Isolasi, kloning dan karakterisasi molekul poligalakturonase I (pga

I)
gen dari Aspergillus niger mengisolasi dari mangga

Metabolisme zat pektin yang mengandung tulang belakang residu -1,4-linked- asam Dgalacturonat dilakukan di alam oleh aksi dari berbagai enzim pectinolytic, seperti
poligalakturonase, methylgalacturonase, pektin metil esterase dan lyases pektin. Enzim
pectinolytic memiliki peran yang berbeda di alam tergantung pada organisme memproduksi
mereka. Mereka dapat bertindak sebagai enzim yang penting untuk pematangan buah. Mereka
juga dapat berfungsi sebagai enzim yang terlibat dalam pembusukan jaringan tanaman ketika
diproduksi oleh saprophytes. Polygalacturonases adalah yang pertama mendegradasi dinding sel
Enzim yang dihasilkan oleh jamur patogen ketika kultur pada dinding sel tanaman terisolasi atau
selama infeksi. Potensi utama dari enzim pectinolytic diproduksi oleh jamur saprofit, Aspergillus
niger adalah aplikasi yang luas dalam makanan dan minuman industri, terutama untuk persiapan
jus.
Penerapan pectinases secara individu atau didefinisikan kombinasi pectinases, antara yang
polygalacturonases, esterase, lisis Pektat bisa meningkatkan pemecahan dikendalikan pektin dan
mungkinmenyebabkan zat pectic didefinisikan dengan baik.
Bussink et al menunjukkan adanya 7 gen pga berbeda dari A. niger, yang tiga gen, yaitu,
pga I, pga II dan pga C, sudah pernah dikarakterisasi. Dalam tulisan ini, kami melaporkan
isolasi, kloning dan karakterisasi molekul gen pga I diisolasi dari A. niger mengisolasi dari buah
mangga. Juga urutan asam nukleat dari gen pga I, urutan asam aminonya dan berat mol perkiraan
protein dari isolat ini disebutkan.
Bahan dan metode
Isolasi A. Niger
Jamur, A. niger diisolasi dari kulit buah-buah mangga yang terinfeksi. A.niger di tumbuhkan pada
Petridishes yang mengandung Potato Dextrose Agar (PDA) media dalam kondisi aseptik.
Laboratorium menumbuhkan kultur murni A. niger yang digunakan lebih lanjut untuk tujuan
eksperimental. Kultur murni diinokulasi pada PDA dalam petridish dan tumbuh pada suhu kamar
(25 C 1 C) selama 2-3 hari untuk miselia.

Persiapan cDNA
Dari miselia A. niger, RNA diisolasi seperti dijelaskan oleh Sambrook et al. cDNA dihasilkan
menurut Gilliland et al. Pada langkah pertama, Reaksi transcriptase kebalikan dilakukan pada 5
ug total RNA yang diisolasi dari A. niger menggunakan enzim transcriptase kebalikan, buffer
reaksi dan spesifik. 3 'primer akhir seperti yang dijelaskan oleh pemasok (Promega, USA). Pada
langkah kedua, reaksi transcriptase kebalikan digunakan untuk PCR pemanfaatan yang kedua, 5'
primer akhir spesifik. program PCR tersebut adalah bekas dengan itu Suhu anil spesifik untuk
konsensus maju primer 5 ' ATGCACTCTTACCAGCTTCTTGGC 3 'dan sebaliknya primer 5
'TCTCGCATTTATCGCTGGTCTTGC 3' karena gen pgaI.. PCR amplifikasi dilakukan
menggunakan Piko Cycler Termal Finnzyme buatan. Master campuran untuk PCR dibuat dengan

menambahkan 2 uL Taq Buffer (10 ), 2 uL dNTP ini (10 m M), 0,4 uL Taq Polymerase (3 U /
mL), 7 uL BSA (1 mg / mL), 0,2 uL Tween 20, 2 uL DNA-A dan -DNA Genom terbalik
spesifik dan primer ke depan, 3 uL DNA template dari setiap biotipe dan 3,4 uL SMQ untuk
membuat volume akhir 20 uL. Semua komponen dicampur dalam tabung 0,2 ml PCR dan Mesin
PCR ditetapkan dengan memberikan program untuk denaturasi pertama pada 94 Hai C selama 3
menit, denaturasi kedua di 94 Hai C selama 15 detik, annealing selama 30 detik dan ekstensi di
72 Hai C selama 5 menit. Setiap reaksi dilanjutkan dengan 38 siklus. Produk PCR
dielektroforesis menggunakan 0,8% gel agarosa. Gel diwarnai dengan ethidium bromida dan
divisualisasikan dengan menggunakan DNR membuat Gel Dokumentasi Sistem. Sebuah
amplikon dari sekitar 1,1 kb diamplifikasi.
Ligasi dan Identifikasi Insert DNA
Amplikon yang dielusi keluar dari gel agarosa menggunakan Gel Extraction Kit (Vivantis,
Malaysia) oleh menggunakan protokol yang diberikan oleh produsen.
Ligasi produk PCR
ligasi amplikon yang dilakukan sesuai panduan pengguna disediakan dengan pGEM-T Easy
vektor kit (Promega, USA). Escherichia coli JM109 digunakan sebagai sel inang. Campuran
ligasi adalah dibuat dengan menambahkan 5 uL 2 cepat ligasi penyangga, 2 uL Vector (100-150
ng), 6 uL Insert (300-400 ng) dan 1 uL T4 DNA Ligase (3 U / mL). Volume akhir dibuat untuk 15
mL dengan air SMQ dan reaksi ligasi diatur. Untuk mendapatkan maksimum jumlah transforman,
reaksi dilakukan semalam di 4 C.
Persiapan Garis Sel Kompeten
Sebuah koloni tunggal E. coli JM 109 diinokulasi di 2 ml media LB dan tumbuh semalam di 37
C. Sekitar 500 uL kultur dewasa semalam itu ditambahkan ke 50 mL media LB segar dan ditanam
untuk 2-3 jam. Sel dipanen dengan sentrifugasi pada 4.000 rpm selama 10 menit pada 4 C.
Pelet sel ditangguhkan dalam 20 mL es dingin 100 m M CaCl 2 dan recentrifuged. Pelet
disuspensikan dalam 1 mL 100 m M CaCl 2. Ini kemudian dibagikan dalam 200 uL aliquots
untuk Eppendorf tabung dan disimpan pada 4 C semalam.
Sebuah kultur sel tunggal dilakukan untuk mendapatkan kultur murni membawa DNA
insert. Sebuah koloni tunggal E. coli JM 109 diinokulasi di 2 ml media LB dan tumbuh semalam
di 37 C. 50 ml media LB diinokulasi dengan budaya semalam 5 mL E. coli dan tumbuh pada
suhu 37 C pada 200 rpm. ketika sebuah density optimal (OD 600 ) Dari 0,5-0,8 dicapai, sel
yang dingin di atas es selama 15-20 menit dan disentrifugasi pada 4000 rpm pada suhu 4 C
selama 15 menit. Sel-sel kemudian dicuci dengan satu volume (50 ml) es dingin steril air dan
disentrifugasi lagi. Pelet itu disuspensi kembali dalam 1 mL 100 m M CaCl 2 . Ini kemudian
dibagikan dalam 200 aliquots uL untuk Eppendorf tabung dan disimpan pada 4 C semalam. Selsel yang akhirnya ditangguhkan di 0.004 volume (2 mL) dari es dingin gliserin. Aliquots 25-50
uL ditempatkan menjadi es tabung eppendorf dingin, dibekukan dengan cepat dalam nitrogen cair
dan disimpan pada -80 C.
Transformasi E. Coli

Kompeten E. sel coli JM109 yang diubah seperti yang dijelaskan oleh Sambrook et al 6. DNA (50
ng) ditambahkan ke E. kompeten sel coli, dicampur dan disimpan di atas es selama 30 menit. Selsel kemudian diinkubasi pada 42 C selama 2 menit. Untuk setiap tabung 800 uL LB broth
ditambahkan dan selanjutnya diinkubasi pada 37 C untuk 1 jam. Sel-sel pellet dengan
sentrifugasi dan disuspensi kembali dalam 200 uL LB broth dan tersebar di LB piring medium
yang mengandung antibiotik yang sesuai, IPTG (40 mg / mL) dan 40 ug / mL X-gal. total 13
koloni berubah ditumbuhkan pada agar LB media selektif.
Isolasi dan Identifikasi Insert
Plasmid rekombinan diisolasi menggunakan basa metode lisis dan ditandai dengan pembatasan
pencernaan. Plasmid itu dicerna dengan Sac II dan Tidak endonuklease restriksi saya untuk
mengisolasi insert dari plasmid vektor. Fragmen yang diinginkan adalah juga sequencing untuk
konfirmasi lebih lanjut dan karakterisasi DNA yang diinginkan (Gbr. 1). Itu Fragmen dibatasi
dielusi keluar dari agarose yang gel dan sequencing.
Urutan DNA dikonfirmasi dengan menggunakan NCBI Ledakan alat. DNA sequencing
menunjukkan tinggi kesamaan urutan dengan I gen pga dari A. niger.
Hasil dan Diskusi
Dalam rangka untuk mengisolasi I gen pga, klon cDNA dari yang endopolygalacturonase dari A.
niger dari mangga buah digunakan. CDNA dikloning ke dalam pGEM-T vektor dan diverifikasi
menggunakan pencernaan pembatasan (Gambar. 1). Parsial klon cDNA dari pga I dengan 1101 bp
fragmen mengandung 1.093 bp ORF, memiliki potensial untuk mengkodekan protein dari 367
asam amino residu. Inisiasi kodon ATG adalah di posisi dari 1 bp dan kodon stop TGA berada di
1.044 bp (Gambar. 2).
Analisis urutan pga I
Alignment beberapa sekuens antara I gen pga dan gen pga dari A. niger (NCBI Acc.no. XM
001389525) dan A. fumigatus (Acc.no. XM 746347) dilakukan dengan menggunakan alat analisis
CLUSTALW (Gambar. 2). Hasil Blast pencarian menggunakan urutan asam amino dalam
database NCBI menunjukkan bahwa gen yang diisolasi dari A. niger isolat memiliki 1101
nukleotida. Panjang pga kloning sangat mirip dengan lainnya dilaporkan dari Aspergillus spp.,
yang berkisar 1.107-2.495 nukleotida. Alat CLUSTALW untuk urutan ganda dan berpasangan
keberpihakan dan konstruksi pohon filogenetik menyelaraskan urutan dengan sekuens asam
nukleat dari polygalacturonases dari dua lainnya Aspergillus spp. mengungkapkan bahwa urutan
pga saya dari A. niger mengisolasi saham 98 dan 78% kesamaan dengan gen poligalakturonase
dari A. niger (XM 001.389.525; Pel et al 9 ) Dan A. fumigatus (XM 746347; Nierman et al 10 ),
Masing-masing (Gambar. 2). Dideduksi Asam Amino urutan pga saya dan Perbandingan dengan
Gen poligalakturonase lainnya Urutan asam amino dari saya gen pga terisolasi adalah diprediksi
dengan menggunakan Genescan bioinformatika alat. Itu massa protein dan titik isoelektrik
dihitung oleh menggunakan protein Kalkulator on line alat (http://scansite.mit.edu/cgi-bin/calcpi).
amino dideduksi urutan asam diperoleh dengan menggunakan ExPasy alat bioinformatika.
Berdasarkan perbandingan asam nukleat berurutan dari pga saya dengan urutan dari yang lain
jamur polygalacturonases, itu aku s bersih bahwa poligalakturonase pga saya, disintesis sebagai
klon cDNA, Kode untuk sebagian dari 367 asam amino (Gbr. 3). Itu urutan asam amino dideduksi

dari enzim dewasa kode untuk protein dari 38,28 kDa mol dengan Titik isoelektrik dari 4,40.
Perbandingan tiga polygalacturonases (endopolygalacturonase I, endopolygalacturonase II,
endopolygalacturonase C) yang dihasilkan oleh A. niger adalah dilaporkan oleh Visser et al.. The
beberapa urutan penyelarasan dideduksi urutan asam amino enzim poligalakturonase (pga I)
dengan lainnya.
polygalacturonases (pga) saham asam amino 96% urutan kesamaan dengan protein dari A. niger
(XM 001.389.525) dan 76% kesamaan dari A. fumigatus (XM 746347) (Gambar. 4). Pekerjaan
lebih lanjut pada ekspresi, aktivitas katalitik dan mutagenesis I gen pga sedang dipertimbangkan.