Retristik enzim dan plasmid Vektor DNA

Plasmid didirikan pertama dan mempertimbnagkan DNA extrakromosomal karena

mereka mempersembahkan dalam bakteri cytoplasma dengan menambahkan untuk

kromosom bakteri.
Potongan dari DNA bisa diterima, dijaga dan direplikasi oleh potongan DNA lain.
Penarikan DNA ligase dikatalisis untuk formasi fosodiester diantara nukleotida.
Ligase bisa bergabung dengan DNA sampai akhir kohesif dengan pecahan yang

tumpul
Cohen dan Boyer menciptakan vektor kloning DNA pertama untuk sisipan dan
replikasi DNA pada tahun 1980 dan sudah dipatenkan untuk pSC101 dan untuk

spilicing gen dan perkembangan teknik kloning.

Hasil dari National institutes of Health (NIH) membentuk komite laporan DNA
rekombinasi (RAC) yang diganti dengan resiko penilaian oleh teknologi penelitian

DNA rekombinan dan menetapkan petunjuk untuk penelitian DNA ekombinasi

Tahun 1976 RAC mempublikasikan bahwa petunjuk untuk mencari organisme

rekombinan.
RAC selanjutnya

transformasi sel bakteri dan pemilihan antibiotik dari bakteri rekombinan

-

Elektroporasi merupakan metode yang

kejutan listrik untukmemperbesar

pori-pori membran

menggunakan
sel sehingga

dapat

meningkatkan permeabilitas membran. Untuk melakukan metode ini, sel harus

terlebih dahulu ditumbuhkan pada media hingga mencapai masa di sekitar
pertengahan fase log. Lalu sinyal elektrik akan menginduksi perbesaran pori-pori
membran sehingga molekul yang berukuran kecil seperti DNA dapat masuk.
-

Efisiensi dari metode ini berbanding terbalik dengan peningkatan ukuran plasmid.
Elektroporasi bisa juga digunkan untuk memasukkan DNA kedalam sel mamalia dan

mengubah sel tumbuhan.

Dalam beberapa tahun ini seleksi antibiotik digunakan. Teknik kloning modern sering
menggabungkan strategi pilihan yang lebih populer lainnya , seperti " biru - putih "

pilihan ( alasan DNA ini dikloning ke situs pembatasan pada gen lac z .
Untuk mengidentifikasi bakkteri dengan plasmid rekombinasi, agar-agar juga harus
berisi kromogenik ( warna - memproduksi ) substrat untuk beta -gal disebut x - gal ( 5
-bromo- 4- chloro -3 indolyl beta D galactopyranoside )

Introduction to human gene cloning

Ahli biologi molekular mengatakan bahwa jika gen manusia bisa di kloning dan di
ekspresikan, teknologi rekombinasi DNA bisa digunakan sebagai alat berguna yang
mempunyai banyak kelebihan yang digunakan sebagai aplikasi menggairahkan bagi

riset dan kedokteran. Karena bakteri bisa tumbuh dalam persiapan yang besar.
Secara komersial gen manusia bisa bisa diproduksi oleh teknologi DNA rekombinan
dengan insulin manusia, hormon polipeptida diproduksi olh sel didalam pankreas

yang dinamakan beta sel

Ketika glukosa naik maka insulin akan rendah darah glukosa oleh stimulasi glukosa
yang tinggi didalam hati dan sel otot akan merangkai panjang yang dinamakan
glikogen.

Tipe vektor

Vektor bakteriofag
- DNA dari bakteriofag lambda yang vektor pertama yang digunakan untuk kloning
- DNA kloning dimasukkan kedalam sisi restriksi pusat dalam kromosom lambda
- Coli yang segaris ( untuk melisiskan berarti untuk membagi atau ruoture ) oleh
lambda , menciptakan zona bakteri mati yang disebut plak , yang masing-masing

muncul sebagai dibersihkan tempat di halaman bakteri .

- Masing masing plak yang mati adalah jutaan dari partikel rekombinasi plak.
Vektor kosmid
- Vektor cosmid berisi COS sampai DNA lambda, replikasi plasmid utama, dan gen
-

untuk replikasi DNA, tetapi kebanyakan dari virus tersebut tidak bisa berpindah
Koloni bakteri tersebut ditaruh dalam satu tempat dan rekombinasi bisa terjadi

dengan seleksi antibiotik

Satu adventage dari kosmid adalah bahwa memungkinkan untuk kloning fragmen
DNA dalam kisaran 20 sampai 45 kb . Tapi seperti vektor fag , karena
perkembangan jenis vektor lainnya , vektor kosmid tidak lagi sangat banyak

digunakan dan telah aplikasi terbatas .

Ekspresi vektor
- Ekspresi protein vektor hanya untuk mensintesis protein tingkat tinggi dari protein
-

eukariot
Polimerase RNA bakteri bisa mengikat untuk promoter dan sintesis yang lebih

besar dari RNA selama translasi dari protein

Jika protein diproduksi maka tidak banyak proses yang melipat dengan benar,
seperti yang terjadi pada sel eukariot yang menggunakan organelsel untuk

memodifikasi protein
- Virus tertentu dapat digunakan pada untuk mengkepresi vektor pada sel mamaila.
- Variasi dari vektor ini digunakan untuk terapi pada manusia
Kromosom atrificial bakteri (BACs)

BACs dapat menerima sisipan DNA di kisaran 100 hingga 300 kb

BACs yang banyak digunakan dalam proyek genom manusia untuk mengkloning

dan urutan potongan besar kromosom manusia

Yeast atrifical chromosome (YACs)
- YACs bisa berisi replikais yang utama, penanda yang dipilih dua telomer dan
-

sentromer yang mengikut replikasi dari YACs

YACs yang utama digunakan untuk fragmentasi dari DNA dari 200 kb sampai 2

megabases
Seperti BACs, YACs mempunyai peran penting dalam kloning memberikan effek

pada proyek gen manusia

Ti Vektor
- encode t - DNA untuk sintesis kromosom yang disebut auksin , yang melemahkan
sel inang
- genetik tanaman diakui bahwa jika mereka bisa menghapus auksin nd gen
merugikan
- lainnya dari plasmid Ti , vektor yang dihasilkan dapat digunakan untuk memberikan
gen ke dalam sel tanaman .

creating DNA libraries: building a collection of cloned genes

-

genomic versus CDNA libraries

Suatu perpustakaan gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuens (urutan)
DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah diklon ke dalam vektor
tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan, dan analisisnya. Pada
dasarnya terdapat dua macam perpustakaan gen yang dapat dikonstruksi,
bergantung kepada sumber DNA digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah
DNA

genomik/kromosom,

maka

perpustakaan

yang

dihasilkan

disebut perpustakaan genom. Sementara itu, jika DNA yang digunakan

merupakan hasil transkripsi balik suatu populasi mRNA seperti yang umum
dijumpai pada eukariot, maka perpustakaan yang diperoleh dinamakan
perpustakaan cDNA.