Anda di halaman 1dari 46

BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikrobiologi merupakan suatu cabang ilmu biologi yang mempelajari tentang
mikroorganisme dan interaksi mereka dengan organism lain dan lingkungannya. Sementara
mikroba sendiri merupakan jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat baik untuk
bertahan hidup. Jasad tersebut dapat hidup hampir di semua tempat di permukaan bumi.
Mikroba mampu beradaptasi dengan lingkungan yang sangat dingin hingga lingkungan yang
relative panas, dari ligkungan yang asam hingga basa.
Pengujian dalam mikrobiologi memanfaatkan mikroorganisme sebagai indicator
pengujian. Dalam hal ini mikroorganisme digunakan sebagai penentu konsentrasi komponen
tertentu pada campuran kompleks kimia, untuk mendiagnosis penyakit tertentu, serta untuk
menguji bahan kimia guna menentukan potensi mutagenikatau karsinogenik suatu bahan.
Macam-macam uji dapat dilakukan adalah ui antibiotic/antimicroba, bioautografi , uji
vitamin dan asam amino, uji ames,dan penggunaan mikroorganisme sebagai model
metabolisme obat mamalia.
Definisi dari senyawa antimikroba adalah senyawa kimia yang dapat menghambat
pertumbuhan atau membunuh mikroba. Antimikroba dapat dikelompokkan menjadi
antiseptikdan desinfektan. Antiseptik adalah pembunuh mikroba dengan daya rendah dan
biasa digunakanpada kulit, misalnya alkohol dan deterjen. Desinfektan adalah senyawa kimia
yang dapatmembunuh mikroba dan biasa digunakan untuk membersihkan meja, lantai, dan
peralatan.Contoh desinfektan yang digunakan adalah senyawa klorin, hipoklorit, dan
tembaga sulfat. Mekanisme daya kerja antimikroba terhadap sel dapat dibedakan atas
beberapa kelompok sebagai berikut diantaranya merusak dinding sel, mengganggu
permeabilitas sel, merusak molekul protein dan asam nukleat, menghambat aktivitas enzim,
menghambat sintesa asam nukleat.
Pada awalnya antibiotika diisolasi dari mikroorganisme, tetapi sekarang beberapa
antibiotika telah didapatkan dari tanaman tinggi atau binatang. Suatu zat antibiotik
kemoterapeutik yang idealnya hendaknya memiliki sifat-sifat sebagai berikut: harus
mempunyai kemampuan untuk merusak atau menghambat mikroorganisme patogen spesifik.
Makin besar jumlah dan macam mikroorganisme yang dipengaruhi makin baik. Tidak

mengakibatkan berkembangnya bentuk-bentuk resiten parasit. Sehingga memungkinkan


mikroba

yang

biasanya

nonpatogenik

atau

bentuk-bentuk

patogenik

yang

semuladikendalikan oleh flora normal, untuk menimbulkan infeksi baru.


Antibiotika pertama kali ditemukan oleh Alexander Fleming pada tahun 1929, yangsecara
kebetulan menemukan suatu zat antibakteri yang sangat efektif yaitu penisilin. Penisilin ini
pertama kali dipakai dalam ilmu kedokteran tahun 1939 oleh Chain dan Florey. Antibiotik
ialah suatu bahan kiia yang dikeluarkan oleh jasadrenik/hasil sintetis semi-sintetis yang
mempunyai struktur yang sama dan zat ini dapatmerintangi/memusnahkan jasad renik
lainnya. Antibiotik yang efektif bagi banyak spesies bakteri, baik kokus, basil maupun
spiril,dikatakan mempunyai spektrum luas. Sebaliknya, suatu antibotik yang hanya efektif
untuk spesies tertentu, disebut antibiotik yang spektrumnya sempit. Penisilin hanya efektif
untuk memberantas terutama jenis kokus, oleh karena itu penisilin dikatakan mempunyai
spektrum yang sempit. Tetrasiclin efektif bagi kokus, basil dan jenis spiril tertentu. Oleh
karena itutetrasiclin dikatakan mempunyai spectrum luas (Dwidjoseputro, 2003). Burahol
(Stelechocarpus burahol) termasuk keluarga Annonaceae. Kebanyakan suku ini mengandung
senyawa sitotoksik, antimikroba, dan juga sebagai insektisida. Jenis bahan kimia pembersih
dan sanitiser yang digunakan dalam industri pangan harussesuai persyaratan yang ditetapkan.
Bahan kimia harus mampu mengendalikan pertumbuhan bakteri (antimikroba). Antibiotika
pertama kali ditemukan oleh Alexander Fleming pada tahun 1929, yangsecara kebetulan
menemukan suatu zat antibakteri yang sangat efektif yaitu penisilin. Penisilin ini pertama
kali dipakai dalam ilmu kedokteran tahun 1939 oleh Chain dan Florey. Sebagianbesar dari
antibiotika rumus kimianya telah diketahui dan beberapa di antaranya dapat dibuatsecara
sintesis.
Aktivitas antimikroba dapat dikendalikan dengan mengatur factor-faktor lingkungan yang
meliputi factor biotic (makhluk hidup dan adanya asosiasi atau kehidupan bersama antar
mikroorganisme dapat dalam bentuk simbiose, sinergisme,abtibiose dan sintropisme) dan
abiotik (temperature,kelembapan, pH, radiasi,penghancuran secara mekanik).

1.2 Rumusan Masalah


a. Apa saja jenis metode yang digunakan untuk mengukur daya antimikroba?
b. Apa keunggulan dan kelemahan dari metode-metode yang digunakan untuk mengukur
daya antimikroba?
2

c.
d.
e.
f.
g.

Termasuk metode apa uji aktivitas antibakteri yang dilakukan?


Bagaimana mekanisme kerja antibiotic yang digunakan dalam pengujian?
Bagaimana prinsip terbentuknya zona hambat?
Apa pengaruh konsentrasi dan jenis bakteri uji terhadap zona hambat yang terbentuk?
Bagaimana evaluasi akhir uji potensi antibiotik?

1.3 Tujuan
Tujuan penulisan laporan praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mengetahui:
a. Berbagai jenis metode yang digunakan untuk mengukur daya antimikroba.
b. Keunggulan dan kelemahan dari metode-metode yang digunakan untuk mengukur daya
c.
d.
e.
f.
g.

antimikroba.
Termasuk metode apa uji aktivitas antibakteri yang dilakukan.
Mekanisme kerja antibiotik yang digunakan dalam pengujian.
Prinsip terbentuknya zona hambat.
Pengaruh konsentrasi dan jenis bakteri uji terhadap zona hambat yang terbentuk.
Evaluasi akhir uji potensi antibiotik

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Sensitifitas menyatakan bahwa uji sentifitas bakteri merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri dan untuk mengetahui senyawa
murni yang memiliki aktivitas antibakteri. Metode Uji sensitivitas bakteri adalah metode cara
bagaimana mengetahui dan mendapatkan produk alam yang berpotensi sebagai bahan anti bakteri
serta mempunyai kemampuan untuk menghambat pertumbuhan atau mematikan bakteri pada
konsentrasi yang rendah. uji sentivitas bakteri merupakan suatu metode untuk menentukan
tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri dan untuk mengetahui senyawa murni yang
memiliki aktivitas antibakteri.
Antibiotik digunakan untuk membasmi mikroba penyebab terjadinya infeksi. Gejala
infeksi terjadi akibat gangguan langsung oleh mikroba dan berbagai zat toksik yang dihasilkan
mikroba. Pada dasarnya suatu infeksi dapat ditangani oleh sistem pertahanan tubuh, namun
adakalanya sistem ini perlu ditunjang oleh penggunaan antibiotik. Antibiotik yang digunakan
untuk membasni mikroba penyebab infeksi pada manusia, harus memiliki sifat toksisitas selektif.
Artinya antibiotik harus bersifat toksik untuk mikroba, tetapi relatif tidak toksik untuk hospes.
Toksisitas selektif tergantung kepada struktur yang dimiliki sel bakteri dan manusia misalnya
dinding sel bakteri yang tidak dimiliki oleh sel manusia, sehingga antibiotik dengan mekanisme
kegiatan pada dinding sel bakteri mempunyai toksisitas selektif relatif tinggi (Ganiswarna, 1995).
Sensitivitas bakteri terhadap antibiotik tergantung kapada kemampuan antibiotik tersebut untuk
menembus dinding sel bakteri. Antibiotik lebih banyak yang efektif bekerja terhadap bakteri
Gram positif karena permeabilitas dinding selnya lebih tinggi dibandingkan bakteri Gram negatif.
Jadi suatu antibiotik dikatakan mempunyai spektrum sempit apabila mampu menghambat
pertumbuhan bakteri Gram positif, sedangkan antibiotik berspektrum luas jika pertumbuhan
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dihambat oleh antibiotik tersebut (Sumadio,
dkk. 1994).
Berdasarkan sasaran tindakan antibiotik terhadap mikroba maka antibiotik dapat
dikelompokkan menjadi lima golongan yaitu antibiotik penghambat sintesis dinding sel mikroba,
antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah penisilin, sefalosporin, basitrasin, dan vankomisin.
4

Yang kedua yaitu antibiotik penghambat sintesis protein sel mikroba, antibiotik yang termasuk
kelompok ini ialah golongan aminoglikosida, makrolida, kloramfenikol, linkomisin dan tetrasilin.
Yang ketiga yaitu antibiotik penghambat sintesis asam nukleat sel mikroba, antibiotik yang
termasuk kelompok ini ialah rifampisin dan golongan kuinolon. Keempat yaitu antibiotik
pengganggu fungsi membran sel mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah golongan
polien. Dan yang kelima yaitu antibiotik penghambat metabolisme mikroba, antibiotik yang
termasuk kelompok ini ialah sulfonamida, trimetoprin dan asam p-amino salisilat (Ganiswarna,
1995).
2.1 Metode uji aktivitas antimikroba
a. Metode Difusi Cakram
Cara yang mudah untuk menetapkan kerentanan organisme terhadap antibiotik
adalah dengan menginokulasi pelat agar dengan biakan dan membiarkan antibiotik
terdifusi ke media agar. Cakram yang telah mengandung antibiotik diletakkan di
permukaan pelat agar yang mengandung organisme yang diuji. Pada jarak tertentu pada
masing-masing cakram, antibiotik terdifusi sampai titik antibiotik tersebut tidak lagi
menghambat pertumbuhan mikroba. Efektivitas antibiotik ditunjukkan oleh zona
hambatan. Zona hambatan terlihat sebagai area jernih atau bersih mengelilingi cakram
tempat zat dengan aktivitas antimikroba terdifusi. Diameter zona dapat diukur dengan
penggaris. Ukuran zona hambatan dapat dipengaruhi oleh kepadatan media biakan,
kecepatan difusi antibiotik, konsentrasi antibiotik pada cakram filter, sensitivitas
organisme terhadap antibiotik, dan interaksi antibiotik terhadap media.suatu zat yang
mempunyai efek samping signifikan tidak boleh digunakan.
b. Metode Sumuran
Pada metode ini, sumuran dibuat pada agar di cawan petri dengan dibagi tiga garis
yang sama sesuai dengan kebutuhan. Kemudian diinjeksi dengan ekstrak yang akan
diuji ke dalamnya. Setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam, pertumbuhan bekteri
diamati untuk melihat ada tidaknya zona hembatan disekeliling lubang.

2.2 Bakteri Escherichia coli


5

E.coli berbentuk batang pendek (cocobasil), Gram negatif, ukuran sel E.coli
memiliki panjang sekitar 0,4 sampai 0,7 m dan lebar 1,4 m, beberapa strain
mempunyai kapsul, motil, anaerob fakultatif (Lucky, dkk, 1993). E.coli tumbuh pada
suhu antara 10oC sampai 40oC, dengan suhu optimum 37oC. pH optimum untuk
pertumbuhannya adalah 7,0 sampai 7,5; pH minimum pada 4,0 dan maksimum pada
pH 9,0 (Supardi dan Sukamto, 1999).
2.3 Antibakteri atau Antimikroba
Antibakteri atau antimikroba adalah bahan yang dapat membunuh atau
menghambat aktivitas mikroorganisme dengan bermacam-macam cara. Senyawa
antimikroba terdiri atas beberapa kelompok berdasarkan mekanisme daya kerjanya atau
tujuan penggunaannya. Bahan antimikroba dapat secara fisik atau kimia dan berdasarkan
peruntukannya dapat berupa desinfektan, antiseptic, sterilizer, sanitizer dan sebagainya
(Lutfi 2004).
Daun cengkeh mengandung minyak atsiri yang komponen utamanya yaitu
eugenol. Selain eugenol, juga mengandung berbagai bahan lainnya yang jumlahnya relatif
sedikit, misalnya eugenol asetat, methil amil keton, kariofilen, furfurol, dan vanillin.
Bahan-bahan tersebut hampir semuanya tergolong dalam golongan fenol yang pada
dasarnya mempunyai sifat antibakteri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa minyak
cengkeh dengan konsentrasi 1:1, 1:2 dan 1:3 mampu menghambat bakteri Gram Positif
(B.cereus dan S.aureus) dan Gram Negatif (E.coli dan Shigella sp), daya hambat minyak
cengkeh terhadap bakteri semakin besar dengan semakin tingginya konsentrasi.
Minyak Sereh, komponen kimia dalam minyak sereh wangi cukup kompleks, namun
komponen yang terpenting adalah sitronellal dan geraniol. Senyawa-senyawa tersebut
memiliki aktivitas antibakteri.
Pengujian sensitivitas bahan alam seperti minyak dari tumbuhan ini digunakan
hanya untuk menguji potensinya saja. Indu et al. (2006) menyatakan bahwa pada filter
paper method, jika diameter zona hambat kurang dari 12 mm maka senyawa tersebut
tidak memiliki aktivitas antibakteri (resisten); jika diameternya 12-16 mm, maka termasuk
intermediet dan jika diameter zona hambatnya lebih dari 16 mm, maka senyawa tersebut
termasuk sensitif.
6

3.2.1 Antimikroba (Escherchia coli) Menggunakan Metode Paper Filter Disk


1. Cengkeh (Syzygium aromaticum atau Eugenia caryophyllata)

(Mith, 2014)
Berdasarkan penelitian oleh Mith (2004), Eugenilla caryophyllus memiliki
sifat antimikroba terhadap Escherchia coli yang menghasilkan zona hambat 14,6 mm.
2. Sereh (Serai) (Cymbopogon citratus)
Berdasarkan penelitian oleh Farias (2012), Cymbopogon citrates memiliki
sifat antimikroba terhadap Escherchia coli yang menghasilkan zona hambat 5,6
mm

(Farias, 2012)
3. Gentamicin 10g
Berdasarkan penelitian oleh Sara Jelodarian (2012), Gentamicin memiliki
sifat antimikroba terhadap Escherchia coli yang menghasilkan zona hambat 20
mm.

(Sara Jelodarian, 2012)


4. Kloramfenikol 30g
Berdasarkan penelitian oleh Mith (2004), kloramfenikol memiliki sifat
antimikroba terhadap Escherchia coli yang menghasilkan zona hambat 22,3 mm.

(Mith, 2014)
3.2.2

Antimikroba (Escherchia coli) Menggunakan Metode Sumuran


1. Cengkeh

(Taufik)
Hasilnya menunjukkan bahwa cengkeh dapat membentuk zona hambat
bakteri Escherchia coli dengan metode sumuran yaitu sepanjang 22,78 mm.
2. Sereh (Serai)
Hasil uji daya hambat minyak atsiri terhadap pertumbuhan bakteri E. Coli
menunjukkan bahwa minyak atsiri sereh Cymbopogon citratus DC. Semakin tinggi
konsentrasi minyak atsiri maka semakin besar pula zona bening yang terbentuk di
sekitar sumuran.

Hasil pengukuran diameter zona hambat terhadap bakteri Escherichia coli


dengan masa inkubasi 24 jam dan 48 jam (Hasriani Rahman, 2013). Hasilnya
menunjukkan bahwa serai dapat membentuk zona hambat bakteri Escherchia coli
dengan metode sumuran yaitu sepanjang 18,35 mm.
3.2.3 Kriteria Sensitive Tidaknya Suatu Antimikroba terhadap E. coli (Dinesh
Kumar, 2014).

10

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Alat dan Bahan
Alat:
Tabung reaksi
Media mueller hinton (MH)
Mikropipet
yellow tip
Bunsen
Jangka sorong
Swan
Ose mata bulat
Cork borer steril
Bahan:

Suspensi / NaCl
Minyak cengkeh
Minyak sereh
Kontrol negatif : Aquadest steril
Bakteri : E.coli dan Staphyllococcus aureus

3.2. Cara Kerja


3.2.1. Pembuatan media agar
Cairkan media MH steril yang ada di tabung reaksi

Tuang ke cawan petri secara aseptis

Tunggu hingga media beku

Ose dipanaskan

11

Bakteri E.coli diambil dari tabung biakan dan diletakkan di NaCl.

Tabung berisi bakteri E.coli di vortex selama 5 menit

Membandingkan hasil suspensi dengan suspensi standar

3.2.2. Pembuatan media dengan metode sumuran


Membagi media agar menjadi 3 bagian dengan tanda A untuk Aquadest
steril(control), C untuk minyak cengkeh dan S untuk minyak Sereh

Menswap bakteri pada media agar dengan memasukkan cotton swap


ke tabung reaksi berisi suspensi bakteri E.coli secara merata

Pada 3 bagian bertanda A, S, dan C dibuat 1 sumuran dengan cork


borer steril

12

Ambil 10 mikroliter minyak cengkeh, 10 mikroliter minyak sereh dan


10 mikroliter aqudest steril dengan mikropipet yellow tip dan
dimasukkan ke lubang pada media agar yang telah diberi tanda.
Lakukan di kedua media berisi bakteri E.coli

Inkubasi pada 37 derajat celcius selama 24 jam

3.2.3. Analisis data


Data berupa diameter hambat pada setiap sampel dan larutan baku
standar diukur dengan jangka sorong

Dilakukan berdasarkan uji aktivitas antibakteri dan uji potensi


antibiotik

13

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
4.1.1
Pembuatan Suspensi Bakteri
Cara pengerjaan :
Siapkan 2 kawat ose, 2 bunsen, 2 tabung reaksi berisi NaCl, 2 media agar
miring berisi biakan bakteri Escherichia coli dan Staphyllococcus aureus.

Menghidupkan kedua bunsen dan mensterilisasikan kedua kawat ose dengan


memanaskannya, lalu didinginkan.

Membuka tutup tabung reaksi yang berisi media agar yang terdapat
bakteri Escherichia coli, memanaskan ujung tabungnya.

Mengambil biakan bakteri Escherichia coli pada media agar miring dengan
cara menggoreskan kawat ose yang telah dingin ke media agar yang berisi
bakteri tersebut.

Memanaskan mulut tabung kemudian menutupnya kembali.


Mengambil 1 tabung yang berisi larutan NaCl, lalu memanaskan mulut
tabungnya.
Mencelupkan kawat ose yang sudah digoreskan pada media agar miring
bakteri Escherichia coli ke larutan NaCl, lalu memanaskan mulut tabungnya
dan menutupnya kembali.
14

Memvortex tabung yang berisi suspensi bakteri tersebut selama 5 menit, lalu
membandingkan kekeruhannya dengan suspensi standarnya.

Melakukan hal yang sama untuk bakteri Staphyllococcus aureus.


4.1.2

Pembuatan metode sumuran


Cara pengerjaan :
Siapkan 2 cotton swap, mikropipet, 2 media agar cawan, minyak cengkeh,
minyak sereh, dan control negatif berupa aqua steril.

Memanaskan mulut tabung yang berisi suspensi bakteri Escherichia coli.

Mencelupkan cotton swap ke dalam suspensi bakteri , lalu mengoleskan


secara merata ke seluruh bagian agar cawan.

15

Membuat garis pembagi pada cawan, dibagi menjadi 3 bagian, lalu memberi
tanda pada masing-masing bagiannya sesuai antibakteri yang akan diberikan.

Membuat 3 sumuran pada media agar cawan tersebut menggunakan cork


borer steril.

Memipet larutan minyak cengkeh, minyak sereh dan aqua steril sebanyak
10l menggunakan mikropipet.

Memasukan larutan antibakteri (minyak cengkeh, minyak sereh) dan aqua


steril ke dalam sumuran yang sesuai dengan pada bagian yang sudah diberi
tanda.

Menginkubasi media cawan tersebut selama 24 jam dalam suhu 37C.


16

4.1.3 Pertumbuhan bakteri setelah inkubasi 24 jam


a. Metode
: Sumuran
Bakteri
: Escherichia coli
Antibakteri
: Cengkeh, Sereh, Kloramfenikol dan Gentamian
Kontrol negative
: Aquadest steril
Hasil
:
Cengkeh
: 2,7 cm
Sereh
: 1,5 cm
Kloramfenikol : 3 cm (C30)
Gentamian
: 1,2 cm (CN10)
Aquadest
: 1,1 cm
Kesimpulan
: Antibakteri yang paling efektif terhadap bakteri
Escherichia coli adalah kloramfenikol karena bagian yang
tidak ditumbuhi oleh bakteri memiliki diameter lebih besar
dibandingkan

pada

bagian

minyak

sereh,

cengkeh,

gentamian dan aquadest steril.

b. Metode

: Paper Filter Disk

Bakteri

: Escherichia coli

Antibakteri

: Sereh dan Cengkeh

Hasil

Sereh
: 0,90 cm
Cengkeh
: 1,25 cm
Kesimpulan
: Antibakteri yang paling efektif terhadap bakteri
Escherichia coli adalah minyak cengkeh, karena bagian yang
tidak ditumbuhi oleh bakteri memiliki diameter lebih besar
dibandingkan sereh.

17

c. Metode

: TLC Bioautography

Bakteri

: Escherichia coli

Antibakteri

: Sereh dan Metanol

Hasil

Sereh
: 0,5 cm
Metanol
: 0,7 cm
Kesimpulan
: Antibakteri yang paling efektif terhadap bakteri
Escherichia coli adalah metanol, karena bagian yang tidak
ditumbuhi oleh bakteri memiliki diameter lebih besar
dibandingkan pada bagian sereh.

4.2 Pembahasan
4.2.1 Macammacam metode uji antimikroba antara lain sebagai berikut:
1. Metode Penyebaran/Difusi (Diffusion Methods)
Prinsip metode difusi uji potensi berdasarkan pengamatan luas daerah
hambatan pertumbuhan bakteri karena berdifusinya antibakteri dari titik awal
pemberian kedaerah difusi. Metode difusi-agar cakram kertas merupakan
teknik yang paling sering digunakan untuk menentukan kepekaan bahan
antimikroba sampai senyawa kemoterapi. Dalam metode ini, ada beberapa
cara yaitu cara Kirby Bauer, sumuran dan pour plate.
a. Metode Kirby-Bauer
Metode ini digunakan untuk menentukan aktivitas agen antimikroba.
Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah
ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area
18

jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh


agen antimikroba pada permukaan media agar.
Cara kerja pengujian antimikroba dengan metode Kirby-Bauer :
1. Tanam mikroba dalam media agar padat yang sesuai. Celupkan cotton bud
(cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung
agar air tiris. Bakteri ditumbuhkan pada media agar miring dan diinkubasi
pada suhu 370C. Kemudian pembuatan suspensi bakteri dengan
menumbuhkan bakteri pada media cair Natrium Klorida fisiologis dan
diinkubasi pada suhu 370C.
2. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara
merata. Biarkan cawan selama 5 menit.

3. Kertas cakram dicelupkan dalam larutan obat herbal dengan konsentrasi


tertentu. Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas
cakram pada permukaan agar. Kertas cakram ditekan menggunakan pinset
supaya menempel sempurna di permukaan agar.

4. Inkubasi pada suhu 36- 37 0C selama 24-48 jam.

19


5. Aktivitas antimikroba dilihat dengan mengukur daerah di sekitar cakram,
lubang, atau cangkir agar yang tidak ditumbuhi miroba.

6. Ukur diameter zona hambat (mm) dengan jangka sorong, kemudian


bandingkan dengan tabel sensitivitas antibiotik. Makin besar diameter
hambatan pertumbuhan tersebut berarti aktivitas bahan yang diuji (obat
herbal) terhadap mikroba makin baik.
Metode Kirby-Bauer tidak bisa digunakan untuk mengukur derajat
antimikroba suatu zat sehingga metode ini tidak menjamin diidentifikasinya
20

bahan pembunuh antimikroba yang efektif untuk terapi (bakterisida atau


fungisida). Hal ini disebabkan adanya perbedaan kecepatan difusi dari
senyawa antimikroba yang dipengaruhi berat molekulnya. Ukuran zona untuk
suatu zat dapat dibandingkan dengan standar, asal perbenihan, ukuran
inokulum, dan keadaan lain diatur secara seksama. Hal ini memungkinkan
ditetapkannya suatu diameter zona penghambat minimum yang menunjukkan
kepekaan dari suatu zat antimikroba. Pada pengukuran standar seperti
konsentrasi antimikroba berkorelasi dengan diameter zona hambat sehingga
bisa digunakan untuk menentukan tingkat kepekaan, yaitu peka (sensitive,
susceptible), cukup peka (moderately sensitive, intermediate), dan resisten
(resistant.) Nilai kadar hambat minimum (KHM) berbanding terbalik secara
proporsional (linear) dengan diameter zona hambat (Bauer et al., 1966).
b. Metode E- test
Black (2004) mengemukakan adanya versi terbaru metode difusi yang
disebut E-test (Epsilo Test). Pada E-test digunakan strip plastik yang
mengandung gradien konsentrasi antibiotik. Pada strip tercetak nilai
konsentrasi yang memungkinkan secara langsung membaca konsentrasi
minimum yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan. Titik dimana
mulai terjadi hambatan pertumbuhan menunjukkan kadar hambat minimum
(KHM) untuk obat herbal yang memliki potensi antibiotik yang diujikan.

Gambar 1. Cawan Petri dan kertas reagan metode E-Test


Jamur yang bertipe koloni ragi atau tidak berfilamen (yeast-like
growth, non-mycelial growth) biasanya ditanam secara usapan atau gorescoret (agar surface streak). Penanaman jamur berfilamen yang tumbuh tidak
merata pada media menggunakan teknik gores silang.
c. Metode Ditch plate technique
21

Pada metode ini sampel uji berupa agen antmikroba (obat herbal) yang
diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong pada media agar
dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji
(maksimum 6 macam) digoreskan kearah parit yang berisi agen antimikroba.
d. Metode Cup plate technique (Metode sumuran)
Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, di mana dibuat sumur
pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur
tersebut diberi agen antimikroba (obat herbal) yang akan diuji.
e. Metode Gradient plate technique
Pada metode ini kosentrasi agen antimikroba pada media agar secara
teoritis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan
uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan di
letakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya ditung di atasnya.
Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba
berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba uji (maksimal 6 macam)
digoreskan pada arah mulai dari kosentrasi tinggi ke rendah.

2. Metode Pengenceran/Dilusi (Dilution Methods)


Metode pengenceran/dilusi dapat digunakan untuk menguji beberapa zat
antimikroba secara simultan, tetapi memakan waktu dan mahal. Metode ini
memungkinkan dilakukannya uji kedua untuk menilai daya antimikroba suatu zat.
Kegunaan dari metode dilusi ini adalah untuk mencari KHM (Kadar Hambat
Minimum) yaitu kadar obat terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
Kadar terkecil yang menunjukkan hambatan terhadap pertumbuhan bakteri ditandai
oleh kejernihan media merupakan KHM. Data sifat kimia fisika dan data aktivitas
antibakteri (KHM) dianalisis secara statistik dengan uji regresi liner dan non
linier .Uji ini mampu dengan tepat mengukur konsentrasi antimikroba yang
diperlukan untuk menghambat pertumbuhan suatu inokulum terstandarisasi di
bawah kondisi yang ditentukan.
Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu :
a. Metode dilusi cair (broth dilution) test (serial dilution)

22

Metode ini mengukur MIC (minimum inhibitory concentration atau kadar


hambat minimum, KHM) dan MBC (minimum bactericidal concentration atau
kadar bunuh minimum, KBM).
Cara kerja metode dilusi cair:
1. Dibuat seri pengenceran agen antimikroba (obat herbal) pada medium cair
yang di tambahkan dengan mikroba uji. Cara pengenceran dilakukan dalam
tabung dengan mengencerkan bahan uji (obat herbal) dengan media cair
menjadi kelipatan dua secara bertahap sehingga didapatkan konsentrasi
dengan kelipatan setengahnya.
2. Inokulasi dengan suspensi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam pada
temperatur 36-37oC dan kemudian diamati hambatan pertumbuhan mikroba
dengan membandingkan kekeruhan atau pertumbuhannya dengan kontrol
yang mengandung media.
3. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa
adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM.
4. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang
pada media cair tanpa penambahan pada mikroba uji ataupun agen
antimikroba, dan diinkubasi selama 1824 jam.
5. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM
b. Metode dilusi padat (solid dilution test)
Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan
media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu kosentrasi agen
antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.
Pengujian terhadap jamur menggunakan media cair kurang bagus karena
sebagian besar jamur tidak tumbuh dan terdispersi dengan baik kecuali beberapa
jamur dengan pertumbuhan seperti ragi (yeast-like growth). Jamur yang tumbuh
seperti ragi antara lain Candida spp. (Bauer et al., 1966).
c. Metode Bioautografi (Bioautography Methods) (Hostettmann, 1991)
Metode ini sangat berguna untuk mengetahui senyawa baru atau
senyawa yang belum diketahui aktivitas antimikrobanya. Bioautografi kontak
menggunakan prinsip difusi senyawa yang terpisah dengan Kromatografi Lapis
Tipis (KLT) atau Kromatografi Kertas (KK). Lempeng kromatografi
23

ditempatkan pada permukaan agar yang telah diinokulasi dengan mikroba.


Setelah kira-kira 30 menit, lempeng dipindahkan, diinkubasi dan diamati,
senyawa antimikroba akan berdifusi ke dalam lapisan agar dan menghambat
pertumbuhan mikroba. Pada bioautografi langsung, zona hambatan diamati
secara langsung pada lempeng kromatografi yang sebelumnya telah disemprot
dengan suatu suspensi mikroba dalam media agar cair dan diinkubasi pada
temperatur dan waktu yang sesuai. Sedangkan metode bioautografi pencelupan
dilakukan dengan mencelupkan lempeng kromatografi ke dalam media dan
media dibiarkan mengeras. Lempeng kromatografi kemudian diinkubasi dan
daerah hambatannya diamati.
d. Metode metode lain
Metode-metode lain yang dapat digunakan terutama untuk menentukan
efektivitas senyawa kemoterapi yaitu:
a. Metode daya bunuh serum (serum killing power method)
Pada metode daya bunuh serum digunakan sampel darah pasien yang
sedang menerima terapi antibiotik. Suspensi mikroba (bakteri) kemudian
ditambahkan pada serum pasien. Pertumbuhan (turbiditas) dalam serum
setelah inkubasi mengartikan bahwa antibiotik yang diberikan tidak efektif.
b. Metode otomatis (automated method).
Metode otomatis menggunakan sistem otomatis (instrumen) yang dapat
mengidentifikasi mikroorganisme dan menentukan kepekaannya terhadap
berbagai senyawa antimikroba.
e. Metode Gores Silang (Uji Antifungi)
Metode gores silang (Cross Scratching Method) merupakan metode baku
untuk menguji aktivitas penghambatan suatu bahan uji terhadap jamur T.
mentagrophytes (Anonim, 1993).
Cara kerja metode gores silang:
1. Dicelupkan kertas saring ke dalam larutan yang diuji lalu diletakkan di atas
lempeng agar yang telah digores dengan inokulum jamur.
2. Media agar kemudian diinkubasi selama 3-7 hari pada 24-25 oC.
3. Pertumbuhan jamur diamati, jarak yang tidak ditumbuhi jamur diukur sebagai
zona hambat.
4. Cara yang sama juga dilakukan pada waktu yang bersamaan untuk antijamur
pembanding.
4.2.2 Kelebihan dan Kelemahan Setiap Metode
a. Metode Sumuran
Kelebihan
:
Mudah untuk dilakukan
Tidak memerlukan peralatan khusus
24

Relatif murah
apat diaplikasikan pada mikroorganisme yangpertumbuhannya lambat
dan mikroorganisme yang bersifat anaerob obliga

Kekurangan

Membutuhkan waktu yang lama karena dilakukan inkubasi 24 jam


ukuran zona bening yang terbentuk tergantung oleh kondisi inkubasi,
inokulum, predifusi dan preinkubasi serta ketebalan medium

b. Metode TLC
Kelebihan
:
Mudah dilakukan
Hanya membutuhkan peralatan Sederhana
Interpretasi hasilnya relatif lebih mudah dan akurat
Dapat digunakan untuk mengetahui aktifitas biologi dan antibakteri
Kekurangan

Membutuhkan waktu yang lama


Kurang efisien
Harus digunakan pembanding deteksi seperti blank disc

c. Metode Paper disc Blank


Kelebihan

Mudah untuk dilakukan


Relatif murah

Kekurangan

Relatif sulit untuk diinterpretasikan


Membutuhkan waktu yang lama

4.2.3 Metode yang Digunakan dalam Uji Aktivitas Antimikroba


a. Metode lubang/sumuran yaitu membuat lubang pada agar padat yang telah
diinokulasi dengan bakteri. Jumlah dan letak lubang disesuaikan dengan tujuan
penelitian, kemudian lubang diinjeksikan dengan ekstrak yang akan diuji.
Setelah dilakukan inkubasi, pertumbuhan bakteri diamati untuk melihat ada
tidaknya daerah hambatan di sekeliling lubang.
25

b. Metode difusi cakram ( paper disk ) prinsip kerjanya adalah bahan uji
dijenuhkan ke dalam kertas cakram (cakram kertas). Cakram kertas yang
mengandung bahan tertentu ditanam pada media perbenihan agar padat yang
telah dicampur dengan mikroba yang diuji, kemudian diinkubasikan 370C
selama 24 jam. Area (zona) jernih disekitar cakram kertas diamati untuk
menunjukkan ada tidaknya pertumbuhan mikroba.
c. Metode TLC Bioautography merupakan metode spesifik untuk mendeteksi
bercak pada kromatogram hasil KLT ( kromatografi lapis tipis ) yang memiliki
aktifitas antibakteri, antifungi dan antivirus, sehingga mendekatkan metode
separasi

dengan

uji

biologis.

Metode

dengan

menggunakan

TLC

Bioautography, langkah awal yang dilakukan ialah dengan menginokulasikan


bakteri pada lempeng agar secara merata, kemudian meletakkan 1 lempeng
KLT dengan posisi terbalik diatas media yang sudah diberi media uji (lempeng
agar yang telah diinokulasi bakteri). Minyak yang digunakan adalah minyak
sereh dan minyak cengkeh. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24
jam. Jika setelah diinkubasi pada KLT terbentuk zona bening disekitar piper
disk. Ini menunjukan bahwa anti mikroba yang digunakan berpotensi
menghambat pertumbuhan bakteri dan juga dapat menunjukkan sensitivitas
suatu bakteri terhadap antimikroba yang digunakan. Semakin besar
diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya dan semakin tinggi
tingkat kepekaan antimikroba tersebut terhadap mikroba.
4.2.4 Mekanisme Kerja Antibiotik yang Digunakan dalam Pengujian
Sensitifitas menyatakan bahwa uji sentifitas bakteri merupakan suatu
metode untuk menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri
dan untuk mengetahui senyawa murni yang memiliki aktivitas antibakteri.
Metode Uji sensitivitas bakteri adalah metode cara bagaimana mengetahui dan
mendapatkan produk alam yang berpotensi sebagai bahan anti bakteri serta
mempunyai kemampuan untuk menghambat pertumbuhan atau mematikan
bakteri pada konsentrasi yang rendah. uji sentivitas bakteri merupakan suatu
metode untuk menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri
dan untuk mengetahui senyawa murni yang memiliki aktivitas antibakteri.
Seorang ilmuan dari perancis menyatakan bahwa metode difusi agar dari
prosedur Kirby-Bauer, sering digunakan untuk mengetahui sensitivitas bakteri.
26

Prinsip dari metode ini adalah penghambatan terhadap pertumbuhan


mikroorganisme, yaitu zona hambatan akan terlihat sebagai daerah jernih di
sekitar cakram kertas yang mengandung zat antibakteri. Diameter zona
hambatan pertumbuhan bakteri menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap zat
antibakteri.Selanjutnya dikatakan bahwa semakin lebar diameter zona hambatan
yang terbentuk bakteri tersebut semakin sensitif
Pada umumnya metode yang dipergunakan dalam uji sensitivitas
bakteri adalah metode Difusi Agar yaitu dengan cara mengamati daya hambat
pertumbuhan mikroorganisme oleh ekstrak yang diketahui dari daerah di sekitar
kertas cakram (paper disk) yang tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme. Zona
hambatan pertumbuhan inilah yang menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap
bahan anti bakteri
Tujuan dari proses uji sensisitivitas ini adalah untuk mengetahui obatobat yang paling cocok (paling poten) untuk kuman penyebab penyakit terutama
pada kasus-kasus penyakit yang kronis dan untuk mengetahui adanya resistensi
terhadap berbagai macam antibiotik. Penyebab kuman resisten terhadap
antibiotik yakni memang kuman tersebut resisten terhadap antibiotik yang
diberikan, akibat pemberian dosis dibawah dosis pengobatan dan akibat
penghentian obat sebelum kuman tersebut betul-betul terbunuh oleh antibiotic
Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri yang
memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman-kuman
sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Para peneliti diseluruh dunia
memperoleh banyak zat lain dengan khasiat antibiotik namun berhubung dengan
adanya sifat toksis bagi manusia, hanya sebagian kecil saja yang dapat
digunakan sebagai obat diantaranya adalah streptomycin vial injeksi, Tetrasiklin
kapsul, Kanamicin kapsul, Erytromicin kapsul, Colistin tablet, Cefadroxil tablet
dan Rifampisin kapsul .
Kegiatan antibiotika untuk pertama kalinya ditemukan oleh sarjana
Inggris dr. Alexander Flemming pada tahun 1928 (penisilin). Penemuan ini baru
dikembangkan dan dipergunakan dalam terapi di tahun 1941 oleh dr.Florey
(Oxford) yang kemudian banyak zat lain dengan khasiat antibiotik diisolir oleh
penyelidik-penyelidik di seluruh dunia, akan tetapi berhubung dengan sifat
toksisnya hanya beberapa saja yang dapat digunakan sebagai obat
27

Antibiotik digunakan untuk membasmi mikroba penyebab terjadinya


infeksi.Gejala infeksi terjadi akibat gangguan langsung oleh mikroba dan
berbagai zat toksik yang dihasilkan mikroba.Pada dasarnya suatu infeksi dapat
ditangani oleh sistem pertahanan tubuh, namun adakalanya sistem ini perlu
ditunjang oleh penggunaan antibiotik.Antibiotik yang digunakan untuk
membasni mikroba penyebab infeksi pada manusia, harus memiliki sifat
toksisitas selektif.Artinya antibiotik harus bersifat toksik untuk mikroba, tetapi
relatif tidak toksik untuk hospes.Toksisitas selektif tergantung kepada struktur
yang dimiliki sel bakteri dan manusia misalnya dinding sel bakteri yang tidak
dimiliki oleh sel manusia, sehingga antibiotik dengan mekanisme kegiatan pada
dinding sel bakteri mempunyai toksisitas selektif relatif tinggi
Sensitivitas bakteri terhadap antibiotik tergantung kapada kemampuan
antibiotik tersebut untuk menembus dinding sel bakteri.Antibiotik lebih banyak
yang efektif bekerja terhadap bakteri Gram positif karena permeabilitas dinding
selnya lebih tinggi dibandingkan bakteri Gram negatif.Jadi suatu antibiotik
dikatakan

mempunyai

spektrum

sempit

apabila

mampu

menghambat

pertumbuhan bakteri Gram positif, sedangkan antibiotik berspektrum luas jika


pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dihambat oleh
antibiotik tersebut
Berdasarkan sasaran tindakan antibiotik terhadap mikroba maka
antibiotik dapat dikelompokkan menjadi lima golongan yaitu antibiotik
penghambat sintesis dinding sel mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini
ialah penisilin, sefalosporin, basitrasin, dan vankomisin. Yang kedua yaitu
antibiotik penghambat sintesis protein sel mikroba, antibiotik yang termasuk
kelompok ini ialah golongan aminoglikosida, makrolida, kloramfenikol,
linkomisin dan tetrasilin.Yang ketiga yaitu antibiotik penghambat sintesis asam
nukleat sel mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah rifampisin dan
golongan kuinolon.Keempat yaitu antibiotik pengganggu fungsi membran sel
mikroba, antibiotik yang termasuk kelompok ini ialah golongan polien.Dan yang
kelima yaitu antibiotik penghambat metabolisme mikroba, antibiotik yang
termasuk kelompok ini ialah sulfonamida, trimetoprin dan asam p-amino
salisilat

28

Zona

Hambat

merupakan

tempat

dimana

bakteri

terhamabat

pertumbuhannya akibat antibakteri atau antimikroba.Zona hambat adalah daerah


untuk menghambat pertumbuhan mikroorrganisme pada media agar oleh
antibiotik. Contohnya: tetracycline, erytromycin, dan streptomycin. Tetracycline
merupakan antibiotik yang memiliki spektrum yang luas sehingga dapat
menghambat pertumbuhan bakteri secara luas (Pelczar, 1986).Cara pengujian
resistensi mikroba terhadap suatu jenis antibiotik dapat dilakukan dengan uji
resistensi.Teknik ini menggunakan zat kimia untuk mengurangi dan membunuh
mikroorganisme, terutama mikroba yang patogen.Metode yang biasa dipakai
adalah metode Metode Kirby-Bauer yang merupakan cara untuk menentukan
sensitifitas antibiotik untuk bakteri. Sensitifitas suatu bakteri terhadap antibiotik
ditentukan oleh diameter zona hambat terbentuk.Semakin besar diameternya
maka semakin terhambat pertumbuhannya.
Faktor-faktor yang berpengaruh pada metode Kirby-Bauer adalah:
a. Ketebalan media agar
Dapat mempengaruhi penyebaran dan difusi antibiotik yang digunakan.
b. Umur bakteri
Bakteri yang berumur tua (fase stationer) tidak efektif untuk diuji karena
mendekati kematian dan tidak terjadi pertumbuhan lagi sehingga yang
dipakai bekteri berumur sedang (fase eksponential) karena aktivitas
metabolitnya tinggi, pertumbuhan cepat sehingga lebih peka terhadapa daya
kerja obat dan hasilnya lebih akurat.
c. Waktu inkubasi
Waktu yang cukup supaya bakteri dapat berkembang biak dengan optimal
dan cepat. Waktunya minimal 16 jam.
d. pH, temperature
Bakteri memiliki pH dan temperature optimal untuk tumbuh yang berbedabeda sehingga sebaiknya dilakukan saat pH dan temperature yang optimal.
e. Konsentrasi antibiotik
Semakin besar konsentrasinya semakin besar diameter hambatannya..
f. Jenis antibiotik
Setiap bakteri memiliki respon yang berbeda-beda terhadap
antibiotiknya,

tergantung

sifat

antibiotik

tersebut

(berspektrum

luas/berspektrum sempit).
Bakteri dapat membentuk ketahanan khusus terhadap suatu jenis
antibiotika tertentu, sehingga membahayakan orang yang terkena penyakit
tersebut.Kesalahpahaman yang sering terjadi di masyarakat yaitu adanya
anggapan bahwa yang resisten terhadap obat tertentu ialah tubuh seseorang,
29

padahal sebenarnya bakteri yang ada di dalam tubuh itulah yang menjadi
resisten terhadap pengobatan, bukan tubuhnya.
Sedangkan antibiotic yang digunakan pada saat praktikum yaitu :
1. Antibiotik kloramfenikol terhadap aktifitas antimikroba
Kloramfenikol adalah antibiotik yang mempunyai aktifitas
bakteriostatik, dan pada dosis tinggi bersifat bakterisid. Aktivitas
antibakterinya dengan menghambat sintesa protein dengan jalan
mengikat ribosom subunit 50S, yang merupakan langkah penting dalam
pembentukan ikatan peptida. Kloramfenikol efektif terhadap bakteri
aerob gram-positif, termasuk Streptococcus pneumoniae, dan beberapa
bakteri aerob gram-negatif, termasuk Haemophilus influenzae, Neisseria
meningitidis, Salmonella, Proteus mirabilis, Pseudomonas mallei, Ps.
cepacia, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Brucella
dan Shigella.
Kloramfenikol bekerja dengan jalan menghambat sintesis protein
kuman. Yang dihambat adalah enzim peptidil transferase yang berperan
sebagai katalisator untuk membentuk ikatan-ikatan peptida pada proses
sintesis protein kuman.
Dengan memproduksi protein yang sangat penting untuk metabolisme,
mengganggu kemampuan sel untuk membuat protein bencana. bakteri
yang sangat rentan yang tewas langsung sementara yang lain hanya
diberikan tidak dapat membagi dan sistem kekebalan inang kemudian
menghancurkan mereka setelah diketahui. Kloramfenikol memiliki
spektrum luas terutama aktivitas terhadap bakteri aerobik banyak,
Mycoplasma, organisme klamidia, dan bakteri anaerob.
Kloramfenikol dapat diberikan secara oral atau topikal, biasanya tiga
kali sehari. Puncak aktivitas terjadi sekitar 30 menit setelah dosis oral
kecuali dalam sistem saraf dimana beberapa jam diperlukan untuk
penetrasi darah / penghalang otak.
Kloramfenikol adalah bakteriostatik (yaitu, berhenti pertumbuhan
bakteri). Ini adalah sintesis protein inhibitor , menghambat transferase
peptidil aktivitas bakteri ribosom , mengikat dan residu A2451 A2452 di
23S rRNA dari subunit ribosom 50S, mencegah pembentukan ikatan
peptida.Sementara kloramfenikol dan macrolide kelas antibiotik baik
30

berinteraksi dengan ribosom, kloramfenikol tidak macrolide sebuah.


Kloramfenikol langsung mengganggu pengikatan substrat, macrolides
hambatan sterik blok perkembangan dari peptida tumbuh
Ada tiga mekanisme ketahanan terhadap kloramfenikol: permeabilitas
membran dikurangi, mutasi subunit ribosom 50S dan elaborasi
asetiltransferase kloramfenikol. Sangat mudah untuk memilih untuk
permeabilitas membran dikurangi menjadi kloramfenikol in vitro dengan
bagian serial bakteri, dan ini adalah mekanisme yang paling umum
tingkat kloramfenikol perlawanan-rendah. Tingkat tinggi resistance
diberikan oleh gen-kucing; ini gen kode untuk sebuah enzim yang
disebut asetiltransferase kloramfenikol yang inactivates kloramfenikol
oleh kovalen menghubungkan satu atau dua asetil kelompok, yang
berasal dari-S-koenzim A asetil, ke hidroksil kelompok pada molekul
kloramfenikol . asetilasi ini mencegah kloramfenikol dari mengikat
ribosom. Perlawanan-berunding mutasi ribosom subunit 50S jarang.
2. Antibiotik Gentamisin terhadap Aktifitas Antimikroba
Gentamisin merupakan antibiotik turunan aminoglikosida yang
sangat berarti terutama karena peranannya terhadap mukosa gramnegatif. Senyawa ini digunakan pada pasien yang resisten

terhadap

antibiotik lain. Mekanisme kerja gentamicin adalah dengan mengikat


secara ireversibel sub unit 30S dari kuman, yaitu dengan menghambat
sintesis protein dan menyebabkan kesalahan translokasi kode genetik.
Gentamicin bersifat bakterisidal. Gentamicin efektif terhadap berbagai
strain

kuman.

Gramnegatiftermasukspesies Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Prot


eus dan Pseudomonas.

Terhadap

mikroorganisme

Gram-positif,

gentamicin efektif terhadap Staphylococcus aureus danStaphylococcus


epidermis.
Gentamisin tidak diserap pada pemberian oral, tetapi secara
cepat diserap setelah suntikan intramuskuler dengan kadar puncak yang
tercapai dalam waktu 0,5-1 jam. Waktu paruh plasmanya adalah 1-4 jam
pada orang dewasa, 2,3-3,3 jam pada neonatus, 1,5-2,5 jam pada bayi
diatas 20 bulan, dan 1 jam pada anak-anak yang lebih tua. Pada gangguan
31

fungsi ginjal yang lanjut, peningkatan ini dapat mencapai 35 jam.


Sejumlah kecil gentamicin diekskresi ke dalam empedu dan tidak ada
bukti adanya sirkulasi enterohepatik pada antibiotik ini. Gentamicin
menetap dalam jaringan untuk waktu yang lama. Gentamicin mengalami
reabsorbsi pada lumen tubulus proksimal dan kadarnya dalam jaringan
kortikal ginjal kadang-kadang mencapai 100 kali lebih tinggi ketimbang
kadarnya dalam serum. Anribiotika ini didistribus i secara luas keseluruh
tubuh, terutama ke dalam cairan ekstraseluler dengan volume distribusi
0,2 L/kg. Ikatan proteinya rendah yaitu berkisar antara 0-25 %. Ikatan
protein serum gentamicin maupun aminoglikosida lain meningkat dengan
meurunnya kadar magnesium dan kalisum.
Gentamicin yang masuk ke dalam cairan otak, kadarnya hanya
kecil sekali pada pasien dimana selaput otaknya tidak mengalami
peradangan, tetapi jika terjadi peradangan kadarnya dapat sedikit lebih
tinggi, meskipun demikian tidak cukup mencapai kadar terapi. Difusinya
kejaringan mata buruk Gentamisin disekresi ke dalam sekret bronkus
dengan kadar 25-50 % kadarnya dalam serum. Gentamicin menembus
plasenta dan mencapai kadar puncak dalam serum maternal. 10 %
gentamicin terikat dalam sel darah merah dan juga masuk ke dalam
leukosit polimorfonuklear dimana kadarnya dapat mencapai 80 % dari
kadar obat dalam cairan ekstraseluler. Kadar tertinggi ditemui dalam
jaringan ginjal.
2. Minyak Sereh
Sereh mengandung 0,4 % minyak atsiri. Minyak

atsiri dari

suatu tanaman secara umum mempunyai komposisi kimia tertentu yang


pada prinsipnya memberikan aktivitas antimikroba yang spesifik
khususnya untuk E. coli dan Staphylococcus aureus. Berdasarkan hasil
pengamatan minyak sereh lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan
bakteri Staphylococcus aureus dibandingkan dengan E. coli. Semakin
besar konsentrasi minyak serehnya, semakin sedikit bakteri yang tumbuh
karena daya hambatnya semakin meningkat.
Minyak atsiri yang terdapat dalam batang serai dapat
menghambat pertumbuhan bakteri yaitu dengan cara merusak dinding
sel bakteri, karena bakteri memiliki lapisan luar yang disebut dinding sel
32

yang dapat mempertahankan bentuk bakteri dan melindungi membran


protoplasma dibawahnya. Selain itu, minyak atsiri juga memiliki
kemampuan mengubah molekul protein dan asam nukleat. Minyak atsiri
dapat mengubah keadaan ini dengan mendenaturasikan protein dan asamasam nukleat sehingga merusak sel tanpa dapat diperbaiki lagi. Selain itu,
minyak atsiri dalam sereh berperan sebagai penghambat kerja enzim.
Setiap enzim yang ada di dalam sel bakteri merupakan sasaran potensial
bagi

bekerjanya

suatu

penghambat.

Penghambatan

ini

dapat

mengakibatkan terganggunya metabolisme atau matinya sel.


3. Minyak Cengkeh
Berdasarkan hasil pengamatan, antibakteri yang paling efektif
terhadap bakteri E. coli dan Staphylococcus aureus adalah minyak
cengkeh dibandingkan dengan minyak sereh. Semakin besar konsentrasi
minyak cengkehnya, semakin sedikit bakteri yang tumbuh karena daya
hambatnya semakin meningkat.
Minyak cengkeh mampu menghambat pertumbuhan bakteri
dengan merusak sistem pertahanan sel bakteri karena adanya aktivitas
antimikroba yang terkandung di dalam minyak cengkeh. Mekanisme
jenis kerusakan sel bakteri oleh senyawa eugenol yang terkandung dalam
minyak cengkeh belum diketahui dengan jelas apakah menyebabkan
kebocoran membrane dan kerusakan DNA, seperti halnya nitrit. Proses
penghambatan nitrit terhadap pertumbuhan sel bakteri yaitu dengan cara
mengganggu proses respirasi bakteri. Nitrit pada konsentrasi yang rendah
menunjukkan aktivitas penghambatan dengan kerja mengikat komponen
dalam proses transfer elektron dalam respirasi. Komponen yang dihambat
misalnya sitokorm. Tidak adanya pertumbuhan bakteri pada media uji
menunjukkan
bakterisidal

bahwa
karena

minyak

cengkeh

kemampuannya

dapat
tidak

dikatakan
hanya

bersifat

menghambat

pertumbuhan bakteri tetapi juga membunuh bakteri perusak makanan.


4.2.5 Prinsip Terbentuknya Zona Hambat
Pada umumnya metode yang dipergunakan dalam uji sensitivitas
bakteri adalah metode Difusi Agar yaitu dengan cara mengamati daya hambat
pertumbuhan mikroorganisme oleh ekstrak yang diketahui dari daerah di sekitar
kertas cakram (paper disk) yang tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme. Zona
33

hambatan pertumbuhan inilah yang menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap


bahan anti bakteri.
Tujuan dari proses uji sensisitivitas ini adalah untuk mengetahui obatobat yang paling cocok (paling poten) untuk kuman penyebab penyakit terutama
pada kasus-kasus penyakit yang kronis dan untuk mengetahui adanya resistensi
terhadap berbagai macam antibiotik. Penyebab kuman resisten terhadap
antibiotik yakni memang kuman tersebut resisten terhadap antibiotik yang
diberikan, akibat pemberian dosis dibawah dosis pengobatan dan akibat
penghentian

obat

sebelum

kuman

tersebut

betul-betul

terbunuh

oleh

antibiotic.Metode difusi cakram prinsip kerjanya adalah bahan uji dijenuhkan ke


dalam kertas cakram (cakram kertas). Cakram kertas yang mengandung bahan
tertentu ditanam pada media perbenihan agar padat yang telah dicampur dengan
mikroba yang diuji, kemudian diinkubasikan 370C selama 24 jam. Area (zona)
jernih disekitar cakram kertas diamati untuk menunjukkan ada tidaknya
pertumbuhan mikroba. Selama inkubasi, bahan uji berdifusi dari kertas cakram
ke dalam agar-agar itu dan sebuah zona inhibisi akan terbentuk. Sensitivitas
suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang
terbentuk.

Semakin

besar

diameternya

maka

semakin

terhambat

pertumbuhannya, Diameter zona sebanding dengan jumlah bahan uji yang


ditambahkan ke kertas cakram. Saat inkubasi cawan petri diletakkan dalam
keadaan terbalik dengan tujuan untuk menghindari menetesnya air yang
mungkin melekat pada dinding dalam pada tutup petri yang dapat
mengakibatkan kontaminasi.
Setelah diinkubasi selama 24 jam kemudian diamati apakah terbentuk daerah
zona hambat atau tidak. Daerah zona hambat yang terbentuk diukur diameternya
dengan menggunakan penggaris. Semakin besar diameternya maka semakin
poten antibiotik yang terkandung dalam ekstrak tersebut.
Kebanyakan antibiotik yang efektif kerjanya menggangu sintesis, penyusuhan
atau fungsi komponen-komponen makromolekul sel. Seperti penghambtan
pembentukan dinding sel oleh pelimiskin, penghambatan sintesis protein oleh
kloramfenikol

34

4.2.6 Pengaruh konsentrasi dan jenis bakteri uji terhadap zona hambat yang
terbentuk.
Setiap bakteri memiliki respon yang berbeda-beda terhadap antibiotiknya,
tergantung sifat antibiotik tersebut (berspektrum luas/berspektrum sempit).
Ampicillin merupakan salah satu antibiotik yang termasuk golongan penisilin
semi-sintetik yang berasal dari inti penisilin yaitu asam 6-amino penisilat (6APA) dan merupakan antibiotik spektrum luas yang bersifat bakterisid. Secara
klinis,

ampicillin

efektif

terhadap

bakteri

gram-positif

seperti

S.

pneumonia,enterokokus dan stafilokokus yang tidak menghasilkan penisilinase,


sedangkan pada bakteri gram-negatif, diantaranya gonokokus, H. influenza,
beberapa jenis E.coli , Shigella, Salmonella dan P. mirabilis. Seperti golongan
penicillin lainnya, ampicillin bekerja dengan menghambat sintesis dinding sel
yaitu dengan menyerang peptidoglikan dan mampu melakukan penetrasi pada
bakteri gram positif dan gram negatif. Keberadaan gugus amino pada
Ampicillin membuatnya mampu menembus membran terluar ( outer membran)
pada bakteri (Brander, et al., 1991).

35

Sementara itu konsentrasi dari antibiotik juga sangat mempengaruhi


pertumbuhan bakteri dimana semakin tinggi konsentrasi dari antibiotika maka
akan semakin besar zona jernih yang terbentuk (Dwidjoseputro., 2003)
4.2.7 Evaluasi akhir uji potensi antibiotik

Uji potensi antibiotika adalah suatu tekhnik untuk menetapkan suatu


potensi antibiotika dengan mengukur efek senyawa tersebut terhadap
pertumbuhan mikrooganisme uji yang peka dan sesuai. Efek yang ditimbulkan
pada senyawa uji dapat berupa hambatan pertumbuhan.
Uji potensi antibiotik dilakukan dalam 2 metode yaitu:
1. Metode kertas saring (Kirby and Bauer)
Metode ini menghambatpertumbuhan miroorganisme dengan menggunakan zazat kimia seperti fungisida, bakterisida, dan insektisida. Dengan perlakuan fisik
seperti dengan sinar UV, pemanasan yang tinggi, serta dengan perlakuan biologi
seperti menggunakan mikrooganisme lain sebagai antagonis.
2. Metode dAurbert
Metode dAubert yaitu metode yang digunakan untuk memeriksa kadar
antibiotika dalam bahan makanan sebagai bahan pengawet (Ramona dkk., 2007)
Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter
zona hambat yang terbentuk. Semakin besar diameternya maka semakin
terhambat

pertumbuhannya,

sehinnga

diperlukan

standar

acuan

untuk
36

menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik.
Terbentuknya zona bening atau zona hambat dapat menandakan adanya potensi
dari antibiotik yang digunakan dalam menghambat dan membunuh bakteri.
Konsentrasi antibiotik juga dapat mempengaruhi potensi dari suatu
antibiotik. Semakin besar konsentrasi dari antibiotika maka kemampuan
antibiotik untuk menghambat atau membunuh bakteri akan semakin besar
(efektifitas kerja antibiotik meningkat).
Untuk menghitung potensi dari antibiotik dapat dilakukan dengan
menggunakan metode garis lurus transformasi log dengan prosedur penyesuaian
kuadrat terkecil dan uji linieritas. Bila sejumlah penetapan dari bahan uji yang
sama dilakukan menggunakan kurva baku yang sama, hitung koefisien variasi
dari hasil semua penetapan bahan uji. Bila lebih dari satu penetapan dilakukan
untuk bahan uji yang sama dengan kurva baku yang berbeda, buat rata-rata dari
dua atau lebih nilai potensi.

37

BAB V
PENUTUP
5.1 KESIMPULAN
Dalam praktikum kali ini dilakukan pengujian aktivitas dari antibakteri.
Kelompok kami melakukan percobaan tentang pengujian antibakteri minyak sereh, minyak
cengkeh, kloramfenikol, gentamian dan sebagai kontrol negatifnya adalah aquadest steril
terhadap bakteri E. coli sebagai bakteri gram negatif. Metode yang kami lakukan pada
percobaan tersebut adalah metode sumuran, metode paper filter disk dan metode TLC.
Setelah dilakukan inkubasi 37 oC selama 24 jam, didapati bahwa area yang tidak
ditumbuhi bakeri E. coli yang berbentuk cincin hambat disekitar antibakteri dan kontrol
negatifnya yang paling besar adalah pada antibakteri kloramfenikol. Hal ini dikarenakan
kloramfenikol bekerja dengan jalan menghambat sintesis protein kuman. Yang dihambat
adalah enzim peptidil transferase yang berperan sebagai katalisator untuk membentuk
ikatan-ikatan peptida pada proses sintesis protein bakteri. Sehingga pada bagian ini hanya
ditemui sedikit bakteri yang dapat tumbuh.
5.2 SARAN
Agar pada saat pembenihan bakteri dilakukan dengan lebih berhati-hati terutama
dalam mensterilkan alat-alat supaya tidak terjadi kontaminasi ataupun bakteri yang akan
dibiakan sesuai dengan jumlah yang dikehendaki. Kendala dalam praktikum ini yaitu pada
proses pemipetan, jumlah mikropipet yang hanya terdapat 1 buah untuk digunakan oleh 4
kelompok sehingga tidak efisien waktu.

38

DAFTAR PUSTAKA
Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized
single disk method. Am J Clin Pathol. 1966 Apr;45(4):493-6.
Cappuccino dan Sherman, 200.1 Paper Disk Clear Zone. Prentice Hall
Dwidjoseputro, D.2003. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan
Englewood Cliff. Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pengelolaan Pangan Pangan. Departemen
Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas
Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor. Bogor
Ganiswarna, S. G. 1995. Farmakologi dan Terapi ed. 4. Jakarta : Universitas Indonesia Fakultas
Kedokteran.
Gunawan, S. G. 2007. Farmakologi dan Terapi.Jakarta : Gaya Baru
Hostettmann K. 1991. Methods in Plant Biochemistry: Assays for Bioactivity v. 6 - Methods in
Plant Biochemistry Vol 6
Jawetz, E., Melnick, J.L., dan Adelberg, E.A. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta :
Salemba Medika
Lutfi.2004. Kimia Lingkungan.Jakarta: Departemen Pendidikan Nasional.
Muniz, Carolina Campos, et al (2007). Potential of Antimicrobial: A Historical Perspective.
Journal of Microbiology. Vol 49 No: 3-4, December 2007
Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga
Supardi, I., dan Sukamto.1999.Mikrobiologi Dalam Pengolahan Dan Keamanan Pangan.
Bandung: Penerbit Aumni.

39

LAMPIRAN
1. Memanaskan ose pada lampu spiritus

2. Memanaskan bibir tabung reaksi yang berisi bakteri

3. mengambil bakteri E.coli yang akan di letakkan pada media agar dengan ose

40

4. Meletakkan ose yang berisi bakteri ke dalam tabung yang berisi aquadest steril

5. Meletakkan di atas vortex aqua steril yang terdapat bakteri

6. Membandingkan dengan saqua steril yang tidak di beri bakteri

7. Panaskan bibir cawan sebelum mengoleskan bakteri


41

8. Mencelupkan cotton swap ke dalam aquades steril yang telah berisi bakteri

9. Lalu mengoleskan pada cawan petri jangan sampai ada daerah yang tertinggal

10. Diamkan selama 15 menit lalu panaskan cork borner untuk membuat sumuran

42

11. Buatlah sumuran pada media agar dengan mencetak cork borner ke dalam petri

12. Ambillah hasil dari cetakan cork borner dan buang pada tempat sampah

13. Gunakan mikropipet untuk mengambil antibiotik

43

14. Buatlah 3 sumuran dengan antibiotik yang berbeda yaitu serai, aqua steril dan mentapip

15. Panaskan mulut cawan setelah terisi semua antibiotic

16. Masukkan dalam inkubator 37C selama 24 jam

44

17. Hasil pengamatan metode sumuran setelah 24 jam pada bakteri E coli

18. Hasil pengamatan metode paper filter disk dan TLC bioautography setelah 24 jam pada
bakteri E coli

45

46