Anda di halaman 1dari 7

BAB III

HASIL PENGAMATAN

Penetapan Kadar DNA


Sampel

A260

A280

Kadar (g/l)

Kemurnian

Kelompok C1

0,251

0,174

2510

1,44

Kelompok C2

0,130

0,078

1300

1,67

Kelompok C3

0,232

0,162

2320

1,43

Perhitungan Kelompok C2 :
5 l
Faktor Pengenceran = 1000 l =

Kadar DNA (g/l) :


-

Kelompok C1
Kadar DNA = 0,251 x 200 x 50
= 2510 g/l

Kelompok C2
Kadar DNA = 0,130 x 200 x 50
= 1300 g/l

Kelompok C3
Kadar DNA = 0,232 x 200 x 50
= 2320 g/l

Kemurnian
-

Kelompok C1
Kemurnian =

0,251
0,174

= 1,44

1
200

Kelompok C2
Kemurnian =

0,130
0,078

= 1,67
-

Kelompok C3
Kemurnian =

0,232
0,162

= 1,43

Analisis DNA Kromosom dan Plasmid


-

Pembuatan Agarosa

Hasil Pengamatan
Pembuatan Buffer TBE 1x dengan
diambil 2 ml larutan TBE dan diencerkan
dengan Aquabidest Steril ad 40 ml.
Penambahan Aquabidest Steril untuk
membuat Buffer TBE 1x.

Penimbangan Agrosa dan penambahan


Buffer TBE 1x serta di kocok ad
homogeny dengan menutup mulut
Erlenmeyer dengan kapas. Penambahan
Buffer TBE 1x untuk memudahkan
migrasi dari fragmen DNA berdasarkan
perbedaan kekuatan ionik. Buffer dengan
kadar ion tinggi akan menaikkan
konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA.

Gambar

Pemanasan larutan campuran dengan


Hot Plate pada suhu 185C sehingga
larutan keruh menjadi jernih.

Penambahan 1l EtBr dalam larutan


yang sudah jernih dan hangat. Kemudian
dikocok ad homogen. Sebelumnya
praktikan diharuskan memakai hand
scoon berbahan nitril. Hal tersebut
karena hand scoon tersebut tidak mudah
ditembus larutan EtBr yang bersifat
karsinogenik sehingga dapat melindungi
tangan dari larutan tersebut. Penambahan
EtBr (Etidium Bromida) dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA
sehingga dapat terlihat jelas. Selain itu
EtBr merupakan pewarna yang
menghasilkan warna terang apabila
terpapar sinar UV.
Pemasukan larutan campuran ke dalam
Tray yang telah ditutup dengan selotip di
sisi berlubangnya. Kemudian di
tempatkan sisir elektroforesis. Tray
digunakan sebagai cetakan gel agarose.
Sisir (Comb) untuk
membentuk well (sumur) pada gel
agarosa.

Gel agarosa ditunggu hingga memadat


dengan dimasukkan dalam pendingin.
Hal tersebut untuk membantu pemadatan
gel agarosa.

Setelah memadat, selotip pada wadah


dibuka dan sisir diambil. Kemudian Gel
agarosa simasukkan dalam wadah yang
berisi larutan buffer.

BAB IV

PEMBAHASAN
4.1 Penetapan Kadar DNA
Pada praktikum ini dilakukan penetapan kadar DNA dari hasil pengisolasian DNA
yang telah dilakukan pada praktikum sebelumnya. Uji kuantitatif dilakukan guna melihat
tingkat kemurnian DNA serta menetapkan kadar DNA hasil isolasi. Uji kuantitatif DNA
dengan spektrofotometri UV-Vis dilakukan karena DNA murni dapat menyerap cahaya
ultraviolet dengan adanya basa-basa purin dan pirimidin dalam DNA. Pita ganda DNA dapat
menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan seperti protein atau phenol yang
terdapat didalamnya akan menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan
penyerapan cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai
absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan nilai kemurnian
DNA berkisar antara 1.8-2.0
Sebelum mengukur DNA plasmid pada spektrofotometri, pertama-tama dilakukan
pengukuran blanko terlebih dahulu hingga nilai A=0,00. Blanko yang digunakan yaitu
aquabidest steril sebanyak 1000 l yang ditempatkan pada kuvet kwarsa untuk kemudian
dimasukkan pada spektrofotometer dan dilihat nilai absorbansinya pada panjang gelombang
260 nm. Aquabidest digunakan sebagai blanko karena cairan tersebut digunakan sebagai
pelarut sampe DNA yang akan dianalisa, sehingga harus dilihat bahwa penggunaan pelarut
ini tidak akan mempengaruhi absorbansi DNA tersebut. Setelah itu dilakukan pengaturan
input data jumlah sampel dan panjang gelombang yang digunakan. Pengukuran absorbansi
DNA plasmid untuk masing-masing sampel kelompok dilakukan dengan memipet 5l DNA
plasmid kemudian ditambahkan aquabidest sebanyak 995 l yang dimasukkan pada kuvet
kwarsa dan dihomogenkan, lalu diletakkan dalam alat Spektrofotometri UV-Vis.
Nilai absorbansi yang dilihat adalah nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm
dan 280 nm. Dari data-data nilai absorbansi DNA plasmid tersebut dapat dicari kadar dan
kemurnian DNA plasmid tersebut. Untuk menghitung kadar DNA nilai absorbansi yang
diperoleh dikalikan dengan 50 g/l. Jika sampel diencerkan, maka harus dikalikan denga
faktor pengenceran juga. Sedangakan untuk mencari nilai kemurnian dari DNA didapatkan
dengan membagi nilai absorbansi pada 260 nm dengan nilai absorbansi pada 280 nm.
Hasil yang diperoleh dalam praktikum penetapan kadar DNA pada 3 kelompok adalah
sebagai berikut : C1 = 2510 g/l, C3 = 2320 g/l, dan kelompok kami C2 memperoleh
hasil 1300 g/l. Dan untuk nilai kemurnian isolat DNA plasmid dari 3 kelompok ialah
sebagai berikut : C1 = 1,44 ; C3 = 1,43 dan kelompok kami C2 memperoleh nilai kemurnian
sebesar 1,67. Dilihat dari nilai kemurniannya maka dapat dikatakan bahwa hasil isolasi DNA
plasmid terkontaminasi oleh protein dan phenol, sehingga diperoleh nilai kemurnian <1,8.
Terjadinya kontaminasi kemungkinan disebabkan oleh tidak sterilnya peralatan yang
digunakan, atau pun praktikan yang kurang teliti dalam pengisolasian DNA.
4.2 Elektroforesis DNA
Pada percobaan ini dilakukan analisi DNA kromosom dan plasmid dengan teknik
elektroforesis. Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan

memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Elektroforesis adalah teknik
pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya
dalam sebuah medan listrik. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan
campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas
gradient sentrifugasi. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul
(seperti protein dan asam nukleat). Selanjutnya, lokasi DNA dalam gel tersebut dapat
diidentifikasi secara langsung dengan menggunakan pewarna berfluoresce yang dipancarkan
oleh ethidium bromide dari sampel DNA.
Tahap pertama adalah elektroforesis agarosa. Agarosa ditimbang dengan berat 0,4 g
dan dilarutkan dalam 40 ml buffer TBE 1x dengan cara pemanasan sampai semua agarosa
larut dengan sempurna sehingga diperoleh gel agarosa 1% kemudian menambahkan 1l EtBr
dan larutan didiamkan hingga suhu kurang lebih 60C. Keuntungan menggunakan agarosa
adalah tidak bersifat karsinogenik seperti halnya acrylamide. Penambahan buffer TBE
digunakan agar pH dalam larutan dapat dipertahankan dari penambahan zat yang akan
dimasukkan kedalam larutan itu sendiri dan memudahkan migrasi dari fragmen DNA
berdasarkan kekuatan ionik, Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi
listrik sehingga mempercepat migrasi DNA. Sedangkan EtBr (Etidium Bromida) dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas. Selain itu EtBr
merupakan pewarna yang bila diletakan dibawah sinar UV akan menyebabkan berpendarnya
ethidium bromida dalam gel. Berpendarnya senyawa ini dapat menjadi indikator pergerakan
DNA kromosom dan plasmid

dalam gel. Cetakan agarosa kemudian disiapkan dengan

menutup sisi berlubang cetakan dengan menggunakan selotip dan menempatkan sisir
elektroforesis untuk membentuk sumur. Larutan agarosa yang telah membentuk sumur
kemudian dituangkan kedalam cetakan dan dibiarkan hingga memadat. Setelah gel memadat,
penutup cetakan dan sisir dilepaskan kemudian cetakan ditempatkan dalam wadah yang berisi
buffer TBE 1x. Fungsi larutan buffer yang digunakan ialah menjaga kesetimbangan pH dari
gel agarosa tersebut agar tidak terjadi perubahan pH, perubahan pH dapat mempengaruhi
DNA yang akan di uji karena merubah elektromobilitas DNA dalam gel agarosa.

DAFTAR PUSTAKA
Birren, B. & E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide.
Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8th ed. John
Wiley & Sons Inc., New York
Fatchiyah, 2011. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman Dengan Metode
RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya, Malang.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher :
Rijeka, Croatia.
The biotechnology education. 2003. Principles and practice of agarose gel electrophoresis.
Edvotek inc : 26 hlm.