Anda di halaman 1dari 2

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan fraksinasi dengan metode kromatografi kolom.

Setelah sebelumnya dilakukan fraksinasi dengan metode ECC, maka didapat fraksi yang baik
dengan menggunakan pelarut yang baik pula. Sehingga pelarut tersebut dipilih sebagai eluen untuk
mengelusi sampel pada metede kromatografi kolom.
Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan untuk memurnikan bahan kimia
tunggal dari campurannya. Ada 2 metode dalam kromatografi kolom yaitu metode kering dan
metode basah. Adapun metode yang kami gunkan adalah metode basah. Pada metode basah, fasa
diam dibasahi dengan fasa gerak hingga menjadi bubur di luar kolom, dan kemudian dituangkan
perlahan-lahan ke dalam kolom. Pencampuran dan penuangan harus ekstra hati-hati untuk
mencegah munculnya gelembung udara. Larutan bahan organik diletakkan di bagian atas fasa diam
menggunakan pipet. Lapisan ini biasanya ditutup dengan lapisan kecil pasir atau katun atau wol
kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari tuangan eluen. Eluen kemudian dialirkan
perlahan melalui kolom sambil membawa sampel bahan organik. Sering kali, wadah eluen sferis
atau corong pisah bersumbat yang sudah diisi eluen diletakkan di bagian atas kolom.
Mekanisme kerja dari kromatografi kolom adalah pemisahan suatu senyawa dalam kolom
kromatografi dengan silika gel sebagai fasa diam dan campuran pelarut polar-nonpolar sebagai fasa
gerak yang akan mengelusi sampel, eluen bergerak turun dan mengelusi sampel digerakkan oleh
gaya grafitasi bumi.
Fasa diam atau adsorben (penjerap) dalam kromatografi kolom adalah zat padat. Fasa diam
yang paling umum untuk kromatografi kolom adalah silika gel sedangkan Fasa gerak atau eluen
dapat berupa pelarut murni atau campuran pelarut. Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga
nilai faktor retensi senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,3 untuk meminimalkan
waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama kromatografi. Eluen dapat pula dipilih berdasarkan
daya pisahnya sehingga senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Optimasi eluen
dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya menggunakan kromatografi lapisan tipis
(KLT) dengan fasa gerak yang sama.
Pada metode ini, kolom diisikan dengan adsorben yang berupa padatan dalam hal ini adalah
silika gel yang sebelumnya telah dilarutkan dengan eluen. Eluennya yang digunkan adalah
campuran antara diklorometan dengan metanol pada perbandingan 99:1.yang dicampurkan hingga
membentuk bubur silika (slurry). Slurry dimasukkan dengan hati-hati kedalam kolom kromatografi
yang telah diisikan eluen yang sebelumnya telah disumbat dengan glass woll dan pasir pantai yang
berfungsi sebagai penahan adsorben agar tidak keluar bersama eluen. Pengisian kolom harus
dikerjakan secara seragam dan sepadat mungkin untuk menghindari terjadinya gelembung-

gelembung udara. Jika terdapat gelembung-gelembung udara dalam kolom maka akan berpotensi
menyebabkan pecahnya kolom.
Hal lain yang dapat dilakukan agar tidak terjadi pemecahan kolom adalah dengan
menambahkan eluen secara kontinu agar udara tidak masuk kedalam kolom. Kolom yang padat
diindikasikan dengan warna slurry yang semakin memutih dan kecepatan alir eluen yang semakin
lambat. Jika kolom sudah memadat, larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom . Mekanisme
yang terjadi pada kromatografi kolom ialah sampel akan terelusi oleh eluen melalui fase diam
silika gel. Senyawa organik terelusi oleh eluen proses elusi terjadi karena keseimbangan distribusi
zat analit pada fase gerak eluen dan fase diam selika gel. Elusi terus berlangsung hingga tidak ada
lagi yang tinggal dalam kolom. Proses elusi ini menghasilkan eluat yang diharapkan mengandung
banyak kurkumin.
. Eluen akan mengelusi sampel kunyit dan membawa senyawa bersamanya menuju wadah
eluat (keluar dari kolom), fasa diam (silika gel) memiliki daya adsorbsi yang cukup besar, sehingga
ketika eluen yang membawa sampel melewati fasa diam akan terbentuk fraksi-fraksi warna yang
berbeda. Fraksi warna yang berbeda ini menunjukkan perbedaan senyawa atau zat aktif yang
dipisahkan dari setiap fraksi. Semakin pekat warna fraksi, maka semakin banyak senyawa atau zat
aktif yang terpisahkan dalam fraksi tersebut. Dalam percobaan ini diperoleh 10 fraksi yang berbeda.
Dari fraksi yang dihasilkan pada kromatografi kolom selanjutnya dilakukan kromatografi
lapis tipis, namun sebelumnya fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom dipekatkan terlebih
dahulu. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan pelarut yang masih terkandung dalam fraksi
tersebut.
Pada dasarnya kurkumin banyak terdapat pada kunyit, sehingga dapat dipastikan dari setiap
fraksi yang diperoleh memiliki kandungan kurkumin. Untuk menguji keberadaan kurkumin maka
dilakukan metode pemisahan dengan kromatografi lapis tipis. Eluen yang digunakan untuk
mengelusi sampel pada KLT ini sama dengan eluen yang digunakan dalam kromatografi kolom,
yaitu campuran 1,2-dikloroetan-metanol dengan perbandingan 99:1.