Anda di halaman 1dari 17

I.

STERILISASI ALAT, PEMBUATAN LARUTAN STOCK DAN PEMBATAN
MEDIUM
A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Prinsip teknik kultur jaringan adalah bahan dan peralatan yang
digunakan harus steril. Alat dan bahan yang tidak steril dapat menjadi
sumber kontaminasi sehingga dapat mengakibatkan kegagalan dalam
proses kultur jaringan. Sterilisasi adalah segala kegiatan dalam kultur
jaringan yang harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di dalam
laminar air flow cabinet.
Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam pembuatan media
hanya diperlukan dalam jumlah sedikit, oleh karena itu bahan-bahan
tersebut disediakan dalam bentuk larutan stock. Larutan stock merupakan
larutan bahan-bahan komponen media yang besarnya telah dikalikan
menjadi beberapa konsentrasi. Larutan ini berfungsi untuk memudahkan
penimbangan dan menghindari kesalahan penimbangan bahan-bahan yang
diperlukan dalam jumlah yang relative kecil.
Pembudidayaan melalui kultur jaringan dilakukan dengan media
khusus yang berbentuk padat, cair dan padat-cair. Media merupakan salah
satu faktor penentu keberhasilan dari kultur jaringan. Pembuatan media
telah

diformulasikan

untuk

mengoptimalkan

pertumbuhan

dan

perkembangan tanamn yang dikulturkan. pelaksanaan praktikum perlu
dilakukan agar mahasiswa mampu melaksanakan budidaya tanaman
dengan teknik kultur jaringan demi menghasilkan tanaman dalam jumlah
banyak, cepat dan sehat.
2. Tujuan
Tujuan praktikum Kultur Jaringan acara I tentang Sterilisasi Alat,
Pembuatan Larutan Stock Dan Pembatan Medium adalah sebagai berikut:
a. Mengetahui metode dan macam sterilisasi dlam kultur jaringan yang
meliputi sterilisasi alat, ruang dan eksplan

erlemeyer dan lain-lain c. Mengetahui prosedur sterilisasi alat-alat penanaman (diseksi) dan alat kaca seperti botol kultur. petridish. . larutan buffer (Fe EDTA). vitamin dan Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) 3.b. mikro nutrien.30 WIB di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan terutama dalam pembuatan stock makro nutrien.30-17. Pembuatan Larutan Stock Dan Pembatan Medium dilaksanakan pada hari Senin tanggal 8 Maret 2016 pukul 15. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum Kultur Jaringan acara I tentang Sterilisasi Alat.

selain itu dapat diperoleh biakan steril (mother stock) sehingga dapat digunakan sebagai bahan untuk perbanyakan selanjutnya. bahan organik. unsur hara makro dan mikro. Kultur jaringan adalah teknik perbanyakan tanamn dengan cara perbayankan jaringan miro tanamn yang ditumbuhkan secara in vitro menjadi tanamn yang sempurna dalam jumlah tak terbatas. Dasar dari kultur jaringan adalah totipotensi. pemberian zat pengatur tumbuh. yaitu bahwa setiap sel organ tanaman mampu tumbuh menjadi tanaman yang sempurna bila ditempatkan di lingkungan yang sesuai. Keuntungan pengadaan bibit melalui kultur jaringan antara lain dapat diperoleh bahan tanaman yang unggul dalam jumlah banyak dan seragam. alternatif yang tepat untuk mengatasi masalah kekurangan bibit bawang putih karena dapat menghasilkan bibit dalam jumlah besar dan seragam sesuai karakter bawang putih yang diinginkan. Respon pertumbuhan planlet pada kultur jaringan juga tergantung pada jenis tanaman yang dikulturkannya (Hidayat 2008). vitamin. Keberhasilan kultur sangat dipengaruhi oleh media yang digunakan. jaringan dan organ serta menumbuhkannya menjadi tanaman utuh dalam kondisi lingkungan yang aseptik (in vitro). Teknik kultur jaringan merupakan perbanyakan tanaman secara vegetatif. Perbanyakan secara konvensional. Kultur jaringan merupakan salah satu teknik dalam perbanyakan tanaman secara klonal untuk perbanyakan masal. asam amino. bahan pemadat media dan kondisi bahan.B. peralatan dan ruangan yang steril (aseptik). jumlah bawang putih yang dihasilkan relatif sedikit (Husain 2012). Benih kultur jaringan dapat dijadikan salah satu alternatif untuk dikembangkan agar dapat meningkatkan produksi dan pendapatan (Mariani 2011). sumber eksplan. Tinjauan Pustaka Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti sel. Tujuan kultur jaringan adalah memperbanyak tanaman dalam waktu yang lebih singkat (Yuliarti 2010). karbohidrat. Penggunaan media dasar dan zat pengatur tumbuh yang tepat .

merupakan faktor yang penting untuk mendapatkan hasil yang optimum maka (Lestari 2010). Cara yang umum dipakai dalam sterilisasi adalah sterilisasi basah atau lembab (Kadaryanto 2006). Alat sterilisasi yang sering digunakan yaitu autoclave untuk sterilisasi basah dan oven untuk sterilisasi kering (Budiman 2009). penyaringan dan sterilisasi dengan bahan kimia atau gas (Muzakar 2015). sterilization pouch yang memperlihatkan perubahan warna bila telah tercapai siklus sterilisasi yang dilakukan. mikroba dan jamur liar lainnya yang ada pada media tumbuh jamur tiram. Cara tersebut yaitu secara fisika dengan mengukur temperatur. Pemantauan proses sterilisasi didasarkan dengan tiga cara. dan waktu secara kimia dengan autoclave tape. untuk cara autoklafisasi digunakan Geobacillus stearothermophilus. Proses sterilisasi bertujuan untuk menonaktifkan atau membunuh bakteri. Sterilisasi dalam mirobiologi merupakan suatu proses untuk mematikan suatu organisme yang terdapat pada suatu benda. Bagian dalam dan luar vial plastic digosok-gosok dengan busa hingga bersih. Sterilisasi adalah suatu proses perlakuan terhadap alat atau bahan agar tidak terdapat mikroorganisme yang dapat mengganggu hasil percobaan. . Sterilisasi alat dapat dilakukan dengan menggunakan sinar UVC. Sterilisasi adala proses untuk mematikan kuman pada alat laboratorium. Teknik sterilisasi ruangan ada beberapa metode diantaranya adalah penyinaran. Teknik sterilisasi yang digunakan adalah dengan cara mengukus media tumbuh pada suhu 80-121 ºC dengan menggunakan uap air (Firdaus 2015). tekanan. secara biologis dengan menggunakan spore strip atau suspensi biakan spora. Proses sterilisasi umumnya dilakukan berdasarkan pemanasan basah yaitu autoklafisasi dan pemanasan kering melalui oven. Kemudian dijemur di bawah sinar matahari sampai kering dan disinari di bawah lampu sinar UV selama 20 menit (Wulandari 2015). sedangkan pada sterilisasi dengan oven dipakai Bacillus atrophaeus (Meliawaty 2012). Vial plastik dan nampan plastik direndam dengan larutan NaOCl selama 25-30 menit.

Cisadane. dan asam nukleat berfungsi sebagai kofaktor dalam pembentukan enzim. media White dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari. persentase tumbuh tunas. dan memperlancar respirasi (Heriansyah 2014). Formulasi media terbaik untuk menginduksi pembentukan kalus MS + 2.4-D 2 mg/l + CH 3 mg/l. Semua varietas yang diujikan (Ciherang. persentase tumbuh akar. media Schenk & Hildebrant (media SH) merupakan media yang juga cukup terkenal. dan IR64) mempunyai kemampuan regenerasi melalui jalur organogenesis pada beberapa macam media yang digunakan (Purnamaningsih 2006). media Knop dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus. media N6 mempunyai ciri perbandingan NH₄⁺ dan NO₃⁻ yang jauh perbandinganya. asam-asam amino.4-D mampu menginduksi pertumbuhan kalus pada eksplan (Sugiyarto dan Paramita 2013). Formulasi media terbaik untuk regenerasi kalus menjadi tunas adalah MS + BA 3 + thidiazuron 0. media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspense. Media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. persentase tumbuh kalus. Komponen organic seperti vitamin. untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil. menstimulir proliferasi jaringan. WPM (Woody Plant Medium) diperuntukkan khusus tanaman berkayu. media Knudson dan media Vacin and Went media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek.Komposisi media tumbuh dalam kultur in vitro sangat diperlukan untuk meningkatkan kualitas dan kuantitas bibit.4 mg/l. dalam penelitian yang Cerianingsih buat menggunakan variable yang diamati adalah ada tidaknya kalus yang terbentuk. Cerianingsih (2015). jumlah tunas baru yang dihasilkan per eksplan dan waktu munculnya tunas berdasarkan variable tesebut maka Cerianingsih menggunakan media jenis MS.1 mg/l atau MS + BA 5 mg/l + thidiazuron 0. Media MS yang mengandung auksin 2. salah satu cara dengan penambahan myoinositol dan arang aktif. jumlah akar. media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS. Jenis media adalah sebagai berikut. .

4-D harus dihilangkan (sebab bila masih ada. gula (sukrosa) diturunkan bahkan dihilangkan. maka hanya akan terjadi kalus saja). hormone yang dipakai ditentukam sesuai dengan tujuan (misalnya menginginkan agar kalus segera bertunas saja. medium deferensiasi yang digunakan dalam kultur jaringan adalah medium standar dengan modifikasi beberapa zat tamabahannya antara lain 2. sering digunkanan medium WPM. Untuk embrio kelapa kopyor digunakan medium Knudson C. . Medium deferensiasi (medium untuk menumbuhkan tunas dan akar) bagi eksplan berkayu pada jaringan batang.Medium untuk induksi kalus yang paling banyak digunakan adalah medium MS. berakar saja atau kedua-duanya) (Hendaryanto 2014).

Vitamin h. Mikro f. Magnetic hot plate stirrer d. misalnya 500 ml . Magnet 2. Timbangan analitik b. Misalnya untuk unsure hara makro dikalian 20 dan unsure hara miro dialikan 100 kali konsentrasi b) Melarutkan bahan-bahan kimia tersebut ke dalam aquades dengan volume tertentu. Pembuatan Larutan Stock 1) Larutan stock media (telah dibuat oleh Co ass) a) Menimbang bahan-bahan kimia yang telah dialikan menjadi beberapa kali konsentrasi. pH meter e. Agar-agar c.3 mm h. Erlenmeyer f. ZPT BAP 3. Botol-botol kultur c. Sterilisasi 1) Mencuci botol-botol kultur dengan sabun 2) Mengeringkan botol-botol kultur 3) Menyimpan botol-botol kultur yang telah kering dalam kardus b. Bahan dan Cara Kerja 1. Plastik pp 0. Pipet g. Gula d. Alat a. Aquades b. Mikro EDTA g.C. Cara Kerja a. Makro e. Alat. Bahan a.

Pembuatan media 1) Meletakkan Erlenmeyer di atas magnetic hot plate stirrer dan memasukkan sebuah magnet ke dalamnya 2) Menuangkan aquades ke dalam Erlenmeyer ukuran 1 L sebanyak 1/3 volume erlenmeyer 3) Menuangkan gula putih sebanayak 30 g ke dalam aquades. diaduk terus hingga larut 4) Menambahkan larutan makro sebanyak 50 ml 5) Menambahkan larutan mikro sebanyak 10 ml 6) Menambahkan larutan mikro EDTA sebanyak 50 ml 7) Menambahkan viatamin sebanyak 50 ml 8) Menambahkan ZPT BAP 2 ppm sebanyak M1 × V1 = M2 × V2 100 ppm × V1 = 1 ppm × 1000 ml V1 = 2000 100 V1 = 20 ml 9) Menambahkan aquades hingga larutan bervolume 1000 ml .3 l = 30 mg/300 ml b) Melarutkan bahan dengan alkohol atau NaOH 1 N kemudian ditambah dengan aquades sampai 300 ml untul BAP c) Memasukkan masing-masing larutan tersebut ke dalam botol dan menyimpan ke dalam refrigerator c.c) Memasukkan masing-masing larutan ke dalam botol dan menyimpannya ke dalam refrigerator 2) Larutan stok ZPT (telah dibuat oleh Co ass) a) Menghitung kebutuhan bahan BAP 100 ppm sebanyak 300 ml adalah sebgaai berikut: 100 ppm = 100 mg/l = 30 mg/0.

media yang telah .10) Menggukur pH larutan tersebut 11) Menambahkan agar-agar sebanya 8 g 12) Menunggu larutan hingga mendidih 13) Menuangkan larutan media kedalam botol-botol kultur kurang lebih 25 ml tiap botol 14) Menutup botol berisi larutan media 15) Memasukkan botol-botol berisi media ke dalam autoklaf untuk proses sterilisaasi pada tekanan 1.5 kg/cm2 selama 45 menit 16) Menyimpan media pada rak penyimpanan media yang bertujuan untuk mengantisipasi ada tidaknya kontaminasi pada media sehingga dapat dicegah penggunaan terkontaminasi pada saat penanaman.

Hasil dan Pembahasan 1.1 Hasil Pengamatan Pembuatan Media No Gambar Keterangan Erlenmeyer diletakkan diatas 1 Magnetic Hot Plate Stirrer dan dimasukkan sebuah magnet kecil Aquades dituangkan dalam 2 Erlenmeyer sebanyak 1/3 volume dan terus diaduk 3 4 Gula putih sebanyak 30 g ditambahkan ke dalam aquades Larutan ditambahkan dengan makro sebanyak 50 ml . Hasil praktikum Tabel 1.D.

5 6 7 8 Larutan kemudian ditambahkan dengan mikro sebanyak 10 ml Larutan ditambahkan dengan makro EDTA 50 ml Larutan ditambahkan dengan vitamin 50 ml Larutan ditambahkan dengan ZPT BAP 20 ml Larutan ditambahkan dengan 9 aquades hinggal volume larutan 1000 ml .

Mengukur pH larutan sebelum 10 ditambahkan dengan agar-agar sehingga pH yang diperoleh 5.86 Menambahkan agar-agar sebanyak 8 11 g ke dalam larutan dan menunggu nya hingga mendidih 12 Menuangkan larutan media ke dalam botol kultur kira-kira 25 ml/botol Menata boto-botol kultur berisi 13 larutan media ke dalam autoklaf untuk disterilisasi .

fungi. Pembahasan Sterilisasi adalah proses penghilangan semua jenis organisme hidup. dalam hal ini adalah mikroorganisme (protozoa.Menata botol-botol kultur yang telah 14 disterilisasi di atas rak di dalam ruang steril Sumber: hasil pengamatan 2. temperaturnya kira-kira 160oC selama 4 jam. Kedua adalah sterilisasi dengan pemanasan basah. Baking oven juga dapat digunakan. pisau. Target suatu metode inaktivasi tergantung dari metode dan tipemikroorganisme yaitu tergantung dari asam nukleat. menyatakan bahwa metode sterilisasi adalah sterilisasi dengan pemanasan kering metode ini hanya digunakan untuk alat-alat gelas dan peralatan yang terbuat dari logam atau bahan lain yang tidak rusak dalam temperature tinggi. Proses ini melibatkan aplikasi biocidal agent atau proses fisik dengan tujuan untuk membunuh atau menghilangkan mikroorganisme. Alat-alat yang digunakan harus dibungkus menggunakan kertas alumunium foil atau kertas payung sebelum dimasukkan ke dalam oven. bakteri. plastik dan kapas tidak dapat disterilkan dengan metode ini. scalpel dan pinset juga tidak boleh distersilkan dengan cara ini karena dapat menjadi tumpul. mycoplasma. Agen kimia untuk sterilisasi disebut sterilant. Yuliarti (2010). yang bekerja dengan tekanan uap. Alat-alat yang berisi kertas. protein atau membrane mikroorganisme tersebut. Menurut Purnawijayanti (2010). virus) yang terdapat dalam suatu benda. metode sterilisasi ini menggunakan alat berupa autoclave. Jika tidak mempunyai autoklaf panic presto juga dapat . sterilisasi adalah proses pemanasan yang dilakukan untuk mematikan semua mikroorganisme pada bahan makanan. Biasanya sterilisasi dilakukan dengan menggunakan oven pengering.

Praktikum pembuatan media praktikan hanya perlu menggunakan larutan stok yang tersedia tanpa perlu membuat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 5 ml alkohol 70% per liter media tidak menimbulkan efek yang merugikan pada kultur. sumber karbohidrat. Praktikan tidak melaksanakan praktikum pembuatan larutan stok karena karena larutan stok telah disediakan oleh Co ass. Ketiga sterilisasi dengan bahan kimia. Media kultur jaringan sangat berperanan dalam menentukan arah pertumbuhan media padat utk pembentukan planlet atau organ media cair untuk kultur suspensi. Media yang baik. vitamin. Media yang paling sering digunakan dalam kultur jaringan adalah media jenis MS. Larutan ini hanya berfungsi sebagai bahan sterilisasi yan baik. metode yang sederhana untu sterilisasi substansi yang termolabil adalah dengan alkohol 70% atau 95%. Setelah selesai mencuci. dan zat pengatur tumbuh (hormon). Media merupakan bahan yang berisikan zat-zat yang dapat mendukung pertumbuhan eksplan dalam kultur jaringan. Sterilisasi pada permukaan ruang kerja laboratorium juga dapat dilakukan dengan mengelap permukaan tersebut dengan alkohol 70% atau 90%. Media sering dimodifikasi menggunakan berbagai bahan sesuai dengan fungsi khususnya. Hal ini mengingat dalam pembuatan larutan stok memerlukan waktu yang cukup lama. perwakilan kelompok kembali ke laboratorium untuk menata boto-botol ke dalam kardus.dilakukan sebagai pengganti. Media yang cocok memengaruhi pertumbuhan eksplan yang telah ditanam untuk menjadi plantlet (tanaman kecil). Standar teknis untuk tekanan uap adalah 15 ib/in2 dengan temperature 121oC selama 15-20 menit. Media merupakan salah satu factor eksternal penentu keberhasilan kultur jaringan (Widyawati 2010). harus memenuhi syarat nutrisi yang diperlukan eksplan untuk tumbuh dan berkembang. Pelaksanaan praktikum sterilisasi dilakukan oleh praktikan dengan cara mencuci botol-botol kultur yang akan digunakan sebanyak 10 buah/praktikan. Media kultur jaringan ditambahkan berbagai macam mineral. . botol-botol ditata diatas meja menunggu hingga kering. Keesokan harinya.

Awal sterilisasi botol-botol kultur dilakukan dengan cara mencucinya dengan sabun e. Botol kultur tersebut kemudian disterilisasi dalam autoklaf dengan volume 50 botol kultur. Pembuatan Larutan Stock Dan Pembatan Medium adalah sebagai berikut: a. E. Saran Saran untuk praktikum Kultur Jaringan acara I tentang Sterilisasi Alat. Metode sterilisasi ada metode pemanasan kering. 1 L larutan media dapat mengisi 40 botol kultur 2. Pembuatan Larutan Stock Dan Pembatan Medium adalah sebagai berikut: . Kesimpulan Kesimpulan dari praktikum Kultur Jaringan acara I tentang Sterilisasi Alat.5 atm dengan suhu 121oC selama 30 menit dan 15 menit unuk meringankan tekanan dalam autoklaf. pemanasan basah dan bahan kimia c. Botol kultur tersebut disterilisasi dengan tekanan 1. Media merupakan bahan yang berisikan zat-zat yang dapat mendukung pertumbuhan eksplan dalam kultur jaringan d. Botol kultur dapat dikeluarkan dari dalam autoklaf dan ditata di atas rak di dalam ruang steril setelah 45 menit menunggu. Kesimpulan dan Saran 1. Sterilisasi adalah proses penghilangan mikroorganisme dalam suatu bahan b.Pembuatan media dihasilkan 1 L larutan media dengan pembagian 25 ml per botol sehingga 1 mengisi 40 botol kultur.

Ida AA. I Gusti MON 2015. Solusi taktis UN IPA. Daisy P. Rover 2014. Perlu adanya kepedulian dari Co ass untuk praktikan b.) varietas Prabu Bestari dan Jestro Ag 86. Heru R 2009. Analisis efisiensi termal kompor berbahan bakar Hendaryanto S. Jogjakarta: Kanisius Heriansyah P. Wana Mukti Forestry Research Journal 6(1): 35-44 Husain I 2012. Perlu ditambah alat-alat di laboratorium misalnya autoklaf DAFTAR PUSTAKA Budiman I. Jurnal Agroteknologi 5(1): 9-16 Hidayat Y 2008.a. Pengaruh pemberian myoinositol dan arang aktif pada media sub kultur jaringan tanaman anggrek (Dendrobium sp). Jakarta: Media Pusindo Cerianingsih MW. Ari W 2014. Trinop S. Jakarta: Yudistira . Induksi protocorm pada eksplan bawang putih pada media ms minim hara makro dan mikro yang ditambahkan air kelapa. Keefektifan bahan sterilisasi dalam pengendalian kontaminasi pada pertumbuhankultur zygotik surian (Toona sinensis Roem). Pengaruh kombinasi zat pengatur tumbuh Indole-3-Butyric Acid (IBA) dan 6-Benzil Amino Purin (BAP) pada kultur in vitro Tunas aksilar anggur (Vitis vinifera L. Jurnal Metamorfosa 2(1): 1-8 Firdaus FH et al 2015. Biologi 1 mengungkap rahasia alam kehidupan. Teknik kultur jaringan pengenalan dan petunjuk perbanyakan tanaman secara vegetative modern. Gilang N. JATT 1(1): 2832 Kadaryanto et al 2006.

Peranan Zat Pengatur Tumbuh dalam perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan. Analisa perbandingan pendapatan dan keuntungan usahatani kentang (Solanum tuberosum L. Penaruh lama waktu sterilisasi sinar ultraviolet tehadap angka Kuman udara di ruang operasi instalasi bedah sentral RSUD dr. Jurnal AgroBiogen 7(1):63-68 Mariani N 2011. Tesis Universitas Sebelas Maret Wulandari A. JKM 11(2):147-167 Muzakar K 2015. Jurnal AgroBiogen 2(2):74-80 Sekam dan limbah baglog pada sterilisasi jamur tiram. Bedjo 2015. hygiene dan keselamatan kerja dalam pengolahan makanan. Pengaruh variasi konsentrasi naa dan bap terhadap induksi kalus jarak pagar (Jatropha curcas L. Jurnal HPT 3(1): 67-74 Yuliarti N 2010. Pengaruh beberapa konsentrasi Spodoptera litura Nuclear Polyhedrosis Virus (SlNPV) JTM 97C terhadap Mortalitas Helicoverpa armigera Hubner (Lepidoptera: Noctuidae) pada tanaman kedelai. Skripsi Universias Sebelas Maret Purnamaningsih R 2006. Mintarto M. Jogjakarta: Lyly Publisher .Lestari EG 2010. Yogyakarta: Kanisius Widyawati G 2010. Jurnal Fisika dan Aplikasinya 16(1): 64-67 Purnawijayanti HA 2010.) antara menggunakan benih kultur jaringan bersertifikat (G4) dengan benih lokal di kanagarian batagak kecamatan sungai puar kabupaten Agam. Efisiensi sterilisasi alat bedah mulut melalui inovasi oven dengan ozon dan infrared. Jurnal Universitas Andalas Meliawaty F 2012. Sanitasi. Induksi kalus dan optimasi regenerasi empat varietas padi melalui kultur in vitro. Fery AC.). Moewardi Surakarta. Kultur jaringan tanaman skala rumah tangga.