Anda di halaman 1dari 10

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DASAR

ELEKTROFORESIS

DISUSUN OLEH :
NAMA

DIANIRA G. MAENGKOM

NIM

13533039

KELAS

KELOMPOK

2 (DUA)

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI MANADO
OKTOBER 2015

A. Tujuan Percobaan
Untuk menentukan massa molekul relatif (Mr) dari protein dengan menggunakan
animasi elektroforesis dan foto dari gel hasil elektroforesis.
B. Dasar Teori
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikelpartikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan
dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan
perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini
dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Russell, P.J. 1994).
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis
yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan
menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397).
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel
baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang
dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya,
mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan (Klug &
Cummings 1994: A-6). Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan
sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein
atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen 1999: 280).
Prinsip dari teknik elektroforesis didasarkan pada kenyataan bahwa kebanyakan molekul
mempunyai muatan tertentu bagi molekul tersebut. Protein dan nukleotida adalah molekul
yang berukuran besar dan memiliki muatan sehingga cocok untuk menggunakan teknik
elektroforesis (Tim Dosen Praktikum Biokimia Dasar, 2015). Prinsip kerja dari elektroforesis
berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), yang bergerak menuju
kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings 1994: A-6).
Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa
yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug & Cummings 1994: A-7). Elektroforesis
dapat dibagi menjadi tiga yaitu elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan elektroforesis

kapiler. Saat ini, teknik yang paling banyak digunakan adalah elektroforesis gel. Gel pada
elektroforesis dapat dibuat dari bahan seperti acrylamida, pati atau agarosa (Tim Dosen
Praktikum Biokimia Dasar, 2015).
Dari segi cara pemisahan protein, gel elektroforesis dapat dibedakan atas native gel, SDS gel
dan isoelectric focusing gel. Pemisahan dengan native gel didasarkan pada muatan protein
dan ukuram molekul. Pemisahan dengan SDS gel didasarkan pada ukuran molekul protein
saja, sedangkan pemisahan dengan isoelectric focusing gel didasarkan pada pI dari protein
(Tim Dosen Praktikum Biokimia Dasar, 2015).
Elektroforesis dengan Acrylamid (PAGE) merupakan metode standar untuk memisahkan,
identifikasi, karakterisasi dan purifikasi molekul DNA/RNA. Teknik ini biasa digunakan
karena murah, sederhana, sampel yang digunakan relatif sedikit dan lokasi DNA dapat
langsung diamati dengan menggunakan perak nitrat sebagai zat warna (Pasila, Artha, 2003).
Pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE bertujuan untuk memisahkan protein dalam
sampel berdasarkan berat molekul. Prinsip dasar SDS-PAGE ini adalah denaturasi protein
oleh sodium dodecyl sulphate yang dilanjutkan dengan pemisahan molekul berdasarkan berat
molekulnya dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel, dalam hal ini digunakan
polyacrylamide (Pasila, Artha, 2003)
Dalam elektroforesis gel, gel yang digunakan biasanya merupakan polimer yang bertautan
silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk
memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA , RNA , atau oligonukleotida),
gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi
berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker),
menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk
memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang
digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan (Davis,dkk
1994)
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel
yang ditempatkan di dalam larutan penyangga,dan listrik dialirkan kepadanya. Molekulmolekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik
sesuai dengan muatannya.Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar
hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida

digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif (Gardner,1991)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi
menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya.
Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif
(anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju
kutub negative (katoda) (Klug and Cummings, 1994).
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati
suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran
molekul DNA menjadi pita-pita yang masing- masing terdiri atas molekul DNA dengan
panjang yang sama (Campbell dkk, 2002). Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam
elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan
menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa , berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis
yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar (Davis dkk. 1994).
Mobilitas/pergerakan DNA relative tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada
konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan
buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri (Martin, R. 1996). Elektroforesis gel
memiliki beberapa komponen yang terdiri dari :
1.
2.
3.
4.

Comb
Tray
Chamber
Sumber listrik

: digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.


: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.
: digunakan sebagai wadah gel agarosa.
: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis (Birren and

Lai, 1993).
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat
karsinogenik dan Bromphenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan

Bromphenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada
gel (Birren and Lai, 1993).
C. Alat dan Bahan
1.
2.
3.
4.

Laptop/komputer
Program/video animasi elektroforesis
Fotocopy gel hasil elektroforesis
Foto dari gel hasil elektroforesis

D. Prosedur Kerja
Penentuan Massa Molekul Relatif (Mr) dari Protein
1. Diikuti program/video animasi elektroforesis di layar komputer/laptop
2. Setiap kelompok mendapatkan fotocopy/gambar dari gel hasil elektroforesis yang siap
dianalisis
3. Dari gambar tersebut tampak pita-pita dari protein standar dan protein yang belum
diketahui.
4. Dari gambar tersebut juga telah dicantumkan nilai Mr dari setiap pita protein standar
(dalam satuan kD).
5. Dengan menggunakan penggaris diukur jarak yang ditempuh setiap pita protein dan jarak
yang ditempuh bromphenol blue.
6. Untuk setiap pita pada protein standar,dihitung nilai Rf menggunakan persamaan berikut
ini :
Rf =

jarak yang ditempuh pita protein


jarak yang ditempuh pewarna

7. Diulangi kembali langkah 6 untuk pita protein yang belum diketahui.


8. Dengan menggunakan program di komputer/laptop mis : MS Excel, plotkan log (Mr)
sebagai fungsi dari Rf.
9. Dari hasil analisis MS Excel akan diperoleh persamaan y =

m+b

nilai y untuk menentukan nilai Mr dari protein yang belum diketahui.

E. Hasil Pengamatan
1. Berikut nilai Rf dari setiap protein standar

dan diselesaikan

0,6
=0,041
14,6

Rf =

Rf =

2,55
=0,175
14,6

Rf =

4,1
=0,281
14,6

Rf =

5,3
=0,363
14,6

Rf =

8
=0,548
14,6

Rf =

9,3
=0,637
14,6

Rf =

11,2
=0,767
14,6

Rf =

14,2
=0,973
14,6

2. Berikut nilai Rf dari protein yang belum diketahui


8,8
Rf =
=0,603

14,6
3. Tabel nilai Rf dari protein standar(8) dan protein yang belum diketahui (1) serta log Mr
Rf

log M/W

0,041

2,398

0,175

1,875

0,281

1,699

0,363

1,568

0,548

1,398

0,603

1,352

0,637

1,301

0,767

1,176

0,973

1,000

4. Hasil plot log (Mr) sebagai fungsi dari Rf (MS Excel)

Standard
Unknown
3
2
log M/W

f(x) = - 1.35x + 2.19


R = 0.91

1
0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

Rf

y=mx +b

y=1,3469 x+2,186 3
y=1,3469 ( 0,6 ) +2,186 3
y=1,378
antilog y =10

1378

23,8

Jadi , Mr dari protein yang belum diketahui adalah23, 8

F. Pembahasan

Pada percobaan keempat ini, kami melakukan percobaan laboratorium kering. Dimana kami
diberikan fotocopy/gambar gel hasil elektroforesis. Dari gambar tersebut akan ditentukan Mr
dari protein yang belum diketahui. Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk
memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat
berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi
mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi
menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya
(Bowen 2000:1). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju
kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings 1994: 215).

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur (well) pada
gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik dengan kutub
yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan
terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel ; satu lajur merupakan
arah pergerakan sampel dari sumur gel. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik
terhadap logaritma ukuran molekul.
Dari gambar gel hasil elektroforesis tampak pita-pita dari protein standar dan protein yang
belum diketahui. Juga dicantumkan nilai Mr dari setiap pita protein standar. Kemudian untuk
setiap pita-pita protein standar dan protein yang belum diketahui dihitung nilai Rf-nya,
dengan membagi jarak yang ditempuh pita protein dengan jarak yang ditempuh pewarna.
Nilai Rf ini dinyatakan sebagai sumbu x. Sedangkan untuk nilai Mr protein standar yang
sudah dilogkan dinyatakan sebagai sumbu y.
Dari nilai Rf dan log Mr ini, kemudian diplotkan dalam bidang Cartesius (x,y) sehingga akan
diperoleh persamaan linear atau persamaan garis lurus

y=mx +b .

Plot log (Mr) sebagai

fungsi dari Rf dilakukan menggunakan MS Excel dan diperoleh persamaan

y=

1,3469 x + 2,1863. Diperoleh juga nilai r2 = 0,911. Karena r2 < 0,99 maka hubungan linear
tidak terlalu kuat antara Mr protein dan jarak yang ditempuh pita protein sehingga
mungkin tidak terlalu handal untuk memprediksi Mr protein.

Dari kurva standar log (Mr) vs Rf dapat dilihat protein yang belum diketahui diberi tanda
merah. Untuk menghitung Mrnya maka ditarik garis lurus (horizontal dan vertical) sehingga
tepat memotong titik merah tersebut. Perpotongan garis tersebut tepat pada axis 0,6 (sumbu
x). Dengan mensubstitusikan nilai x = 0,6 ke persamaan

y= 1,3469 x + 2,1863 maka

diperoleh nilai

y=1,378 . Dengan mengantilogkan nilai y maka diperoleh Mr protein yang

belum diketahui adalah 23,8.


Beberapa kesalahan yang mungkin terjadi sehingga hasil perhitungan Mr kami mungkin salah
diantaranya :
1. Kurangnya ketelitian dalam menarik garis dari setiap pita sehingga hasil perhitungan
Rf tidak maksimal
2. Setelah diplotkan pada MS Excel log (Mr) sebagai fungsi dari Rf tidak menghasilkan
garis lurus mungkin disebabkan karena hasil perhitungan Rf yang tidak teliti.
G. Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa:
1. Massa molekul relatif (Mr) dari protein yang belum diketahui adalah 23,8

H. Daftar Pustaka
Birren, B. & E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic Press,
Inc., San Diego: xviii + 235 hlm.
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Terj. dari
BIOLOGY oleh Lestari, R, dkk. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton
& Lange, Norwola: xii + 777 hlm.
Fairbanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life.

Brooks/Cole

Publishing Company, New York: xix + 820 hlm.


Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics. 8th ed. John Wiley
& Sons Inc., New York: xviii + 713 hlm.
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood
Cliffs: xvi + 773 hlm.

Martin, R. 1996. Gel electroforesis: Nucleid acids. Bros Scientific PublishersLtd., Oxford:
xiii + 173 hlm.
Pasila, Arta. 2003. Jurnal Identification of excreation-seretion protein profile of he adult
Haemonchus contortus with SDS-PAGE. Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga.
Surabaya.

Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers, New York:
xvi + 528 hlm.
Tim dosen Praktikum Biokimia Dasar. 2015. Penuntun Praktikum Biokimia Elektroforesis.
Laboratorium Biokimia FMIPA Universitas Negeri Manado.