selama 15 menit.

Gambar 1. Pelisisan sel nanas dengan metode CTAB


DNA yang telah terpisahkan dari membran selanjutnya dilakukan 3 tahap
presipitasi dengan penambahan bahan-bahan kimia seperti fenol kloroform
isoamilalkohol, etanol, dan NaOAC. Metode presipitasi dengan kloroform
isoamilalkohol (C:I, 24:1) dilakukan untuk mendenaturasi protein dan melarutkan
komponen lipid. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CI) berdasarkan
perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan
kemampuannya

untuk

mendeproteinisasi

berdasarkan

kemampuan

rantai

polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase


antara kloroform-air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut
dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa
organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform. Fungsi lain dari penambahan
CI ini adalah untuk menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA
pada fase aquoeus. DNA kemudian diikat dari fase aquoeus dengan presipitasi
etanol (Surzycki, 2000).
Presipitasi tahap kedua dilakukan dengan menggunakan larutan fenolkloroform-isoamil

alkohol

(P:C:I,

25:24:1).

Campuran

pelarut

akan

mendenaturasi protein dan melarutkan komponen lipid. Penambahan PCI setelah


disentrifugasi membentuk 3 fase (gambar 2) yaitu fase aquoeus (lapisan paling

atas tempat DNA berada), fase protein (protein terkoagulasi di fase tengah), dan
fase kloroform (paling bawah karena sifat kloroform yang berat jenisnya besar).

Gambar 2. Presipitasi DNA genom tanaman nanas dengan PCI


Tahap presipitasi selanjutnya adalah dengan penambahan NaOAc (2M pH
5,2). Larutan NaOAc berfungsi menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh
ion hidroksida pada tahap lisis sebelumnya. Ikatan-ikatan hidrogen antar basa utas
tunggal DNA terbentuk kembali. Muatan Na+ akan berinteraksi dengan DNA yang
bermuatan negatif. Interaksi tersebut menyebabkan DNA bersifat hidrofob.
Penambahan EtOH absolut juga dilakukan pada praktikum ini. EtOH absolut
digunakan sebagai agen presipitasi lanjutan yang akan memudahkan garam
berinteraksi dengan DNA, sehingga DNA akan mengendap (gambar 3).
Tahap pencucian pellet DNA dengan etanol 70%. Pencucian dilakukan untuk
menghilangkan kelebihan garam. Selanjutnya pellet dikeringkan dan setelah itu
dilakukan pemurnia DNA dari RNA dengan penambahkan RNAase sehingga akan
didapatkan DNA genom yang murni. Tahap resuspensi dilakukan dengan
menambahkan ddH2O yang berfungsi untuk menjaga stabilitas dan lama
penyimpanan DNA.

Gambar 3. Tahap presipitasi dengan EtOH absolut

2. Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer


DNA tanaman nanas yang telah diisolasi, kemudian di cek kuantitasnya
dengan

metode

spektrofotometri

untuk

mengetahui

kemurnian

dan

konsentrasinya. Prinsip metode spektrofotometri adalah menghitung nilai


absorbansi pada A260 dan A280. Kemurnian DNA didapat dari perbandingan antara
nilai absorbansi A260/ A280, dan konsentrasi DNA didapatkan dengan mengalikan
nilai absorbansi A260 dengan faktor pengenceran serta mengonversikannya
kedalam nanogram (ng) dengan mengalikan nilai OD A260 yaitu 50 ng.
Tabel 2. Hasil kuantifikasi DNA genom tanaman nanas dengan metode
spektrofotometri
Sample 260
280
Kemurnian Konsentrasi (ng/l)
1
0.127 0.093
1.365
889
2
0.101 0.073
1.383
707
3
0.159 0.110
1.445
1113
4
0.090 0.073
1.232
630
5
0.108 0.081
1.333
756
6
0.142 0.111
1.279
994
7
0.127 0.091
1.395
889
8
0.146 0.099
1.474
1022
9
0.128 0.101
1.267
896
10
0.052 0.043
1.209
364
Berdasarkan data dari tabel 2, semua hasil perhitungan kemurnian DNA
menunjukkan nilai yang rendah karena berada dibawah 1,8. Menurut Fatchiyah
(2011), DNA dapat dikatakan murni apabila rasio absorbansi DNA yang diukur
pada (A260/A280) menunjukkan nilai 1,8- 2,0. Ketidakmurnian hasil isolasi
dikarenakan terdapat kontaminasi khususnya protein (nilai kemurnian DNA <
1,8). Adanya kontaminan protein hasil isolasi DNA praktikum ini dimungkinkan
karena saat pengambilan supernatan hasil purifikasi dengan PCI, protein yang
mengendap ikut terbawa. Hal lainnya dimungkinkan pada praktikum ini tidak
dilakukan penambahan enzim proteinase K (enzim pendenaturasi protein).

Hasil perhitungan konsentrasi DNA paling tinggi terdapat pada sampel 3


(1113 ng/l) sedangkan konsentrasi terendah terdapat pada sampel 10 (364 ng/l).
Konsentrasi DNA yang pada hasil isolasi cukup besar sehingga pengenceran harus
dilakukan sebelum amplifikasi pada mesin PCR. Pada praktikum ini digunakan
pengenceran sebanyak 100 ng/ l. Konsentrasi DNA perlu diketahui untuk
mendapatkan konsentrasi yang tepat untuk amplifikasi PCR.
3. Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Analisis ini bertujuan mengetahui kualitas dan mengecek ada tidaknya DNA
dalam gel. Gambar 4 menunjukkan hasil migrasi DNA pada gel agarosa dimana
terlihat pita DNA menandakan keberadaan genom.

Gambar 4. Elektroforegram DNA genom nanas hasil isolasi


Pita tunggal DNAterlihat pada sampel 2, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9. Pada sampel 1, 3,
dan 10 tdak terlihat adanya band DNA. Pada sebagian pita migrasinya belum
seutuhnya bersih dari smear yang mungkin dikarenakan kualitas DNA kurang
baik karena mengalami kepatahan. Smear terbentuk akibat degradasi DNA
menjadi polinukleotida-polinukleotida yang pendek. Hal ini disebabkan perlakuan
DNA selama isolasi, yaitu sentrifugasi, perlakuan suhu, atau perlakuan dengan
larutan-larutan yang digunakan.
Sedangkan tidak adanya band DNA yang terdeteksi juga dimungkinkan
karena banyak faktor, antara lain ketidakmurnian hasil isolasi DNA genom yang
masih mengandung kontaminan atau pengotor lain (mengacu pada tabel 2
rendahnya kemurnian dari hasil isolasi DNA genom); konsentrasi DNA yang
dimasukkan ke dalam sumuran terlalu sedikit sehingga pita band DNA tidak
terdeteksi. Adanya pengotor berupa protein (kemurnian < 1,8 ) pada praktikum ini
dapat disebabkan karena saat pengambilan supernatan hasil purifikasi dengan

PCI, protein yang mengendap ikut terbawa. Hal lainnya dimungkinkan pada
praktikum ini tidak dilakukan penambahan enzim proteinase K (enzim
pendenaturasi protein).
Adanya pita marker lambda yang terlihat jelas menandakan proses
elektroforesis berjalan dengan benar. Sehingga faktor ini bukan pemicu
ketidakmunculannya pita DNA hasil isolasi.
4. Identifikasi Tanaman Nanas berdasarkan matK
Identifikasi spesies tumbuhan awalnya menggunakan metode morfologi yang
diidentifikasi dari bentuk fisiknya (bunga, daun, batang, cabang dan biji). Namun,
dengan adanya perkembangan teknologi elektronika dan genetika saat ini telah
dikembangkan suatu metode terbaru dalam identifikasi spesies tumbuhan dan
hewan, yaitu teknologi DNA barcoding yang menggunakan potongan DNA
pendek standar (barcode DNA) (Kalangi, 2014).
Untuk identifikasi tanaman dalam teknologi DNA barcoding, disepakati
menggunakan gen pengkode standar yaitu gen ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase
(rbcL) dan gen maturaseK (matK) yang terdapat pada kloroplas (CBOL Plant
Working Group, 2009). Gen matK lebih banyak digunakan dalam berbagai
penelitian dibandingkan gen rbcL, karena tingkat keakuratannya yang lebih
spesifik pada yaitu pada tingkat spesies. Gen matK dijadikan gen pengkode
standar untuk barcode DNA sejak tahun 2003 dan telah diuji melalui beberapa
penelitian. Gen maturaseK (matK) diidentifikasi pertama kali oleh Sugita et al.
(1985) dari tanaman tembakau (Nicotiana tabacum). Gen matK merupakan gen
pengkode enzim maturase bagian sub-unit K yang terdapat dalam kloroplas pada
tanaman. Daerah urutan nukleotida gen matK ini dapat menghasilkan kira-kira
1500 pb (pasang basa) (Kalangi, 2015).

Gambar 5. Gen matK diambil dari DNA kloroplast

5. PCR DNA Tanaman Nanas dengan Primer matK3 F dan matK3 R


Isolat DNA tanaman nanas diamplifikasi pada mesin PCR menggunakan
primer matK3 F dan matK3R. Primer matK3 F memiliki urutan basa 5-AAG
ATG CCT CTT CCT TGC AT-3 dan primer matK3 R memiliki urutan basa 5GAT CCG GTC TGA TAA TGA GA-3. Setelah dilakukan PCR dan di cek
kualitasnya melalui elektroforesis dapat dilihat pada gambar dibawah ini. Pada
praktikum ini menggunakan konsentrasi DNA sebesar 100 ng/ l

Gambar 6. Elektroforegram amplikon DNA genom nanas berdasarkan penanda


matK; Marker 1 kb DNA ladder.
Hasil elektroforegram menunjukkan daerah matK tanaman nanas pada 9
sampel membentuk pita DNA yang tebal. Tebal dan tipisnya pita menunjukkan
kuantitas dari DNA template yang teramplifikasi. Elektroferogram amplikon DNA
genom tanaman nanas pada praktikum ini terlihat jelas dan tebal mengindikasikan
bahwa konsentrasi molekul yang terseparasi pada wilayah ini tinggi. Pada
sumuran nomor 10 didapat pita yang samar. Pita DNA yang samar atau tipis pada
gambar diatas bisa terjadi karena konsentrasi DNA yang teramplifikasi nilainya
rendah.
Hasil visualisasi (gambar 6) juga membentuk 3 pita tipis yang berada
dibawah pita tebal. Pita tipis ini terbentuk karena DNA hasil amplifikasi
mengalami fragmentasi. Fragmentasi dapat terjadi selama proses ekstrasi, salah
satunya pada waktu proses homogenisasi menggunakan vortex (Mulyani, 2011).

bp
100
00
800
0
600
0
500
0
400
0
350
0
300
0
250
0
200
0
150
0
100
0
750

Log bp

4
3,9030
9
3,7781
51
3,6989
7
3,6020
6
3,5440
68
3,4771
21
3,3979
4
3,3010
3
3,1760
91
3
2,8750
61

Proses homogenisasi menggunakan vortex dapat

Jarak
(cm)

membantu
menyebabkan

proses
DNA

pelisisan,

namun

terpotong-potong

dapat
sehingga

3,4

menyebabkan terbentuknya beberapa pita DNA

3,7

ketika dielektroforesis. Kemungkinan lain adalah

4
4,35
4,7
5

suhu annealing ketika PCR kurang spesifik.


Pada praktikum ini tidak terjadi masalah dengan
elektroforesis karena DNA marker menunjukan
adanya pita DNA dan tidak smear. Sehingga
anggapan penggunaan tegangan yang terlalu besar
(penyebab smear) tidak terjadi pada praktikum ini.

5,25
5,7
6,2

Dengan mengukur jarak migrasi pita-pita sumur


marker maka diperoleh persamaan yang akan
digunakan untuk menentukan ukuran basa dari DNA
tanan

6,9
7,8
8,5

nanas

yang

telah

diamplifikasi.

Hasil

perhitungan secara manual menggunakan alat ukur


penggaris, maka diperoleh data sebagai berikut:
Tabel 4. Jarak migrasi marker 1 kb ladder

4.5
4
f(x) = - 0.21x + 4.62
R = 0.99

3.5
3
2.5
2

Linear ()

1.5
1
0.5
0
3

10 11

Gambar 7. Grafik perbandinganjarak migrasi marker 1


kb ladder dengan log bp ukuran DNA bakteri dari
marker 1 kb

Migrasi DNA tanaman nanas dari semua sampel ketika diukur dengan
penggaris, jaraknya adalah 8,4 cm dari sumuran. Sehingga, berdasarkan
persamaan linier y = -0,209x + 4,4623, diperoleh ukuran DNA genom bakteri
sebesar 736 pasang basa atau berkisar 750 pasang basa.
KESIMPULAN

Identifikasi molekular pada tanaman nanas dapat dilakukan dengan


amplifikasi gen matK. Dari 10 sampel, ada 9 sampel yang dapat teramplifikasi
namun terdapat fragmentasi DNA karena. Amplifikasi gen ini akan menghasilkan
DNA dengan ukuran sekitar 750 pasang basa.
Pada praktikum ini isolasi DNA genom tanaman nanas dilakukan dengan
metode CTAB. Hasil kuantifikasi DNA dengan spektrofotometer pada semua
sampel menunjukkan nilai kemurnian yang rendah (kurang dari 1,8). Untuk
konsentrasi DNA secara umum relatif cukup tinggi, sehingga dilakukan
pengenceran pada 100 ng/ l.
Dari 10 sampel, terdapat 7 sampel yang membentuk pita DNA hasil isolasi
DNA genom. Sedangkan identifikasi molekular tanaman nanas yang dilakukan
dengan amplifikasi pada daerah matK3, pada 9 sampel muncul adanya pita DNA.
Ukuran pita DNA yang dihasilkan oleh tanaman nanas menujukkan ukuran sekitar
736 pasang basa atau sekitar 750 pasang basa.
DAFTAR PUSTAKA
CBOL (Consortium for the Barcode of Life) Plant Working Group. 2009. A DNA
Barcode for Land Plant. Proceeding of the National Academy of Sciences.
106: 12794-12797
Hebert, P. D. N., N. A. Cywinska, S. L. Ball, and J. R. de Waard. 2003. Biological
Identifications Through DNA Barcodes. Proceedings of the Royal Society B:
Biological Science. 270: 313321.
Kalangi, C. 2014. Barcode DNA Tanaman Leilem berdasarkan Gen matK. Jurnal MIPA
UNSRAT, 3 (2): 108-112.
Lahaye, R., M. V. D. Bank, D. Bogarin, J. Warner , F. Pupulin, G. Gigot, O. Maurin, S.
Duthoit, T. G. Barraclough and V. Savolainen. 2008. DNA barcoding the
floras of biodiversity hotspots. Proc. Nat. Acad. Sci. 105: 2923-2928.
Mulyani, Y. 2011. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini Koi.
Herpes Virus pada Ikan Mas. Jurnal AkuatikaI, 8 (11): 1-16.
Sugita, M., K. Shinozaki, and M. Sugiura. 1985. Tobacco Chloroplast tRNALys(UUU)
Gene Contains a 2,5-kilobase-pair Intron. Proceeding of the National
Academy of Sciences. 82: 3557-3561.
Xue, C.Y. and D.Z. Li. 2011. Use of DNA barcode sensu lato to identify traditional
Tibetan medicinal plant Gentianopsis paludosa (Gentianaceae). J. Sys. Evol.
49: 267.