Anda di halaman 1dari 26

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERI PATOGEN TUMBUHAN (PTN621)

Teknik Isolasi, Deteksi dan Identifikasi Bakteri Patogen Tanaman

Isnainy Dinul Mursyalati Yus


A352150021

Dosen:
Dr. Ir. Kikin Hamzah Mutaqin, M.Si
Dr. Ir. Giyanto, M.Si

Asisten Praktikum:
Tatit Sastrini, S.P

PROGRAM STUDI FITOPATOLOGI


FAKULTAS PERTANIAN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2015

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri dapat ditemukan dimana saja dengan beragamnya fisiologis yang dimiliki masingmasing bakteri. Bakteri yang ditemukan berasosiasi dengan tanaman ada yang sebagai epifit, endofit
dan patogen. Bakteri patogen atau fitopatogen merupakan anggota kelompok yang terakhir, yang
jumlahnya relatif sedikit (Kado, 1992; Sigee, 1993 dalam Saddler, 2002). Dalam jurnal Saddler (2002)
menyatakan bahwa semua bakteri patogen sampai saat ini masuk dalam Bakteri Domain (yang
sebelumnya dikenal sebagai Eubacteria).
Kebanyakan bakteri memiliki karakteristik morfologi secara umum, yakni berbentuk lurus atau
batang yang sedikit melengkung dengan dinding sel yang kaku dan metabolismenya aerobik atau
fakultatif anaerob. Pengecualian terhadap anggota dari kelas Mollicutes. Anggota dari kelas Mollicutes
meskipun masih berhubungan dengan bakteri Gram-positif seperti clostridia dan basil, dimana
kelompok ini tidak memiliki dinding sel yang kaku.
Salah satu faktor yang menentukan dalam terjadinya penyakit tumbuhan ialah adanya interaksi
patogen dengan tanaman inang yang ditunjukkan dengan terjadinya pertumbuhan dan perkembangan
patogen di dalam jaringan inang. Untuk terjadinya infeksi patogen harus terlebih dahulu mengenal
inangnya (masa prapenetrasi) untuk selanjutnya melakukan infeksi dan masuk ke dalam jaringan inang
(masa pasca penetrasi). Sebagai akibat dari adanya infeksi akan terjadi penyakit tumbuhan dan
tumbuhan juga akan menunjukkan respon sebagai salah bentuk pertahanannya.
Penyakit sebenarnya adalah suatu proses dimana bagian-bagian tertentu dari organisme tidak
dapat menjalankan fungsinya secara normal dengan sebaik-baiknya karena adanya suatu gangguan.
Tanaman dapat dilihat dari dua sudut pandang, yaitu secara biologi dan ekonomi maka penyakit
tanamanpun mengandung unsur dua sudut pandang ini. Dari segi biologi, tanaman adalah organisme
yang melakukan kegiatan fisiologis, sehingga dari segi ini penyakit tanaman adalah penyimpangan dari
sifat normal sehingga tanaman tidak dapat melakukan kegiatan fisiologis seperti biasanya.
Bakteri tidak dapat melakukan infeksi dengan menembus permukaan jaringan tumbuhan yang
utuh. Bakteri dapat masuk ke dalam jaringan tanaman melalui luka mekanis. Adanya tekanan negatif
didalam pembuluh akibat luka akan mengakibatkan bakteri masuk kedalam pembuluh sehingga bakteri
tersebut terlindung dari faktor lingkungan yang kurang baik. Luka yang ditimbulkan oleh serangga juga
dapat menjadi jalan masuk bagi bakteri.
Bakteri fitopatogen memiliki dinding sel sehingga dapat dibagi lagi menjadi bakteri Grampositif dan bakteri Gram-negatif. Pengelompokan ini berdasarkan pada kemapanan pewarnaan pada
mikroskop yang sama dengan pendekatan filogenetik. Dalam hal ini, semua bakteri Gram negatif
tanaman tercakup kedalam Kelas Proteobacteria (Stackebrandt et al., 1988 dalam Saddler, 2002)
sedangkan Gram-positif yang ditemukan di Kelas Actinobacteria (Stackebrandt et al., 1997 dalam
Saddler, 2002). Kebanyakan bakteri fitopatologi merupakan bakteri Gram-negatif, yang mana bakteri
yang termasuk dalam kedalam kelompok ini antara lain genus Acidovorax, Agrobacterium,
Burkholderia, Enterobacter, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia dan Xanthomonas, sedangkan
beberapa bakteri Gram-positif yang termasuk antara lain genus Clavibacter, Curtobacterium,
Rathayibacter dan Streptomyces (Saddler, 2002).
Tujuan
Tujuan dari kegiatan praktikum bakteri patogen tumbuhan ini yaitu untuk mengetahui teknik
isolasi, deteksi dan identifikasi bakteri patogen dan non patogen dengan menggunakan metode
konvensional dan metode molekuler.

BAHAN DAN METODE


Waktu dan Tempat
Praktikum Bakteri Patogen Tanaman dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi, Departemen
Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor pada bulan Oktober hingga Desember
2015.
Bahan dan Alat
1. Media Pertumbuhan Bakteri
Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah media biakan bakteri yang
terdiri dari Kings B Agar, Triphenyl Tetrazolium Chloride (TZC), Yeast Dextrosa CaCO3 Agar
(YDCA), dan Tryptic Soy Agar (TSA), WYE (Water Yeast Extract) Agar 10%, alkohol 70%,
akuades steril, aluminium foil, plastik wrap, jarum ose, bunsen, Laminar air flow, autoklaf,
oven, kompor listrik, cawan petri, test tube, labu erlenmeyer, gelas ukur, tissu, kertas label,
timbangan analitik, dan syringe filter.
Tabel 1. Macam-macam media pertumbuhan bakteri
Media Tumbuh Kelompok bakteri sasaran Kebutuhan bahan per liter
KingsB
Pseudomonas kelompok
Protease peptone 20 gram
fluoresens
K2HPO4 1.5 gram
MgSO.7H2O 1.5 gram
Gliserol 15 ml
Agar 15 ml
Aquades 1 liter
TZC
Ralstonia solanacearum
Pepton 10 gram
(Triphenyl
Casamino acid 1 gram
Tetrazolium
Glukase 5 gram
Chloride)
Agar 17 gram
TZC 0.1 gram (tidak disterilisasi)
YDCA (Yeast
Xanthomonas campestris Yeast extract 10 gram
Extract
pv. campestris
Dextrose 20 gram
Dextrose
Calcium carbonat 20 gram
CaCO3 Agar)
Agar 15 gram
Aquades 1 liter
Wakimoto agar Xanthomonas oryzae pv. Kaldu kentang 300 ml
Oryzae
Pepton 7 gram
Sukrosa 17 gram
CaCO3 0.5 gram
Na2HPO4.2H20 0.5 gram
Agar 17 gram
Aquades 1 liter
WYE (Water Aktinomiset
Yeast Extract 0.25 gram
Yeast Extract)
K2HPO4 0.5 gram
Agar
Agar 18 gram
Aquades 1 liter
TSA 10%
Bakteri endofit
TSB 3 gram
Agar 20 gram
Aquades 1 liter

2. Isolasi Bakteri Patogen dan Bakteri Antagonis dari Jaringan Tanaman dan Tanah
Alat yang digunakan berupa cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, gelas
baker, glass bead, mikro pipet 1 ml dan 200 L, tips mikropipet steril, gunting, pisau atau silet,
skapel, jarum ose, vortex, kertas tissu, lampu bunsen, alat tulis dan label. Sedangkan bahanbahan yang digunakan dalam praktikum isolasi ini, yaitu bakteri patogen yang diisolasi dari
berbagai tanaman, antara lain
Tabel 2. Isolasi bakteri yang diambil dari beberapa sampel tanaman
Bagian tanaman
Tanaman
Bakteri sasaran
Daun
Timun
Pseudomonas syringae pv. glycinea
Kubis
Xanthomonas campestris pv. campestris
Padi
Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Batang
Wortel
Erwinia carotovora
Leunca
Ralstonia solanacearum
Pelepah
Pisang
Bakteri endofit
Tanah disekitar
Aktinomiset
pertanaman
bambu
Medium yang digunakan dalam isolasi yaitu Kings B, YDCA, Wakimoto, WYE dan TSA, serta
beberapa bahan lainnya alkohol 70%, NaOCl (Koloroks) 3%, buffer NaCl 0,85% dan akuades
steril sebagai bahan-bahan lainnya yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri.
3. Pengamatan Morfologi Bakteri, Pewarnaan Gram dan Pewarnaan Spora
Alat yang digunakan berupa cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, beaker
glass, gelas benda, mikro pipet, jarum ose, vortex, kertas tisu, lampu bunsen, mikroskop cahaya,
kipas angin dan kamera digital.
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini terdiri dari isolat bakteri uji, media TSA,
KOH 3%, alkohol 70%, akuades steril, air bersih, minyak immersi, cat Crystal violet (Crystal
violet 2 g; ethyl alcohol 95% 20 ml; amonium oxalate 0,8 g dan akuades steril 80 ml), lugols
iodine (iodine 1 g; potassium iodide 2 g; dan akuades steril 300 ml), decolorizes (95% ethyl
alcohol 100 ml; acetone 100 ml), safranin (safranin 2,5 g dan ethyl alcohol 95% 100 ml di
campurkan kemudian diambil 10 ml dan dicampur dengan 90 ml akuades steril.
4. Uji Fisiologi Bakteri
Alat yang digunakan yaitu cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, beaker
glass, object glass, kaca preparat, mikropipet, jarum ose, vortex, kertas tissu, bunsen, jarum
suntik, pisau stainless dan kamera digital.
Bahan yang digunakan dalam pengujian ini adalah isolat bakteri murni, beberapa media
yaitu (pepton 0,3 g; NaCl 0,75 g; agar 5 g dan akuades 150 ml); tembakau, H2O2, KOH 3%,
malachite green 5,0% (w/v dalam H2O), safranin 0,5 %(w/v dalam H 2O), crystal violet , lugols
iodine (iodone 5 g; potasium iodine (KI) 10 g dalam aquades 100 ml), alkohol 70%, akudes
steril dan air bersih.
5. Deteksi dan Identifikasi Bakteri dengan Teknik Molekular Berbasis Asam Nukleat
Bahan dan alat yang diperlukan untuk ektraksi DNA kromosom bakteri adalah isolat
bakteri, tabung eppendorf 1,5 ml, buffer TE pH 8.0 (10 mM Tris, 1 mM EDTA), lysozim, SDS
10%, NaCl 5 M, larutan CTAB-NaCl, buffer CTAB, kloroform/isomail alkohol (24:1 v/v),
isopropanol, ethanol 70 % dan ethanol absolut, vortex, centrifuge, pipet mikro, mikro tips,
shaker water bath, gel agrarose, buffer TAE 2X, bufer TAE 1X, bak Elektroforesis, dan
Transilluminator.

6. Uji Potensi Bakteri Antagonis


Alat yang digunakan yaitu cawan petri, laminar air flow, kertas saring steril, tabung
reaksi, mikropipet, tips mikropipet, glass bead, jarum ose, lampu bunsen, kertas tissu, mistar,
dan kamera digital.
Bahan yang digunakan yaitu isolat bakteri patogen (Isolat 1, Ralstonia solanacearum,
Erwinia, Xanthomonas campestris pv. campestris dan Xanthomonas oryzae pv. oryzae) bakteri
agens hayati (Aktinomiset, bakteri endofit), media NA, serta alkohol 70%.
7. Kurva Pertumbuhan dan Perhitungan Populasi Bakteri
Alat yang digunakan yaitu tabung erlenmeyer, tabung reaksi, shaker, waterbath,
spektofotometer, alat tulis dan kamera digital. Sedangkan untuk bahan-bahan yang digunakan
yaitu isolat bakteri Escherichia coli, medium LB dan akudes steril.
8. Teknik Penularan Fitoplasma
Alat yang digunakan yaitu silet, kertas film dan kamera digital. Bahan yang digunakan
yaitu tanaman kacang tanah sehat dan tanaman kacang tanah bergejala sapu setan.

Metode
Teknik Aseptik
Pekerjaan dengan mikroorganisme membutuhkan kecermatan dan kerapian yang tinggi karena
mikroorganisme sangat tersebar di ruangan dan peralatan. Untuk mencegah kontaminasi mikrob non
sasaran, diperlukan teknik aseptik agar pekerjaan dengan mikrob sasaran menjadi efektif. Teknik
aseptik dilakukan terhadap ruangan dan peralatan kerja, tangan, dan bahan perlakuan. Pelaksanaan
teknik aseptik yang baik akan mempermudah diperolehnya mikrob non sasaran dalam bentuk biakan
murni.
Kegiatan praktikum umumnya bersifat asepsik sehingga dilakukan di dalam laminar air flow
cabinet. Sebelum melakukan pekerjaan, tangan, laminar air flow disterilisasi menggunakan lampu UV
selama 15 menit setelah itu meja kerja disemprot dengan alkohol 70% atau cairan antiseptik lain. Kipas
pada laminar dihidupkan dan setiap kali menggunakan alat Bahan dan peralatan yang akan digunakan
disterilisasi terlebih dahulu Selama bekerja, seperti cawan petri dan jarum ose harus dipanaskan
terlebih dahulu dengan api bunsen. Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara sterilisasi basah, sterilisasi
kering, dan sterilisasi mekanik. Sterilisasi yang paling umum dilakukan adalah sterilisasi basah dengan
memanfaatkan uap air jenuh pada suhu 121 oC selama 15 menit.
Sterilisasi untuk media dan alat dapat dilakukan dengan teknik sterilisasi basah dan sterilisasi
kering. Sterilisasi basah dilakukan dengan menggunakan autoklaf dan sterilisasi kering dengan
menggunakan oven. Sterilisasi menggunakan autoklaf dilakukan pada suhu 121 0C dan tekanan 15 atm
selama 2 jam. Media yang sudah steril disimpan di dalam refrigerator dan antibiotik pada beberapa
media ditambahkan pada saat media akan digunakan. Sedangkan alat-alat yang sudah steril akan
dilakukan sterilisasi kering dengan disimpan di dalam oven pada suhu ruang sebelum digunakan.
1. Teknik Isolasi Bakteri Patogen dan Bakteri Non-Patogen
Isolasi bakteri penyebab penyakit dimulai dengan memanaskan media bakteri steril yang
telah dibuat menggunakan oven selama 2 menit. Media yang telah cair dituangkan ke dalam
petridis 20 ml lalu didiamkan hingga membeku di dalam laminar air flow.
a) Isolasi dari Daun
Bakteri yang diisolasi dari daun yaitu Spesies 1 penyebab bercak bersegi pada daun
kedelai, Xanthomonas campestris pv. campestris penyebab penyakit busuk hitam pada
kubis, dan Xanthomonas oryzae pv. oryzae penyebab penyakit hawar daun bakteri (kresek
pada padi).
Bagian diantara daun sakit dan sehat dipotong kecil dengan ukuran 1,5 x 1,5 m 2
kemudian dimasukkan ke dalam larutan kloroks 3% selama 1 menit. Potongan daun
tersebut kemudian diambil menggunakan pinset steril dan dibilas selama 3 kali
menggunakan akuades steril selama 20 detik. Daun dikeringanginkan pada tisu steril.
Selanjutnya, daun dipotong-potong lebih kecil menggunakan gunting steril. Potongan
tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml buffer NaCl 0,85% steril
kemudian divortex. Suspensi dibiarkan selama 1 jam supaya oose bakteri keluar dari
jaringan daun.
b) Isolasi dari Batang
Tanaman leunca yang terserang oleh bakteri Ralstonia solanacearum penyebab
penyakit layu, Bagian batang tanaman leunca dicuci dengan air untuk membersihkan
kotoran yang terbawa dari lapang kemudian dipotong tipis dan miring lalu dimasukkan ke
dalam 5 ml buffer NaCl steril konsentrasi 0.85% di dalam tabung reaksi. Tanda patogen
diamati dengan munculnya oose berwarna putih.

c) Isolasi Bakteri Antagonis Aktinomiset dari Tanah


Tanah sebanyak 1 g dimasukkan ke dalam larutan buffer NaCl 0,85% sebanyak 9 ml.
Kemudian suspensi divortex selama 1 menit selanjutnya dilakukan pengenceran berseri.
Diinokulasikan di media WYE.
d) Isolasi Bakteri Endofit dari Pelepah Pisang
Bagian tanaman dicuci dengan air mengalir. Bagian tanaman dipotong kecil dan di
ambil bagian dalam pelepah daun. Disterilkan secara berseri dengan menggunakan alkohol
dan air steril 3 kali secara berurutan. Sampel digerus dengan menggunakan mortar dan
pistil steril dengan ditambahan akuades steril sebanyak 1 ml. Hasil gerusan dipindahkan ke
dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml akuades steril.
Proses isolasi bakteri yang telah disebutkan sebelumnya dilanjutkan dengan
pengenceran berseri untuk mendapatkan populasi bakteri dalam jumlah koloni yang
diinginkan (30-300). Pengenceran berseri dilakukan untuk menghindari hasil isolasi dengan
jumlah bakteri yang terlalu banyak sehingga menyulitkan perhitungan jumlah koloni dan
pengamatan morfologi bakteri tersebut).
Sebanyak 1 ml suspensi bakteri dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9
ml air steril kemudian dihomogenisasi dengan menggunakan vortex selama 20 detik untuk
mendapatkan pengenceran 10-1. Suspensi bakteri sebanyak 1 ml diambil dari pengenceran
10-1 dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml air steril untuk mendapatkan
pengenceran 10-2. Prosedur yang sama dilakukan sampai pengeceran 10-5. Setelah itu,
sebanyak 0.1 ml suspensi dari pengenceran 10 -1, 10-3, dan 10-5 disebar ke cawan petri yang
telah berisi media padat yang spesifik untuk masing-masing bakteri. Suspensi bakteri yang
telah disebar dapat diratakan dengan beberapa cara, diantaranya adalah menggoyangkan
cawan secara horizontal dengan pola angka 8, menggunakan 20 butir glass bead yang
dimasukkan ke dalam cawan petri dan digoyang secara horizontal dengan cepat, atau
menggunakan segitiga penyebar (spreader).
Teknik Pemurnian
Pada tahap pemurnian dimulai dengan memilih koloni-koloni bakteri. Mensterilkan jarum ose
bulat, lalu disentuhkan pada permukaan koloni bakteri kemudian diinokulasikan pada permukaan
medium yang sama dengan media pertumbuhan bakteri dengan metode kuadran. Diinkubasikan pada
suhu 370C selama 2x24 jam. Tahap pemurnian dapat dilakukan 2-3 kali, untuk lebih menyakinkan
bahwa koloni yang terbentuk benar-benar murni atau tidak. Pemurnian ini dilakukan dengan tujuan
memisahkan bakteri target dari kontaminan yang kemungkinan tumbuh di media. Selain itu, proses ini
juga dilakukan dengan tujuan meremajakan bakteri agar berada dalam kondisi optimum untuk
pengujian-pengujian selanjutnya.
2. Pengamatan Morfologi Bakteri
Pada pengamatan morfologi setiap koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian
kemudian diamati. Pengamatan yang dilakukan meliputi bentuk koloni, warna koloni, tepi
koloni, pusat koloni, diameter koloni, morfologi permukaan koloni, serta morfologi sel dan sifat
gram bakteri dilakukan untuk mengelompokkan isolat yang diperoleh.
a) Pewarnaan gram
Pengamatan morfologi sel dilakukan dengan teknik pewarnaan gram. Pertama-tama
ulasan bakteri dibuat pada gelas objek dan ditambahkan ddH2o diaduk dan dilakukan fiksasi
15x bolak balik. Sebanyak

1 tetes cat A (kristal violet) diteteskan pada koloni bakteri,

diamkan selama 1 menit. Kemudian preparat dibilas dengan menggunakan air mengalir lalu

dikeringanginkan. Sebanyak

tetes cat B (larutan Iodin) diteteskan di atas preparat dan

dibiarkan selama 1 menit. Preparat dibilas dengan air mengalir lalu dikeringanginkan. Preparat
kemudian ditetesi

tetes larutan cat C (ethyl alkohol) dan dibiarkan selama 30 detik lalu

dicuci kembali dan dikeringanginkan. Selanjutnya preparat ditetesi dengan larutan cat D
(safranin) sebanyak

tetes dan didiamkan selama 10 detik, lalu dicuci dan dikeringanginkan.

Setelah itu diamati di bawah mikroskop.


b) Uji Gram dengan Uji KOH 3%
Object glass disiapkan dan ditetesi dengan KOH 3%. Koloni isolat hasil isolasi yang
berumur 24 jam diambil sebanyak satu lup kemudian disuspensikan pada larutan KOH 3% yang
telah diteteskan pada object glass. Campurkan dengan cara mengaduk-aduk isolat dalam larutan
KOH 3%. Angkat lup dan amati reaksi yang terjadi. Jika campuran menjadi lengket,
menunjukkan bahwa bakteri yang diuji merupakan gram negatif. Sedangkan apabila tidak
lengket, berarti bakteri yang diuji merupakan gram positif.
c) Pengecatan Endospora
Pewarnaan spora dilakukan pada bakteri basil yang bersifat gram positif. Uji ini
digunakan untuk mengetahui spora pada bakteri halofilik. Metode yang digunakan adalah
metode Schaeffer-Fulton yaitu olesan bakteri dari biakan murni difiksasi pada kaca obyektif
steril, digenangi dengan Malachite green 5% (w/v dalam H2O) dan diletakkan pada hot plate
yang sudah dipanaskan hingga 200C, selama 10 menit. Setelah 10 menit, kaca obyek
didinginkan kemudian dibersihkan dengan air mengalir. Olesan bakteri digenangi dengan
safranin 0,5 %(w/v dalam H2O) selama 1 menit dan dicuci dengan air mengalir. Kaca obyek
ditiriskan dan sisa air diserap dengan kertas serap kemudian diamati di bawah mikroskop.
Warna spora adalah hijau atau tampak refraktil (Hadioetomo, 1993).
3. Uji Fisiologi Bakteri
a) Uji Anaerob
Media pengujian Anaerob dipersiapkan dalam tabung reaksi. Isolat bakteri yang diuji
diinokulasikan dengan cara mengambil koloni bakteri dari media padat menggunakan jarum
preparat dan menusukkan secara tegak lurus pada media sekitar

5 mm .Proses inokulasi

dilakukan pada dua tabung. Tabung pertama ditambahkan 0,5 ml glukosa dan minyak parafin 1
cm kemudian ditutup dengan alumunium foil kembali. Tabung yang kedua tanpa minyak
parafin, kemudian masing masing diinkubasikan pada suhu ruang selama 24 jam. Hasil positif
ditandai dengan perubahan warna medium dari hijau menjadi kuning.
b) Uji Reaksi Hipersensitif
Semua isolat bakteri yang diperoleh, diuji hipersensitif, untuk mengetahui apakah isolat
tersebut patogen tumbuhan ato bukan. Sebanyak satu ose isolat bakteri yang diuji
diinokulasikan pada 5 ml media LB cair di dalam tabung reaksi. Kemudian shaker dengan
kecepatan 80 rpm selama 24 jam. 1 ml suspensi bakteri diambil menggunakan jarum suntik
steril yang telah dilepas bagian jarumnya. Suspensi bakteri diinjeksikan dari bagian bawah daun
tembakau, sedangkan suspensi bakteri Ralstonia solanacearum diinjeksikan pada bagian batang
tanaman tomat. Bagian yang diinjeksi suspensi bakteri diberi label kode isolat bakteri yang
diuji. Hasil injeksi diamati setelah 1-3 hari. Reaksi positif yang berarti bakteri tersebut bersifat
patogenik ditunjukkan dengan adanya bercak nekrosis pada bagian yang diinokulasikan dengan
suspensi bakteri, sebaliknya reaksi negatif terjadi bila warna daun tetap hijau.

Penyimpanan
Penyimpanan bakteri dapat dilakukan dua langkah. Langkah pertama dengan menggunakan air
steril, setiap koloni tunggal dari masing-masing isolat bakteri setelah murni kemudian diinokulasi pada
air steril didalam tube sebanyak 1 ml kemudian divorteks dan disimpan pada suhu ruang. Langkah
kedua dengan menggunakan gliserol 80%, koloni bakteri diinokulasikan pada media LB dishaker
selama 24 jam selanjutnya 500 l suspensi di masukkan kedalam 500 l gilserol 80% di vortex dan
disimpan pada suhu -200C.
4. Deteksi dan Identifikasi Bakteri dengan Teknik Molekuler Berbasis Asam Nukleat
a) Ekstraksi DNA Bakteri
Proses ekstraksi DNA bakteri dilakukan dengan metode Leach et al (1992). Sebanyak 11,5 ml kultur cair masing-masing bakteri dimasukkan ke dalam tabung eppendrof kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 5-10 menit pada suhu 25oC. Hasil pelet yang
diperoleh dipisahkan dengan media cair dan dicuci emnggunakan aquades steril.
Pelet yang telah disiapkan kemudian disuspensikan dengan 250 l buffer TE (5 mg/ml
lysozim) dan diinkubasi pada suhu 37 oC dalam shaker water bath selama 30 menit Setelah itu,
suspensi ditambah dengan 50 l SDS 10 %, dicampur perlahan dengan membolak-balikkan
tabung eppendrof lalu diinkubasi di dalam shaker water bath pada suhu 37 oC selama 60 menit.
Suspensi kemudian ditambah 65 l 5M NaCl dan 80 l CTAB-NaCl dicampur perlahan dengan
membolak-balikkan tabung eppendrof dan diinkubasi kembali dengan suhu 65oC selama 20
menit. Setelah diinkubasi, sebanyak 450 l C:I (24:1) ditambahkan ke dalam suspensi kemudian
dikocok dengan menggunakan tangan selama 30 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan
11.000 rpm selama 20 menit.
Hasil sentrifugasi akan membentuk tiga lapisan yang terdiri dari larutan C:I pada lapisan
terbawah, debris sel pada lapisan atas, dan lapisan epifase yang berisi DNA pada lapisan teratas.
Larutan epifase diambil dan dipindahkan ke dalam tabung eppendrof baru kemudian
dipresipitasi dengan menambahkan 400 l larutan isopropanol dingin (suhu -20 oC) lalu
diinkubasi selama minimal 30 menit pada suhu -20 oC. DNA hasil presipitasi disentrifugasi pada
kecepatan 12 000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang
sedangkan pelet yang terbentuk dicuci menggunakan 800 l ethanol dingin 70% (suhu -20 oC)
lalu disentrifugasi kembali selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4 oC.
Etanol kemudian dibuang dan pelet DNA dikeringanginkan selama 1 malam pada suhu ruang.
Pelet DNA yang tersebut dilarutkan dengan 30 l bufer TE dan disimpan pada freezer bersuhu
-20 oC.
b) Teknik Polymerase Chains Reaction
Amplifikasi DNA
Bakteri hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan primer Bahan disiapkan yang
terdiri dari : Buffer PCR, dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP ), MgCl 2, Tag Pol bahan tersebut di
campur dan dijadikan sebagai Dream TagGreen PCR Master, Primer XoR F(10pmol/ l),
Primer XoR R2 (10pmol/ l), Templet (DNA) sebanyak 50ng, dan ddH2O 95l,PF 12 l, TR 12
l, dan ddH2O 114 l dicampurkan dalam 1 tabung. Template DNA sampel dimasukan kedalam
tabung eppendorf sebanyak 1 l, lalu ditambahkan larutan pada prosedur nomor sebanyak 24
l. Sampel dimasukan kedalam mesin PCR selama 3,5 jam dengan mengulang 35 siklus.
Komponen yang diperlukan dalam proses PCR dimasukkan ke dalam tabung eppendrof
1,5 ml pada kondisi dingin. Selanjutnya, DNA template sebanyak 1 l di masukkan ke dalam
tabung PCR. PCR mixture ditambahkan ke dalam tabung PCR masing-masing sebanyak 24
l/tabung. Tabung dimasukkan ke dalam mesin PCR. Proses amplifikasi PCR dengan primer
universal terdiri dari tiga tahapan reaksi yang berulang dalam beberapa siklus yaitu denaturasi

pada suhu 95 oC selama 2 menit dan dilakukan dengan 35 siklus, annealing pada suhu sekitar
63 oC selama 30 detik, Ekstensi pada suhu 72 oC selama 1 menit dan ekstensi akhir pada suhu
yang sama selama 7 menit. Sedangkan proses amplifikasi PCR menggunakan primer spesifik
dilakukan dengan denaturasi pada suhu 95 oC selama 2 menit, dan dilakukan dengan 29 siklus
pada pada suhu 95 oC selama 30 detik, annealing pada suhu sekitar 63 oC selama 30 detik,
ekstensi pada suhu 72 oC selama 1 menit dan ekstensi akhir pada suhu yang sama selama 7
menit.
Visualisasi DNA Hasil PCR.
Bahan (agarose 1%) disiapkan yang terdiri dari 2 gr agarose, dan 20ml buffer TAE 2x
dimasukkan ke dalam gelas beker dan dipanaskan selama 3 menit atau sampai larutan tersebut
menjadi bening dan didiamkan selama 3 menit. Pada gel agarose dibuat sumuran dengan sisir
sesuai jumlah DNA yang ingin divisualisasi dan ditambahkan 5 l DNA kemudian direndam
dengan larutan EtBr selama 10 menit. Visualisasi dilakukan dengan menggunakan mesin
elektroforesis selama 30 menit pada tegangan 70 volt dan hasilnya dilihat dengan menggunakan
transluminator UV.
5. Uji Antagonisme Bakteri Agens Hayati
Metode Cross Streak
Uji antagonisme dengan metode cross-streak dengan beberapa modifikasi antara isolat
aktinomiset (kandidat agens hayati) dengan Spesies 1, Xanthomonas oryzae pv. oryzae,
Ralstonia solanacearum, Erwinia sp. dan Xanthomonas campestris pv campestris pada media
NA. Isolat aktinomiset yang diujikan digores pada satu sisi cawan seluas sepertiga cawan.
Aktinomiset diinkubasi hingga tumbuh selama 3 hari agar menghasilkan senyawa metabolit
sekunder atau antibiotik yang akan berdifusi ke media agar. Setelah 3 hari, bakteri patogen
digoreskan pada sisi cawan yang kosong sepanjang 3 cm dengan arah tegak lurus terhadap
goresan isolat aktinomiset dan diinkubasi hingga tumbuh. Isolat aktinomiset yang berpotensi
antagonis akan ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambatan dimana bakteri patogen yang
digores tidak tumbuh.
Metode Paper Disck Diffusion
Uji aktivitas antibiosis dengan metode pengujian paper disck diffusion. Isolat bakteri
yang akan diuji (kandidat agen hayati) yaitu bakteri patogen Spesies 1, Xanthomonas oryzae pv
oryzae, Ralstonia solanacearum, Erwinia dan Xanthomonas campestris pv campestris
ditumbuhkan pada media cair selama 12 jam. Sebanyak 10 L bakteri patogen disebar pada
media NA. Isolat cair bakteri kandidat agens hayati sebanyak di atas kertas saring pada media
NA yang telah disebari bakteri patogen tersebut. Zona bening (zona hambatan pertumbuhan)
yang terbentuk mengindikasikan adanya reaksi antagonis antara bakteri uji (kandidat agens
hayati) dengan bakteri patogen. Pengamatan dan pengukuran terhadap zona bening dilakukan
setelah 24 dan 48 jam inkubasi. Tingkat penghambatan pertumbuhan patogen dihitung dengan
pengukuran diameter zona bening menggunakan rumus:
Daya hambat (%) =
6. Kurva Pertumbuhan Bakteri
Isolat E.coli diremajakan pada media LB dan diinkubasi selama 48 jam. Setelah
diinkubasi, sebanyak 1 lup isolat diinokulasikan ke media LB. Isolat bakteri pada LB diinkubasi
pada shaker selama 24 jam. Kemudian, pengamatan OD dilakukan setiap 1 jam sampai 7 jam.
Nilai OD yang terukur kemudian dicatat dan dibuat kurva pertumbuhan. Pada pengamatan ke 1

dan 7 jam, biakan E.coli dilakukan plating sebnyak 2 kali ulangansetiap fase pertumbuhan,
yang diinokulasikan pada media LA untuk melihat perkembangan jumlah koloni.
7. Teknik Penularan Fitoplasma
Disiapkan tanaman kacang tanah sehat, tanaman kacang yang bergejala sapu setan
diambil dari lapangan. Pada tanaman kacang tanah yang sehat dibuat sayatan pada cabang
tanaman. Tanaman kacang tanah yang bergejala di potong tipis pada bagian yang bergejala
fitoplasma. Sayatan yang telah dibuat ditempelkan dengan potongan tipis dari tanaman yang
terserang fitoplasma. Bagian yang telah ditempel dibungkus dengan seal.

HASIL DAN PEMBAHASAN


1. Pengamatan gejala pada tanaman inang dan hasil uji hipersensitif
Tabel 3. Gejala penyakit akibat infeksi bakteri serta hasil uji hipersensitif pada tanaman tembakau

Tanaman
Timun
(Daun)

Bakteri yang
diisolasi
Pseudomonas
syringae pv.
glycinea

Foto dan deskripsi gejala

Bercak nekrotik bersudut pada permukaan atas


daun disertai dengan halo berwarna kuning terang

Kubis
(Daun)

Padi
(Daun)

Foto koloni

Warna: Putih kekuningan


Tepian: Bergelombang
Elevasi: Cembung

Xanthomonas
campestris pv.
campestris

Bercak nekrotik coklat terang dimulai dari tepi


daun dan membentuk huruf V

Warna: Kuning terang


Tepian: Licin
Elevasi: Cembung

Bercak berwarna kuning terang dimulai dari tepi


daun dan memanjang di sepanjang tulang daun
mulai dari tepi

Warna: kuning pucat


Tepian: Licin
Elevasi: Cembung

Xanthomonas
oryzae pv.
oryzae

Wortel
(Buah)

Leunca
(Batang)

Pelepah
pisang
(Pelepah)

Erwinia
carotovora

Terdapat lendir kecoklatan di pangkal crop kubis


membentuk busuh kebasahan. Busuk basah
tersebut dapat meluas ke bagian tengah crop.

Warna: Krem kekuningan


Tepian: Undulate
Elevasi: Cembung

Tanaman layu tidak diawali dengan penguningan.


Layu dimulai dari bagian ujung daun dan daun
rontok.

Warna: Merah tua


Tepian: Licin
Elevasi: Cembung

Ralstonia
solanacearum

Bakteri endofit

Warna: Putih kekuningan


Tepian: Begelombang
Elevasi: Rata pada tepid an
menonjol di tengah

Tanah

Aktinomiset

Warna: Putih
Tepian: Bersetae di seluruh
sisinya
Elevasi: Datar
Bakteri yang diisolasi diambil dari tanaman yang menunjukkan gejala khas yang diakibatkan bakteri patogen tertentu.
Sastrahidayat (2011) menyatakan bahwa hawar daun bakteri (bacterial leaf blight) disebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv. oryzae
memiliki ciri koloni berwarna kuning jerami sampai kuning dengan pertumbuhan koloni yang lambat. Gejala awal ditandai dengan
adanya tetesan-tetesan air kental dipermukaan ujung dan tepi daun yang merupakan masa bakteri pada tanaman muda setelah tanam.
Bila kondisi mendukung maka akan terbentuk bercak-bercak besar memanjang dari ujung daun ke pangkal daun yang berwarna kuning.
Luka akan berkembang (membesar) menyerupai tepung keputihan. Patogen akan masuk daun melalui lubang alami seperti hidatoda atau
luka dan akan cepat meluas khususnya pada musim penghujan karena masa bakteri yang jatuh akan mudah disebarkan melalui
pengairan. Infeksi sistemik yang dikenal sebagai kresek terjadi karena jaringan daun mengering dan mati, khususnya pada tanaman
muda. Sementara pada tanaman yang tua, daun akan menguning dan mati. Pada fase selanjutnya penyakit akan sulit dibedakan dengan
gejala bacterial leaf streak. Untuk mengujinya dapat dilakukan dengan cara memotong bagian bawah daun terinfeksi dan merendamnya
dalam larutan basic fuchsin selama 1-2 hari.
Hasil praktikum menunjukkan bahwa warna koloni Erwinia carotovora berwarna putih susu yang semakin lama disimpan
menjadi warna krem. Hasil praktikum memiliki kesamaan dengan pengamatan yang dilakukan Sallytha et al., (2014) yang menyatakan
dalam jurnalnya yakni koloni Erwinia carotovora berwarna putih susu, berlendir, mengkilat, tepi rata dan tampak cembung setelah
diinkubasi selama 24 jam. Holt et al. (1994) dalam Sallytha et al., (2014) menyatakan bahwa kelompok Actinomycetes membentuk
miselium bercabang setelah 24 jam pada media agar dan koloni mulai tampak setelah 3-4 hari sedangkan spora pada aerial miselium
dapat terbentuk setelah 7-14 hari. Cook and Baker (1974) dalam Sallytha et al., (2014), menambahkan bahwa koloni Actinomycetes
tumbuh sangat lambat, meski tumbuh lambat Actinomycetes mampu membentuk spora tahan didalam tanah dan juga memiliki
kemampuan menghasilkan antibiotik. Seperti dinyatakan dalam jurnal Sallytha et al., (2014) bahwa pertumbuhan aktinomiset sangat
lambat. Hal ini juga terjadi didalam melalukan praktikum yang mana pertumbuhannya muncul pada hari ke 3-4 hsi (hari setelah isolasi).
Pertumbuhan awal aktinomiset pada medium perbanyakan yakni permukaan awalnya agak licin yang lama-kelamaan menyebabkan
permukaannya bertepung.

Hasil Uji Fisiologi


Tabel 4. Hasil uji pewarnaan gram dan KOH 3%

Bakteri

Hasil Dokumentasi

Uji pewarnaan gram

Uji KOH

Pseudomonas syringae pv. glycinea

Gram negatif ( - )

Berlendir

Xanthomonas campestris pv. campestris

Gram negatif ( - )

Berlendir

Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Gram negatif ( - )

Berlendir

Erwinia carotovora

Gram negatif ( - )

Berlendir

Ralstonia solanacearum

Gram negatif ( - )

Berlendir

Bakteri endofit

Gram positif ( + )

Tidak Berlendir

Aktinomiset

Gram positif ( + )

Tidak Berlendir

Bila dalam pengujian KOH 3% tidak ada pembentukan lendir lengket yang dapat terangkat lebih dari satu cm oleh jarum ose, kondisi
ini dikenal dengan reaksi negatif dan mikroba yang diuji tergolong Gram Positif (Lelliot and Stead, 1987 dalam Masnilah et al., 2013). Dari
ketujuh sampel bakteri, yang merupakan gram positif yakni isolat bakteri endofit dan isolat aktinomiset. Hal tersebut juga dapat dilihat dari
bentuk bakteri yang mana pada kelima sampel yakni Pseudomonas syringae pv. glyciniea, Xanthomonas campestris pv. campestris,
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Erwinia carotovora, dan Ralstonia solanacearum memiliki bentuk batang. Pada umumnya bakteri yang
bersifat patogen pada tanaman merupakan bakteri yang berbentuk batang.

Pewarnaan Gram digunakan untuk mengetahui morfologi bakteri dan membedakan antara
bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif. Jika dilihat di bawah mikroskop, bakteri Gram
positif akan berwarna ungu, karena dapat menahan kompleks pewarna primer karbol gentian
violetiodium sampai akhir prosedur pewarnaan. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena
kehilangan kompleks warna karbol gentian violetiodium dengan pembilasan alkohol, lalu terwarnai
oleh pewarna tandingan air fuksin (Cappucino, 1987). Lelliot dan Stead (1987) dalam Masnilah et al.
(2013) menyatakan bahwa kebanyakan bakteri pathogen bersifat gram negatif.
Perbedaan reaksi kedua golongan bakteri tersebut terhadap pewarnaan Gram disebabkan bakteri
Gram positif memiliki dinding sel tebal yang akan menyusut pada saat pembilasan alkohol, sehingga
pori-porinya menutup dan mencegah keluarnya kompleks pewarna primer pada saat pemucatan.
Berbeda dengan dinding sel bakteri Gram negatif yang mengandung banyak lipid yang larut dalam
alkohol pada saat pembilasan. Larutnya lipid memperbesar pori-pori dinding sel dan menyebabkan
proses pemucatan berlangsung cepat (Cappucino, 1987).

Gambar 1. Hasil uji oksidatif fermentatif (OF). (A) Endofit, (B) Aktinomiset, (C) Erwinia, (D) Pseudomonas.
(E) Xoo; (F) Ralstonia, (G) Xanthomonas.

Bakteri yang diisolasi

Hasil uji HR

Pseudomonas syringae pv. glycinea


Xanthomonas campestris pv. campestris
Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Erwinia carotovora
Ralstonia solanacearum
Bakteri endofit
Aktinomiset

+
+
+
+
-

Hasil uji OF
Anaerob
Aerob
(Fermentatif)
(Oksidatif)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Pada pengujian hipersensitif pada daun tembakau yang diinfiltrasikan dengan suspensi isolat
aktinomiset dan beberapa isolat bakteri endofit tidak menunjukkan terjadinya nekrosis pada jaringan
daun hingga 48 jam setelah inkubasi. Hal ini membuktikan bahwa isolat yang diuji bukan bakteri
patogen tanaman. Hal ini sesuai dengan pendapat Kerr and Gibb (1997) apabila bakteri yang diuji
berupa bakteri patogen maka akan terjadi nekrosis pada daun tembakau, dimana terjadi hubungan yang
kompatible antara patogen dan tembakau. Apabila suspensi bakteri yang diinfiltrasikan pada daun
tembakau tidak merangsang respon hipersensitif maka dapat digunakan sebagai inokulan untuk pemacu
pertumbuhan tanaman (Lelliot and Stead, 1987).

Reaksi hipersensitif menyebabkan hancurnya seluruh membrane seluler dari sel-sel yang
berkontak dengan bakteri dan kemudian diikuti dengan pengeringan dan nekrosis jaringan daun yang
terserang bakteri tersebut (Agrios, 2004). Adanya reaksi positif ini membuktikan bahwa bakteri yang
diuji merupakan pathogen tanaman.
Isolat Ralstonia solanacearum tidak dilakukan uji hipersensitif pada tanaman tembakau. Akan
tetapi diuji pada tanaman tomat yang merupakan tanaman sefamili dengan tanaman leunca. Diduga
karena adanya perbedaan strain bakteri yang menyerang leunca dan tomat, dan juga daya infeksi
bakteri menurun pada saat direisolasi. Selain itu, isolat R. solanacearum tersebut merupakan bakteri
yang menyerang bagian pembuluh tanaman sehingga dampak yang akan ditimbulkan keduanya bukan
terjadinya nekrosis tetapi layu pada tanaman. Berdasarkan Wijiono (2009) menyatakan b akteri R.
solanacearum terangkut dalam pembuluh kayu dan pada batang yang lunak, masuk dalam ruang antar
sel dalam kulit dan empulur, yang kemudian menguraikan sel-sel sehingga terjadi rongga-rongga.
Berdasarkan hasil uji, semua isolat bakteri yang diuji memberikan reaksi positif pada pengujian
oksidatif-fermentatif (OF) (Gambar 1.). Dari hasil uji tersebut berarti semua isolat mampu
memetabolisme karbohidrat secara fermentatif. Ini ditandai dengan perubahan pada medium OF yang
ditutup paraffin ataupun tidak ditutup paraffin, medium yang awalnya hijau berubah menjadi kuning
(Priharta, 2008).
Reaksi positif ditandai dengan perubahan warna hijau menjadi kuning yang dimulai dari
permukaan media yang tidak tertutup minyak paraffin ataupun yang tertutupi parafin setelah masa
inkubasi 7-14 hari. Berbeda dengan deskripsi Lelliot dan Stead (1987) dan Asrul (2007) dalam
Masnilah (2013) bahwa Pseudomonas syringae pv. glycinea bereaksi positif pada uji oksidatif dan
bereaksi negatif pada uji fermentatif. Reaksi positif pada uji oksidatif membuktikan bahwa P. syringae
pv. glycinea membutuhkan oksigen untuk tumbuh dan memproduksi asam dalam kondisi aerob,
sehingga bakteri termasuk dalam golongan bakteri aerob (Fahy dan Haywar, 1983 dalam Masnilah,
2013). Sedangkan reaksi positif pada uji fermentatif kemungkinan bisa diakibatkan adanya kontaminasi
ataupun bahan-bahan dalam pembuatan media uji sudah tidak dalam kondisi yang optimum atau
bahkan bisa saja akibat kesalahan pengerjaan waktu pengujian.
Berdasarkan literatur dari Sastrahidayat (2011), berikut sifat-sifat penting dari beberapa genus
bakteri penyebab penyakit tumbuhan.
Tabel 5. Sifat penting dari beberapa genus bakteri penyebab penyakit tumbuhan

Indikator
Reaksi gram
Oksidasi/fermentatif

Erwinia
Fermentatif

Genus bakteri
Pseudomonas
Oksidasi

Xanthomonas
Oksidasi

Jika pada medium yang ditutup yang ditutup paraffin tetap berwarna hijau, sedangkan yang
tidak ditutup paraffin warna mediumnya berubah menjadi kuning berarti bakteri uji mampu
memetabolisme karbohidrat secara oksidasi (Priharta, 2008). Berbeda pada beberapa isolat bakteri,
seperti pada kelompok Pseudomonas dan Xanthomonas yang disebutkan dibeberapa literatur
menyatakan bahwa merupakan oksidasi akan tetapi pada hasil praktikum menghasilkan fermentatif.
Ada beberapa faktor penyebab hasil praktikum berbeda dengan yang ada di literatur, antara lain
diakibatkan adanya kontaminasi ataupun bahan-bahan dalam pembuatan media uji sudah tidak dalam
kondisi yang optimum atau bahkan bisa saja akibat kesalahan pengerjaan waktu pengujian.
Pewarnaan spora digunakan untuk mengamati endospora bakteri. Endospora hanya terbentuk
dalam lingkungan yang tidak menguntungkan, seperti kekurangan nutrisi. Bentuk ini tahan terhadap
pemanasan dan unsur-unsur fisik lain, seperti pembekuan, kekeringan, radiasi ultraviolet serta bahanbahan kimia yang dapat menghancurkan sel bakteri. Bila keadaan lingkungan kembali menjadi baik,

maka dinding endospora akan pecah dan bakteri membentuk sel vegetatif kembali (Cappucino, 1987
dalam Sulistiyaningsih, 2008).
Dari hasil praktikum pengujian pewarnaan endospora dilakukan pada 9 isolat bakteri endofit
dan 1 isolat aktinomiset. Kesepuluh isolat tersebut, pada isolat bakteri endofit yang ada endosporanya.
Sedangkan pada aktinomiset endosporanya tidak terlihat. Endospora merupakan bentuk kehidupan
yang paling resisten, sehingga mampu bertahan dalam debu dan tanah selama bertahun-tahun
Ketahanan endospora disebabkan adanya selubung spora yang keras dan tebal. Untuk dapat mewarnai
endospora, diperlukan pemanasan agar pewarna dapat menembus selubung spora. Jika pewarna
tersebut sudah memasuki endospora, maka pewarna tersebut akan sulit dihilangkan (Denyer, 2004
dalam Sulistiyaningsih, 2008).
Hasil uji antagonis bakteri antagonis dengan bakteri patogen
Tabel 6. Hasil uji antagonis bakteri patogen dengan aktinomiset menggunakan metode cross streak
Hasil dokumentasi
Bakteri

Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Ralstonia solanacearum

Xanthomonas campestris pv. campestris

Erwinia carotovora

Pseudomonas syringae pv. glyciniea

Berdasarkan hasil praktikum terlihat bahwa mekanisme antagonis pengujian aktinomiset


terhadap kelima patogen yang diujikan ialah mekanisme parasitisme. Aktinomiset yang sudah
memparasit patogen uji menyebabkan patogen uji tidak mampu untuk tumbuh di media buatan.
Menurut Djatmiko (1997), kemampuan antagonis dalam menekan patogen in vitro karena pada kondisi
laboratorium antagonis hanya berhadapan dengan patogen dan ada pada lingkungan yang kaya nutrisi
sehingga mampu memunculkan kemampuannya dalam menghambat patogen.
Isolat aktinomiset ini berpotensi untuk digunakan sebagai agen pengendali patogen tumbuhan.
Hal ini dikarenakan dari hasil uji antagonis sudah dibuktikan mampu menekan pertumbuhan patogen
dalam media buatan. Menurut Anugrahwati (2011), aktinomiset mengeluarkan antibiotik yang peka
terhadap bakteri gram negatif.

Tabel 7. Hasil uji antagonis bakteri patogen dengan bakteri endofit menggunakan metode paper disk diffusion

Bakteri

Hasil dokumentasi

Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Ralstonia solanacearum

Xanthomonas campestris pv. campestris

Erwinia carotovora

Menurut Tortora dkk, (2001) dalam Utami (2005), pengujian aktivitas bahan antimikroba secara
in vitro dapat dilakukan melalui metode difusi cakram. Prinsip dari metode difusi cakram adalah
menempatkan kertas cakram yang sudah mengandung bahan antimikoba tertentu pada medium
lempeng padat yang telah dicampur dengan isolat yang akan diuji. Medium ini kemudian diinkubasi
pada suhu 37C selama 18-24 jam. Selanjutnya diamati adanya area (zona) jernih disekitar kertas
cakram. Daerah jernih yang tampak di sekeliling kertas cakram menunjukkan tidak adanya
pertumbuhan mikroba. Isolat yang sensitif terhadap bahan antimikroba akan ditandai dengan adanya

daerah hambatan disekitar cakram, sedangkan isolat yang resisten terlihat tetap tumbuh pada tepi kertas
cakram.
Antibiotik yang dihasilkan mikrorganisme termasuk dalam hal ini bakteri endofit, dalam
melakukan kerjanya menghambat mikroorganisme lain menurut Suwandi (1992) dalam Diniyah (2010)
terdapat 4 jalur, yaitu: menghambat sintesis dinding sel, menghambat fungsi selaput sel, menghambat
sintesa protein dan menghambat sintesis asam nukleat.
Berbeda pada hasil uji antagonis menggunakan paper disk, 9 isolat bakteri endofit tidak mampu
menghasilkan zona hambat/bening pada media yang sudah diberi masing-masing isolat patogen. Hal ini
diduga karena sifat antagonis dari masing-masing isolat bakteri endofit sudah menurun akibat sering
dilakukan pemurnian/purifikasi. Tidak menutup kemungkinan pemurnian yang dilakukan terlalu sering
dalam media biakan menyebabkan bakteri sudah menurun tingkat antagonisnya. Selain itu, faktor lain
yang menyebabkan lemahnya sifat antagonis bakteri endofit karena memang bakteri endofit tersebut
memiliki sifat antagonis yang lemah (sifat gennya). Menurut Stobel (2002) dalam Diniyah (2010),
terbentuknya zona hambat juga dapat dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan bakteri uji yang
berlebihan sehingga pengaruh metabolit yang dihasilkan oleh bakteri endofit tidak signifikan terhadap
pertumbuahan bakteri R. Solanacearum.
Deteksi Berbasis Asam Nukleat dengan PCR

10

Gambar 2. Hasil PCR dari ekstraksi DNA bakteri uji dengan primer general bakteri. (1) Xanthomonas
oryzae pv. oryzae, (2) Ralstonia solanacearum, (3) Gagal, (4) Endofit, (5) Gagal, (6)
Gagal, (7) Aktinomiset, (8) Erwinia carotovora, (9) X. campestris pv. campestris, (10)
Pseudomonas syringae pv. glycinae.
Dari hasil visualisasi terlihat bahwa hasil elektroforesis menunjukkan sampel positif yaitu
dengan terbentuknya pita DNA berukuran 476 bp yang divisualisasi dengan elektroforesis gel agarose.
Pada Gambar 2. Terlihat bahwa marker yang digunakan merupakan marker 100 bp dengan pita
amplifikon yang dihasilkan sekitar 500 bp. Kontrol positif yang digunakan merupakan isolat murni
Xoo koleksi laboratorium dengan ukuran 476 bp dan kontrol negatif menggunakan air. Amplifikasi gen
16S rRNA menghasilkan pita DNA berukuran 1500 bp. Analisis sequens gen 16S rRNA isolat uji
menunjukkan adanya kemiripan dengan bakeri X. oryzae pv. oryzae. Pita yang tebal tersebut
menunjukkan bahwa gen 16SrRNA isolat teramplifikasi dengan baik. Hal ini dapat disebabkan oleh
beberapa faktor yang mempengaruhi PCR, optimasi amplifikasi PCR dari DNA tiap isolat dan
kesesuaian primer yang digunakan.
Berdasarkan hasil visualisasi, tidak semua sampel teramplifikasi dengan baik. Hal ini diduga
karena konsentrasi dari ekstraksi DNA yang terlalu tinggi atau terlalu rendah. Bahkan tidak adanya pita

yang tervisualisasi disebabkan DNA total yang tidak ada atau DNA total yang terdegradasi pada saat
dilakukannya proses ekstraksi DNA. Hasil visualisasi dari elektroforesis menjadi panduan untuk
dilakukannya metode PCR (Plymerase chain reaction). Apabila DNA bakteri diamplifikasi dengan
teknik PCR menggunakan pasangan primer general 27F dan 1492R maka akan menunjukkan hasil
yang positif. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya pita DNA berukuran 1500. Berdasarkan
hasil visualisasi terlihat bahwa pada semua sampel DNA yang dianalisis terdapat pita DNA berukuran
1500 bp (Suryadi 2014).
Dari hasil visualisasi menggunakan primer spesifik untuk Xoo. Pita pada urutan no 1
merupakan ekstraksi DNA dari sampel tanaman yang bergejala Xoo. Terlihat warna terang pada sampel
Xoo yang mana menandakan bahwa kromosom dari Xoo terdeteksi menggunakan primer spesifik.
Penggunaan primer spesifik Xoo sangat membantu untuk identifikasi HDB dalam jumlah sangat
banyak (Tasliah, 2013).
Penularan fitoplasma
Tabel 8. Tahapan penularan fitoplasma melalui grafting

Pemotongan bagian tanaman


kacang tanah yang terinfeksi
fitoplasma

Batang tanaman sehat dipotong


miring kemudian dibelah 2

Gejala umum serangan fitoplasma


belum terlalu nampak dengan jelas
tapi dapat dilihat daun kacang
pertumbuhannya
sangat
lama
setelah dilakukan penyambungan
dengan tanaman yang terserang
fitoplasma.

Bagian tanaman yang sakit


disisipkan pada potongan batang
tanaman yang sehat dan direkatkan
dengan seal

Berdasarkan hasil praktikum, diperoleh hasil bahwa penularan tanaman kacang yang terinfeksi
fitoplasma ke tanaman kacang yang sehat tidak berhasil. Penyebaran melalui teknik grafting
merupakan penyebaran yang sulit dilakukan mengingat dalam teknik grafting hanya sedikit tingkat
keberhasilannya. Teknik grafting yakni teknik yang digunakan untuk menempelkan antar mata tunas
tanaman. Bila kedua mata tunas dapat menempel dengan sempurna maka fitoplasma yang ada
dijaringan tanaman juga akan ikut terbawa ke tanaman yang dijadikan grafting.
Penyebaran melalui teknik grafting tidak begitu penting (Nicolaisen, 2001). Penyebaran
fitoplasma dari tanaman ke tanaman lainnya biasanya tergantung vektor serangga. Penyebaran melalui
vektor serangga, seperti wereng dan kutu merupakan penyebaran yang efektif dan tidak membutuhkan
waktu yang lama.

Nilai OD

Kurva Pertumbuhan Bakteri

Waktu Inkubasi (jam)


Terlihat dari hasil kurva pertumbuhan bakeri dari jam pertama hingga jam kesembilan kurva
terus mengalami kenaikan, baik pada OD 1 maupun OD 2. Kenaikan tertinggi pada 9 jam setelah
inkubasi pada OD 2, sedangkan pada OD 1 hanya mengalami sedikit kenaikan. Pada jam pertama
merupakan fase lag, yakni fase dimana adaptasi bakteri terhadap media perkembangbiakannya untuk
menyesuaikan dengan kondisi lingkungan disekitarnya. Lama fase adaptasi ini dipengaruhi beberapa
faktor seperti medium (lingkungan pertumbuhannya) dan jumlah inokulum. Jika medium dan
lingkungan pertumbuhan sama seperti medium dan lingkungan sebelumnya, mungkin tidak diperlukan
waktu adaptasi. Tetapi jika nutrient yang tersedia dan kondisi lingkungan yang baru berbeda dengan
sebelumnya, diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesa enzim-enzim. Tak hanya itu, Jumlah
awal sel yang semakin tinggi akan mempercepat fase adaptasi.
Fase selanjutnya yakni fase log atau pertumbuhan eksponensial. Tidak butuh waktu yang lama
bakteri untuk melakukan pembelahan diri/memperbanyak dirinya, sehingga kemungkinan setelah 1 jam
waktu inkubasi, sudah terjadi pembelahan sel dan fase log ini sudah terjadi. Pada fase ini kecepatan
pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh medium tempat tumbuhnya seperti pH dan kandungan nutrient,
juga kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara. Pada fase ini mikroba membutuhkan
energi lebih banyak dari pada fase lainnya.

Dilihat dari grafik yang terus naik, bahwa sampai 9 jam setelah inkubasi belum menunjukkan
adanya bentuk kurva yang stabil atau belum terjadi fase stationer. Hal ini menyebabkan populasi
bakteri dalam media terus menerus mengalami pembelahan dan kepadatan popolasinya terus
meningkat. Pada OD 1 terlihat antara 8-9 jam setelah inkubasi grafik sudah cenderung tidak mengalami
peningkatan yang signifikan, tetapi belum bisa dikatakan bahwa pertumbuhannya stabil.
KESIMPULAN
Kesimpulan dari hasil kegiatan praktikum pada pengamatan gejala penyakit adalah diperoleh
beberapa bakteri patogen tanaman, seperti Pseudomonas syringae pv. glycinea yang diisolasi dari daun
timun, Xanthomonas campestris pv. campestris diisolasi dari kubis, X. oryzae pv. oryzae diisolasi dari
daun padi, Erwinia carotovora diisolasi dari umbi wortel, dan Ralstonia solanacearum diisolasi dari
tanaman leunca, sedangkan untuk bakteri non patogen diisolasi dari pelepah pisang dan tanah disekitar
perakaran tumbuhan bambu. Dari ketujuh isolat tersebut kemudian diuji untuk mengetahui kemampuan
fisiologis dan antagonisnya. Pseudomonas syringae pv. glycinea, X. campestris pv. campestris, X.
oryzae pv. oryzae, Erwinia carotovora dan Ralstonia solanacearum merupakan gram negatif,
sedangkan 9 isolat bakteri endofit dan 1 isolat aktinomiset merupakan gram positif. Pada aktinomiset
tidak ditemukan sel endospora. Dari uji fisiologis bakteri, semua isolat bakteri uji dapat tumbuh secara
aerob dan anaerob sehingga secara positif menunjukkan reaksi oksidatif-fermentatif. Selain itu, pada uji
antagonis aktinomiset mampu menekan perkembangan patogen sehingga berpotensi sebagai agens
hayati. Berbeda pada semua isolat bakteri endofit yang mana tidak ada satupun yang mampu
menghasilkan zona hambat/bening. Penularan fitoplasma dengan teknik grafting tidak berhasil. Dari
kurva pertumbuhan bakteri terlihat bahwa sampai 9 jam setelah inkubasi, sampel bakteri 1 dan 2 masih
terus mengalami kenaikan pertumbuhan bakteri.

DAFTAR PUSTAKA
Agrios GN. 2004. Plant Pathology. Fifth Edition. San Diego, California: Academic Press.
Anonymous. 2016. http://elisa.ugm.ac.id/user/archive/download/29095/3cb158a7ad66675b2328c53a9
f552b4c. Available at 5 Januari 2016.
Diniyah, S. 2010. Potensi Isolat Bakteri Endofit sebagai Penghambat Pertumbuhan Bakteri (Ralstonia
solanacearum) dan Jamur (Fusarium sp. dan Phytopthora infestans) Penyebab Penyakit Layu
pada Tanaman. Universitas Islam Negeri Malang.
Masnilah, R; Abadi, L. A; Astono, H. T; Aini, Q. L. 2013. Karakterisasi Bakteri Penyebab Penyakit
Hawar Daun Edamame di Jember. Jurnal Ilmiah Pertanian. Vol 1 (1): 10-14.
Nicolaisen, M. 2001. Status quo of the knowledge on phytoplasma with the focus on Euphorbia
pulcherrima and other ornamental plants. Danish Institute of Agricultural Sciences, Department
of Plant Protection. Denmark.
Sallytha, M, A, A; Addy, S, H; Mihardjo, A, P. 2014. Penghambatan Actinomycetes Terhadap Erwinia
carotovora subsp. Carotovora Secara In Vitro. Berkala Ilmiah Pertanian 1(4): 70-72.
Sulistiyaningsih. 2008. Identifikasi Isolat Bakteri Penghasil zat Antibakteri dari Cairan Kantung Tanaman
Kantong Semar (Nepenthes ampullaria, Jack). Universitas Padjajaran. Bandung
Suryadi, Y et al. 2014. Analisis Keragaman Genetik Isolat Bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae dari
Jawa Barat dan Jawa Tengah Berdasarkan Analisis ARDRA Gen 16SrRNA. Jurnal Fitopatologi
Indonesia 10 (2): 53-60. DOI: 10.14692/jfi.10.2.53
Tasliah*, Mahrup, Prasetiyono, J. 2013. Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri (Xanthomonas
oryzae pv. oryzae) dan Uji Patogenisitasnya pada Galur-galur Padi Isogenik. Jurnal AgroBiogen
9(2):49-57.
Utami, U. 2005. Isolasi Bakteri Endofit Penghasil Antimikroba Dari Tanaman Rhizopora musronata.
Malang: UIN Malang
Priharta, D, Y, A, A. 2008. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Endofit dalam Batang Tanaman Artemisia
Annua L. yang Diuji Potensi antibakterianya Terhadap Eschericia coli dan Staphylococcus
aureus. Universitas Sanata Dharma (Skripsi). Yogyakarta.
Wijiono. 2009. Ralstonia solanacearum. http://wijiyovan.wordpress.com. Akses 3 Januari 2016.