Anda di halaman 1dari 13

MAKALAH

PARTICLE IMMUNOASSAY
Diajukan sebagai tugas kelompok
Matakuliah Kimia Klinik
Dosen
Prof. Dr. O. Suprijana, MS

Disusun Oleh
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Nina Fitriana
Yakobus Prima L
Hilda Amalia
Yuliyani Sartika D
Yulia Andina
Ira Monica
Asypa

A 141 043
A 141 044
A 141 052
A 141 057
A 141 058
A 141 060
A 141 068

8. Nisa Hoerunisa
9. Hani Nurlatifah
10. Fifi NurAfiyah S
11. Marwatul Jamil
12. Anggun Yunia
13. Mita Fajriaturrahmah
14. Vella Cavella

PROGRAM STUDI FARMASI


SEKOLAH TINGGI FARMASI INDONESIA
YAYASAN HAZANAH
BANDUNG
2015

IMMUNOASSAY

A 141 072
A 141 073
A 141 075
A 141 077
A 141 078
A 141 084
A 141 086

A. Pengertian
Reaksi antigen dan antibodi bersifat spesifik. Antigen akan bereaksi hanya
dengan antibodi yang khas untuk antigen tersebut. Oleh karena spesifitas yang
tinggi ini, reaksi antara antigen dan antibodi dapat digunakan untuk
mengidentifikasi salah satu menggunakan satu lainnya. Spesifitas ini
merupakan dasar reaksi serologis. Reaksi silang yang mungkin terjadi antara
antigen yang berhubungan dapat membatasi spesifitas tes.
Reaksi antigen-antibodi digunakan untuk mengidentifikasi komponen
spesifik dalam gabungan dari salah satu tersebut. Mikroorganisme dan sel
yang lain mempunyai antigen beragam, oleh karena itu dapat bereaksi dengan
banyak antibodi yang berbeda. Antibodi monoklonal merupakan sarana yang
sangat baik untuk identifikasi antigen karena mempunyai spesifitas tunggal
yang diketahui dan homogen. Antiserum yang dihasilkan sebagai bagian dari
respon imun mengandung kompleks campuran antibodi, oleh karena itu
heterogen. Ini mengakibatkan antiserum tersebut kurang bermanfaat untuk tes
spesifik.
Antibodi adalah molekul protein yang dihasilkan oleh sel-sel imun dan
mampu berikatan ke situs tertentu pada protein lain yang disebut antigen.
Antibodi dihasilkan tubuh sebagai respon terhadap antigen protein asing yang
diintroduksi ke dalam hewan vertebrata (misalnya mammalia). Antibody
terhadap satu antigen protein biasanya amat spesifik dan bisa dihasilkan serta
diourifikasi untuk digunakan dalam immunoassay. Teknik imunodiagnostik
cukup luas dan bervariasi, semuanya berdasarkan reaksi sistim kekebalan
dalam tubuh manusia yang diaplikasikan secara in vitro. Imunoassay
merupakan salah satu teknik immunodiagnostik yang paling banyak
digunakan. Teknik ini berdasarkan reaksi biokimia antara dua jenis analit
(antigen dan antibodi) yang dapat memberi hasil bervariasi bergantung pada
jenis indikatornya (Ahyar Ahmad,2005)

Sebuah label atau tag, bisa dilekatkan ke antibody agar bisa dideteksi
begitu antibody telah berikatan dengan antigen yang bersesuaian dengannya.
Label paling sensitive adalah isotop radioaktif yang digunakan bagi
radioimmunoassay (RIA) atau label enzim yang digunakan dalam enzymelinked immunoabsorbent assay ((ELISA). Label label enzim lebih sering
digunakan daripada isotop radioaktif karena lebh mudah ditangani dan
dibuang,

B. Klasifikasi
System imunoassay dapat dilakukan (diformat) dalam dua sistem,
yaitu sistem heterogen yang memerlukan pemisahan dan sistem homogen
yang tidak memerlukan pemisahan reaktan setelah reaksi terjadi.
Pada sistem heterogen, sifat label sebelum dan sesudah reaksi tetap
sama, jadi perlu pemisahan komponen reaktan yang berlebih dengan
kompleks Ag-Ab yang terbentuk, sebab kuantitas kompleks ini yang akan
dihitung. Pada sistem homogen, sifat label sebelum dan sesudah reaksi sangat
berbeda, jadi tidak perlu lagi pemisahan komponen reaktan secara fisik
(Deshpande, 1994). Berdasarkan mekanisme reaksinya, sistem imunoassay
dapat dikategorikan menjadi assay kompetitif dan non kompetitif, system
terakhir ini prinsip dasarnya sama dengan prinsip peran substrat-inhibitor
dalam reaksi enzimatik (Stryer, 1988). Gabungan dari sistem diatas
menghasilkan produk-produk imunodiagnostik komersial dengan enam model
reaksi dasar (Goshling, 1990).

1. Assay kompetitif menggunakan antigen terlabel


Gambar 1 bertujuan mendeteksi antigen dengan konsentrasi antibodi yang
terbatas dan mengunakan antigen serupa yang dilabel sebagai
kompetitornya.

2. Assay kompetitif menggunakan antibodi berlabel


Gambar 2 dengan tujuan sama seperti model di atas. Assay ini biasanya
digunakan jika sifat antigen dapat mempengaruhi label enzim yang
digunakan

Gambar 2.
Reaksi model 2: Assay kompetitif dengan antibodi terlabel enzim (EAB). Antigen (L) terikat pada suatu fasa padat dan
antigen dari contoh berkompetisi untuk mendapat tempat pada
molekul antibodi terlabel enzim yang terbatas

3. Assay kompleks Ag-Ab (Gambar 3) bertujuan mendeteksi antigen atau


antibodi; cara ini paling banyak digunakan di bidang diagnostik penyakit
atau biomedis. Secara teknis relatif sederhana dan murah. Prosedur seperti
reaksi aglutinasi, immunodifusi ganda dan presipitasi berdasarkan model
ini. Biasanya dalam model ini tidak menggunakan label dan kepekaannya

terbatas, meskipun demikian reaksi imunodifusi dapat mendeteksi 0,005


g protein/ml suspensi (Silverstein et al., 1963).

Gambar 3.
Reaksi model 3; Assay kompleks antigen-antibodi. Antibodi (Y) yang
diikatkan pada suatu partikel akan beragregasi jika bereaksi dengan
suatu antigen homolog yang multivalen (MVA).

4. Sandwich assay (Gambar 4) merupakan metode yang lebih modern dan


luas penggunaannya. Prinsipnya hampir sama dengan model 3, tapi
antigen yang digunakan biasanya dapat berikatan dengan dua atau lebih
antibodi yang berbeda spesifisitasnya. Salah satu reaktan (biasanya
antibodi) terikat (immobilized) pada matrix tertentu seperti polistirene dan
pada antibodi lainnya diberi label. Sandwich assay inipun bermacammacam prinsipnya.

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) termasuk dalam model


ini. Model ini lebih peka dari model 1, dapat mendeteksi 10 antigen.

Gambar 4.
Reaksi model 4; Immunoassay "sandwich" dimana suatu antige
multivalen (L) pertama-tama diikatkan pada suatu antibodi
poliklonal (AB-1) yang telah diimobilisasi. Antigen tersebut
kemudian dideteksi dengan antibodi ke dua (AB-2) yang telah diberi
label enzim.
1. Assay non kompetitif dengan tujuan mendeteksi antibodi dalam serum
(berbeda dengan model sebelumnya). Antigen yang digunakan biasanya
berlebih dan terikat pada matrix tertentu, serum yang akan dideteksi jenis
antibodinya (antibodi primer) direaksikan dengan antigen tersebut. Reaksi
ini memerlukan suatu anti-antibodi (antibodi sekunder) terhadap antibodi
yang akan dideteksi. Antibodi sekunder inilah yang biasanya dilabel dan
dapat bereaksi

dengan bagian Fab (Fragment antigen binding) dari

molekul antibodi primer, sehingga kandungan antibodi dalam serum dapat


ditentukan.
2. Assay bebas pemisahan pada reaksi (sistim homogen) dengan tujuan
sama seperti model 1, 2, dan 3, tapi pembacaan hasil reaksi ditentukan
oleh sifat label yang memang berbeda sebelum dan sesudah reaksi; oleh
sebab itu sistim ini tidak memerlukan pemisahan pasca reaksi .Teknik ini
banyak digunakan dalam laboratorium klinik dan forensik seperti kasus
penyalahgunaan obat. Assay ini biasanya kurang peka jika dibandingkan
dengan yang sistim yang lain.

Gambar 5.
Reaksi model 5; Immunoassay nonkompetitif berdasarkan ikatan
antibodi-antibodi. Antigen diikatkan pada suatu fasa padat, dan
antibodi homolog (AB-1) akan berikatan dengannya. Antiantibodi
(AB-2) terhadap AB-1 yang telah terlabel enzim akan berikatan
dengan AB-1 dan jumlahnya dapat ditentukan secara kuantitatif.

Gambar 6.
Reaksi model 6; Immunoassay bebas pemisahan. Aktivitas enzim
yang terikat pada antigen (E-L) akan dihambat, dengan kata lain
konversi substrat (S) menjadi produk (P) akan dicegah jika
antigen tersebut berikatan dengan antibodi
.
C. Prosedur
Ada tiga tahap penting dalam melaksanakan immunoassay (Persulessy: 1999)
1. Reaksi immunology
Pada tahap pertama, cuplikan dianalisa ditambahkan bersama-sama
antigen yang diberi Label dengan suatu enzim, kedalam tabung reaksi
yang berisikan antibodi yang berikatan dengan partikel magnetik.
Pestisida yang ada didalam cuplikan berlomba dengan pestisida berlabel
untuk berikatan dengan antibodi. Reaksi immunologi terjadi selama 15
sampai 30 menit (Gambar 1).

Gambar 1. Reaksi Immunologi


2.

Reaksi Pemisahan
Pada tahap kedua, suatu medan magnet yang dipakai untuk
memisahkan campuran reaksi. Semua partikel akan tertarik dan tertahan
oleh dinding tabung sementara kelebihan reagent didekantasi dan
partikelnya dicuci dua kali (Gambar 2).

Gambar 2. Proses Pemisahan


1.

Proses Pembentukan warna


Pada tahap ketiga, jumlah antigen berlabel enzim ditetapkan
dengan menambahkan hidrogen peroksida dan chromogen untuk
menghasilkan produk berwarna (Gambar 3). Setelah inkubasi singkat,
produksi warna dihentikan dan distabilkan dengan penambahan asam.
Karena antigen berlabel berlomba dengan antigen didalam cuplikan
untuk berikatan dengan antibodi, maka pengembangan warna
sebanding dengan antigen yang berlabelkan enzim dan sebaliknya juga
sebanding dengan konsentrasi antigen di dalam cuplikan.

Partikel magnit yang


terikat antibody

Antigen konjugat dalam


enzim

Antigen

Substrat homogen

Produk warna

D. Aplikasi Immuoassay untuk ELISA


Salah satu contoh aplikasi dari immunoassay adalah Uji Elisa. Sel ELISA
dikembangkan untuk mendeteksi antigen atau agen yang terdapat dalam sel.
Sehingga pada model ini tidak diperlukan pelapisan antigen pada mikroplate
tetapi dengan cara fiksasi sel yang diinokulasikan sampel yang dideteksi
agennya, kemudian direaksikan dengan antibodi poliklonal atau monoclonal
dan akhirnya direaksikan dengan konjugat fragmen immunoglobulin anti
immunoglobulin yang digunakan untuk mendeteksi antigen. Antibodi yang
sering digunakan untuk mendeteksi agen dalam sel adalah antibodi
monoclonal, karena agen yang terdeteksi di dalam sel belum tentu merupakan
antigen yang lengkap, tetapi merupakan bagian tertentu yang dapat
menstimulasi antibodi. Hal inilah yang membuat metode ini cukup sensitive.
1. ELISA untuk Deteksi Virus
Aplikasi ELISA untuk mendeteksi infeksi virus dapat dilakukan
dengan dua cara, yang pertama adalah mendeteksi reaksi imun
(interferon, sitokin, antibodi) dan yang kedua adalah mendeteksi
antigennya.
Model ELISA direct maupun indirect dan sandwich ELISA baik
dengan sistem peroksidase maupun alkali fospatase dapat digunakan.
a. Deteksi Antigen
b. Deteksi Antibodi

2. ELISA untuk Deteksi Antigen dan Antibodi pada Infeksi Bakteri


Bakteri mempunyai struktur yang cukup komplek, sehingga untuk
mendeteksi antigen dari infeksi bakteri dengan ELISA terkadang
mendapat kesulitan karena mempunyai struktur yang homogen seperti
kuman golongan gram negatif. Berdasar kompleksitas tersebut membuat
terjadinya reaksi silang satu sama lain. Sebagai contoh brucellosis dan
tuberculosis. Untuk menghindari reaksi yang tidak dikehendaki maka
diperlukan material yang mempunyai spesifitas yang tinggi dengan cara
menyediakan antibodi monoklonal yang dihasilkan dari epitop yang
berbeda satu sama lain. Hal ini karena kebanyakan antigen dari antigen
terdapat pada permukaan sebagai contoh fimbria yang terletak pada
permukaan yang berfungsi untuk penempelan, enzyme ekstra sel untuk
penetrasi dan invasi, kapsul untuk perlindungan, eksotoksin, dan lain-lain.
Dalam mengembangkan ELISA pada diagnostik infeksi bakteri yang
perlu dipertimbangkan adalah menyediakan antigen spesifik. Untuk itu
antigen harus memenuhi syarat-syarat tertentu seperti antigen harus
imunogenik dan menginduksi respon antibodi pada inangnya, respon
antibodi harus sedemikian rupa sehingga infeksi dapat diketahui, dengan
kata lain metode uji harus sensitif, antigen harus unik agar mempunyai
spesitifitas yang tinggi.
Secara umum ada beberapa macam antigen dari bakteri.
a. Bakteri utuh.
b. Bakteri utuh yang dirusak secara mekanis, fisik atau kimiawi seperti
penggerusan, pengocokan dengan manik-manik kaca, sonikasi, vorteks
homogenizer, pemanasan dengan suhu tinggi, pendidihan, autoklaf,
surfaktan non-ion, anion atau kation.
c. Ekstrak kasar bakteri yang dirusak dengan cara pemusingan seperti
dengan fraksinasi dengan garam dan kromatografi.
d. Senyawa kimia murni atau setengah murni.
Target antigen yang dapat digunakan untuk ELISA antara lain dinding
sel Gram positif, membran sel Gram negative, lipopolisakarida, glikolipid,
peptidoglikan, asam teikoat, flagella, fimbria (pili), polisakarida, toksin
ekstrasel, ribosom, protein membran luar.

a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.

Antigen Dinding Sel Bakteri


Antigen Membran Bakteri
Antigen Lipopolisakarida
Glikolipid
Flagella
Fimbria
Protein ekstraseluler (toksin)
Antigen non-polisakarida
Antigen polisakarida
Penggunaan ELISA untuk deteksi antibody dari bakteri dapat

digunakan secara luas selain untuk deteksi dini juga dapat untuk monitor
hasil vaksinasi.
3. ELISA untuk infeksi parasit
Dalam pengembangan teknologi ELISA untuk parasit sedikit lebih
rumit dibandingkan dengan mikroorganisme lainnya, karena mempunyai
sifat yang sangat berbeda dan komplek satu sama lain. Setiap parasit
mempunyai siklus hidup yang beda sehingga model pengekspresian
antigen juga berebeda, sehingga siklus dan pathogenesis pada infeksi
parasit sangat menentukan dalam pengembangan teknologi ELISA. Hal
yang

harus

dipersiapkan

dalam

mengembangkan

ELISA

pada

imunoparasitologi adalah perangkat antigen, antibodi sedang antiglobin


yang dilabel dengan enzim sudah banyak dikomersilkan dan mudah
didapatkan.
a. Perangkat antigen
b. Perangkat antibodi
4. ELISA untuk diagnostik hormon
Aplikasi ELISA untuk diagnostik hormon adalah merupakan
pengembangan teknologi diagnostik Radio Immunoassay (RIA). Selain
aman tingkat sensitivitasnya 7 kali lebih sensitive dibandingkan dengan
RIA. Berkembangnya metode ini sangat mendukung para ilmuwan
reproduksi dalam mengendalikan antara lain siklus estrus dengan
menggunakan prostaglandin dan progesterone, pengukuran hormon
progesterone untuk diagnostik dini kehamilan (20-26 hari), penggunaan
kortikosteroid untuk merangsang kelahiran. Pada pengukuran hormon
terutama progesterone sampel yang dapat digunakan untuk ELISA adalah

berasal dari darah dan dari air susu. Hal ini sudah dapat menggambarkan
fungsi luteal yang mempunyai presisi tinggi. Di samping itu ELISA sering
digunakan untuk mengukur Thyroid Stimulating Hormon dan Human
Chorionic Gonadotropin. Selain deteksi estrus, ELISA sering digunakan
untuk melacak kelainan pada ovarium apakah terjadi kista ovarium atau
kista folikular, sehingga dapat dilakukan tindakan sedini mungkin.
5. ELISA untuk aplikasi klinik
Kegunaan ELISA diklinik biasanya sering digunakan

untuk

memonitor respon imun terutama untuk diagnostik dini. Sebagai contoh


pendeteksian interferon pada infeksi dini kadang tidak atau belum
ditemukan antibodi seperti igM karena interferon hanya diproduksi secara
local bukan sistemik. Kelemahan diagnostic awal pada interferon kurang
bisa menggambarkan secara umum karena interferon hanya dapat
diproduksi pada sel tertentu saja, sedang immunoglobulin secara sistemik.
Model lain yang dikembangkan pada diagnostic klinik adalah sitokin
atau pada bahan komersil lebih banayk yang sudah terspesifikasi seperti
interleukin (IL). Interleukin sekarang memegang peranan penting pada
infeksi dini maupun sebagai barier terutama infeksi yang menyebabkan
peradangan seperti interleukin 10 (IL-10).
Perkembangan imunologi yang begitu cepat tidak terlepas dari dorongan
perkembangan cabang ilmu lain serta metode pemeriksaan laboratorium yang
ditunjang dengan peralatan yang semakin canggih. Analisis, baik kualitatif
maupun kuantitatif, terhadap berbagai gambaran tanggapan kekebalan
menyebabkan semakin bertambahnya pemahaman terhadap pathogenesis
berbagai penyakit. Dalam bidang kesehatan, pemahaman semacam ini,
ditambah

penguasaan

prosedur

laboratorium,

semakin

membuka

kemungkinan penerapan imunologi upaya diagnostik berbagai penyakit.


Pada pengembangan immunoassay banyak pilihan teknik yang dapat
digunakan sebagai acuan untuk mendapatkan hasil yang optimal, tetapi tidak
sedikit yang terbentur pada tingkat sensitivitasnya

DAFTAR PUSTAKA

Brooks, G.F., dkk., 2005, Mikrobiologi Kedokteran, Salemba Medika; Jakarta


Rantam, F.A., 2003, Metode Imunologi, Airlangga University Press; Surabaya
Sofro, A.S.M, 1994, Imuno Kimia, Penerbit Andi Offset; Yogyakarta

Persulessy, A.E. dan Pramudji.1999. Kemungkinan Pemanfaatan Teknik


Immunoassay Dalam Usaha Pemantauan Residu Pestisida Di Kawasan
Pesisir Pantai. Jurnal Marina Chimica Acta, Edisi Spesial Oktober 1999,
hal 4 11.

Ahmad, Ahyar.2005. Teknik Immunoassay Dalam Analisis Keamanan Pangan DasarDasar Reaksi Kimia dan Penerapannya. Jurnal Marina Chimica Acta.
Vol. 6 No .1 hal. 21-24.