BAB I

PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA (deoxyribonucleid acid)
adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering
setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Tetapi ada pula
DNA yang terdapat di mitokondria, oleh karena itu disebut DNA mitokondria. Secara
garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik. Artinya, DNA
menyimpan cetak biru bagi segala aktifitas sel. Dan ini berlaku umum bagi setiap
organisme.
Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu
secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan
metode spektrofotometri.

Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan

kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang
sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan
cara uji kualitatif. Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan
metode spektrofotometri. Terdapat

beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible),

spektrofotometri UV (ultra violet), Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet visible) dan

Spektrofotometri Infrared.
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agarose (uji kualitatif). Agarosa
merupakan suatu fraksi dari agar-agar yang merupakan polimer netral dan sedikit
mengandung sulfat. Agarosa dikenal sebagai fraksi pembentuk gel dari agar-agar, dimana
sifat-sifat gel yang dihasilkannya mendekati sifat-sifat gel ideal untuk keperluan bidang
bioteknologi. Elektroforesis gel agarose adalah metode pemisahan molekul DNA dan
RNA menurut muatan, ukuran dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan
mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat,
dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik diaplikasikan pada gel,
molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju elektroda positif dan molekul
bermuatan positif akan menuju elektroda bermuatan negatif. Elektroforesis gel agarose
dapat dipakai secara efektif untuk mendeteksi dan mempersiapkan karakterisasi plasmid
DNA yang muncul pada isolasi klinis dan pewarnaan laboratoris dari mikroorganisme
gram negatif. Metode ini sangat sensitif dan tidak memerlukan radioisotop atau
ultrasentrifugasi.

Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk memisahkan,

mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA, baik untuk
pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA. Molekul-molekul tersebut akan
bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung
di dalamnya.Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju
kutub positif (anoda),sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (katoda). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan
informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.
Elektroforesis menyediakan informasi mengenai ukuran, muatan, dan jenis komponen
yang dielektroforesis.
1.2. Rumusan Masalah
- Bagaimana mekanisme penetapan kadar DNA menggunakan spektrofotometer?
- Bagaimana cara mengetahui kemurnian DNA hasil isolasi?
- Apa yang dimaksud dengan gel agarosa?
- Bagaimana cara membuat gel agarosa?
1.3. Tujuan
- Untuk mengetahui mekanisme penetapan kadar DNA menggunakan spektrofotometer
- Untuk mengetahui kemurnian DNA hasil isolasi
- Untuk mengetahui tentang gel agarosa
- Untuk mengetahui cara membuat gel agarosa

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2. 1.Metode Spektrofotometer
Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk
mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian dilakukan
dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan
untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan dengan
uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu
metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan
senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari
spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum
dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas
cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi.
Spektrofotometri UV Vis merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak
dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang
merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa
preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi
atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan
larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.
DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya
UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 260 nm,
sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada

280 nm. Dengan

adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur
dengan menghitung nilai absorbansi

260 nm dibagi dengan nilai absorbansi

280

(260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0.

Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan
dari protein membran / senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat
belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan
DNA yang diambil terlalu sedikit.
1.2. Eektroforesis Gel
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh

medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju
perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut
bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan
untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk
memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer
massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metodemetode karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked)
yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau
asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan
biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara
akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan
jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam
nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan
adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)
pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.
Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu
kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah
menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat
yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida
digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat
protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna
"biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul
sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium
bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom
radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah
proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pitapita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekulmolekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama,

yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau
penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat
digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan mengelektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada
lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan
ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran
molekul.
DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose
atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis.
Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium
bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.
DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan
listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan
kecepatannya tergantung dari :
a.

Ukuran molekul DNA

b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c. Arus listrik yang diberikan
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan
penyangga muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :
1.
2.

3.

Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur

Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur.
Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan

1.3. Elektroforesis Agarosa

Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk memisahkan,
mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA,baik untuk
pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA. Prinsip kerjanya dimulai saat
molekul

yang

bermuatan

listrik

ditempatkan

pada

medium

berisi

tenaga

listrik. Molekul yang digunakan dalam praktikum elektroforesis adalah molekul DNA
yang bermuatan negatif. Molekul akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub
negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang
bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan
molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif
(katoda) DNA memiliki muatan negatif karena mengandung gugus O. Oleh karena itu,
arah migrasi DNA adalah dari kutub negatif ke kutub positif.

Migrasi DNA tersebut dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu ukuran molekul
DNA, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan
larutan buffer elektroforesis.

Pertama, ukuran molekul DNA. Molekul yang

berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan
dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar. Kedua,
konsentrasi gel. Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat
sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih
tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang
lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar. Ketiga
bentuk molekul. Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat
bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat. Keempat densitas muatan.
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas
muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas
muatan yang rendah. Kelima, pori-pori gel. Semakin kecil pori-pori gel yang
digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA. Keenam, voltase. Semakin
tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.
Ketujuh, larutan buffer elektroforesis. Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan
konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA.
Aparatus elektroforesis memiliki beberapa komponen yang terdiri dari
Comb, Tray, Chamber, dan sumber listrik. Comb digunakan untuk membentuk wel
pada

gel

agarosa. Tray digunakan

untuk

sebagai

cetakan

gel

agarosa.

Chamber digunakan sebagai wadah gel agarosa. Sumber listrik digunakan untuk
memberi arus saat proses elektroforesis.

1.4. Gel Agarosa

Gel agarosa adalah zat yang digunakan dalam biokimia dan bioteknologi untuk
elektroforesis gel dan kromatografi eksklusi ukuran, yang merupakan metode
pengurutan molekul besar oleh ukuran dan muatan listrik. Proses ini menggunakan
agarose untuk memisahkan dan menganalisis protein dan DNA. Hal ini sangat cocok
untuk aplikasi ini karena struktur molekul, yang memungkinkan molekul ukuran yang
berbeda untuk bergerak melalui itu pada tingkat yang berbeda.
Materi yang diperoleh dari berbagai jenis rumput laut, dan biasanya ditemukan
di laboratorium dalam bentuk bubuk. Untuk membuat suatu media yang cocok untuk
tes tertentu, bubuk ditambahkan ke dalam air pada konsentrasi yang tepat, direbus, dan
kemudian dibiarkan mendingin menjadi gel. Agarose diekstrak dalam bentuk agar-agar
dari beberapa jenis ganggang laut merah, atau rumput laut, ditemukan di California
dan Asia Timur.
Agar, istilah yang berasal dari bahasa Melayu agar-agar, jelly berarti, biasanya
diperoleh dari jenis Gelidium rumput laut. Hal ini terdiri dari dua zat yang berbeda,
yang dikenal sebagai agarosa dan agaropectin, dan menyediakan dukungan pada
dinding sel dalam ganggang laut. Ketika dihapus, agar dapat digunakan sebagai
pengental makanan, seperti gelatin, atau sebagai pencahar. Jika dimurnikan, dapat
digunakan sebagai media untuk pertumbuhan bakteri, jamur, atau mikroorganisme
lainnya.

BAB III
PEMBAHASAN
3.1. Mekanisme Penetapan Kadar DNA dengan Spektrofotometri UV Vis
Keberadaan DNA dalam suatu organism dapat diketahui dengan 2 cara yaitu
secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan
metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan
kandungan / jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang
sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan
cara uji kualitatif. Analisis kuantitatif merupakan salah satu teknik analisis yang bertujuan
untuk menentukan jumlah atau seberapa banyak suatu zat atau komponen zat.
Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui
jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV
dengan panjang gelombang 260 nm. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian
terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA
pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. RasioA260 / A280 antara 1,8 - 2,0
mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai
absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi,
yaitu nilai 1 pada A260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml.
Penentuan panjang gelombang maksimum perlu dilakukan untuk mengetahui
dimana terjadi absorpsi maksimum dan untuk meningkatkan proses absorpsi larutan
terhadap sinar. Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA /
RNA menggunakan spektrofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk mengetahui
kandungan protein menggunakan spektrofotometri UV dengan panjang gelombang 280
nm.
Pada praktikum kali ini digunakan aquabideststeril yang berfungsi agar endapan
DNA yang dihasilkan didapat konsentrasi yang cukup tinggi. Selain itu, juga digunakan
Buffer TE yang berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA
agar tidak mudah rusak.
Percobaan ini bertujuan untuk melakukan analisis kuantitatif atau kualitatif DNA
dari hasil isolasi. Hasil isolasi yang telah didapatkan dianalisis dengan menggunakan
spektrofotometer UV. DNA dapat dianalisis dengan spektrofotometri UV karena memiliki
ikatan rangkap terkonjugasi.
Analisis spektroskopi adalah analisis yang didasarkan pada interaksi radiasi
dengan spesies kimia. Interaksi radiasi dengan spesies kimia dapat berupa refleksi,
refraksi atau difraksi. Cara interaksi dapat berupa absorpsi, pemendaran, emisi,
penghamburan tergantung pada jenis materi. Range panjang gelombang radiasi UV-

tampak berada antara 200 nm-800 nm, terdiri dari daerah UV (200 nm-400 nm) dan
daerah tampak (400 nm-700 nm). Jika suatu berkas elektromagnetik dilewatkan pada
suatu sampel kimia, maka sebagian gelombang dapat terabsorpsi. Energielektromagnetik
yang diabsorpsi tersebut ditransfer ke atom atau molekul sehingga dapat terjadi promosi
energi partikel ke tingkat yang lebih tinggi, atau disebut tingkat eksitasi. Frekuensi
absorpsi dapat terukur dan menghasilkan spectra.
Panjang gelombang saat sampel memiliki absorbansi maksimal disebut dengan
maksimal. Panjang gelombang () maksimal spesifik untuk setiap sampel, dan panjang
gelombang ini dapat digunakan untuk analisis kualitatif. Untuk analisis kuantitatif,
absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang maksimal sampel tersebut untuk
mengurangi adanya interferensi serapan oleh molekul/zat lain dalam suatu sampel.
Analisis kuantitatif DNA dapat dianalisis dengan metode spektrofotometri. Uji
kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan / jumlah DNA yang
terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan
DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif. Analisis kuantitatif
merupakan salah satu teknik analisis yang bertujuan untuk menentukan jumlah atau
seberapa banyak suatu zat atau komponen zat. DNA dan RNA menyerap pada panjang
gelombang maksimal 260 nm, sementara kebanyakan protein menyerap kuat pada 280
nm. Namun, asam nukleat juga menyerap secara signifikan pada 280 nm (50%-55% dari
absorbansi pada 260 nm), dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm
(absrobansi bervariasi, tergantung pada protein). Dengan demikian, untuk mengukur
secara akurat konsentrasi DNA, RNA dan protein dalam campuran yang kompleks bisa
menjadi sulit. Namun, mengukur absorbansi pada 260 nm dan pada 280 nm dapat
memberikan validasi kemurnian sampel asam nukleat : rasio A260/A280 di atas 1,8 untuk
DNA atau 2,0 untuk RNA mengindikasikan sampel yang murni, nilai rasio yang rendah
menunjukkan adanya protein atau kontaminan lainnya.
Absorbansi spektrofotometri adalah teknik yang cepat dan akurat untuk
menentukan konsentrasi sampel DNA murni. Hal ini menjadi kurang akurat ketika
sampel DNA mengandung protein, RNA, oligonukleotida primer atau nukleotida. RNA,
primer dan nukleotida menyerap kuat pada 260 nm dan tidak bisa dibedakan dari DNA.
Kontaminan seperti protein dapat menyebabkan kelebihan isi DNA dalam sampel
campuran. Masalah ini dapat diatasi dengan menggunakan metode alternative untuk
mengukur DNA saja dalam sampel. Dalam jurnal yang ditemukan, masalah tersebut dapat
diatasi dengan menambahkan suatu senyawa berfluoresensi.

Untuk preparasi sampel dipipet 5 l sampel DNA hasil isolasi, ditambahkan

aquabidest secukupnya (995 l) sehingga volume akhir 1 ml dicampur, kemudian
dipindahkan ke dalam kuvet spektrofotometer, blanko spektrofotometer dengan kuvet
berisi 1 ml aquabidest dibaca absorbansi sampel dengan spektorfotometer pada 260 nm
dan dilakukan pembacaan yang ke-2 pada 280 nm. Jumlah DNA ditentukan dengan
asumsi 1 Abs 260 = 50 g. Penghitungan kadar atau konsentrasi DNA yaitu DNA g/l
=A260nm x faktor pengenceran x 50 g/l.
3.2. Cara Mengetahui Kemurnian DNA
Prinsip kerja dari spektrofotometri untuk penetapan kadar DNA yaitu DNA yang
mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA
dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau fenol dapat
menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini,
sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm
dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar
antara 1.8-2.0. jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung
kontaminan dari protein membran / fenol sehingga kadar DNA plasmid yang didapat
belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan
DNA yang diambil terlalu sedikit maka masih mengandung kontaminasi berupa RNA.
Pada praktikum kali ini Nilai kemurnian pada ketiga kelompok berbeda-beda
untuk nilai kemurnian pada kelompok D1 dan D3 lebih dari 2,0. Artinya DNA plasmid
yang diisolasi belum sempurna murni, masih terdapat zat yang tidak diinginkan, seperti
protein. Sedangkan untuk kelompok D2 nilai rasionya 1,8. Artinya DNA plasmid yang
diisolasi murni tidak ada kontaminasi. Kemungkinan kontaminasi pada isolasi DNA
plasmid bisa terjadi karena ketika sampel DNA mengandung protein, RNA,
oligonukleotida primer atau nukleotida. RNA, primer dan nukleotida menyerap kuat pada
panjang gelombang 260 nm dan tidak bisa dibedakan dari DNA. Kontaminasi protein
dapat menyebabkan kelebihan isi DNA dalam sampel campuran. Namun masalah ini
dapat diatasi dengan menggunakan metode alternatif untuk mengukur DNA saja dalam
sampel atau denagn menambahkan senyawa berflourosensi.
Nilai absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, artinya konsentrasi
semakin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan semakin tinggi. Terlihat pada hasil
pengamatan nilai konsentrasi sebanding dengan nilai absorbansi panjang gelombang 260,
menandakan jumlah DNA yang terkandung dan konsentrasinya. Jika nilai konsentrasinya
tinggi maka nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 juga tinggi misalnya pada

kelompok D1 yang plasmidnya memiliki nilai absorbansi 0.119 dan konsentasinya adalah
1190 ng/l.
3.3. Gel Agarosa
Gel agarosa adalah zat yang digunakan dalam biokimia dan bioteknologi
untuk elektroforesis gel dan kromatografi eksklusi ukuran, yang merupakan metode
pengurutan molekul besar oleh ukuran dan muatan listrik. Proses ini menggunakan
agarose untuk memisahkan dan menganalisis protein dan DNA. Hal ini sangat cocok
untuk aplikasi ini karena struktur molekul, yang memungkinkan molekul ukuran yang
berbeda untuk bergerak melalui itu pada tingkat yang berbeda. Materi yang diperoleh
dari berbagai jenis rumput laut, dan biasanya ditemukan di laboratorium dalam bentuk
bubuk. Untuk membuat suatu media yang cocok untuk tes tertentu, bubuk ditambahkan
ke dalam air pada konsentrasi yang tepat, direbus, dan kemudian dibiarkan mendingin
menjadi gel. Agarose diekstrak dalam bentuk agar-agar dari beberapa jenis ganggang
laut merah, atau rumput laut, ditemukan di California dan Asia Timur. Agar, istilah
yang berasal dari bahasa Melayu agar-agar, jelly berarti, biasanya diperoleh dari jenis
Gelidium rumput laut. Hal ini terdiri dari dua zat yang berbeda, yang dikenal sebagai
agarosa dan agaropectin, dan menyediakan dukungan pada dinding sel dalam ganggang
laut. Ketika dihapus, agar dapat digunakan sebagai pengental makanan, seperti gelatin,
atau sebagai pencahar. Jika dimurnikan, dapat digunakan sebagai media untuk
pertumbuhan bakteri, jamur, atau mikroorganisme lainnya.
Gel agarosa adalah suatu polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis
ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan separasi DNA dengan
kisaran ukuran yang luas. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA
dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb).
Pada praktikum kali ini reagen yang digunakan ada TBE 1x dan EtBr (Ethidium
Bromida). TBE (Tris-borat EDTA) 1X, Tris/Borat merupakan buffer yang umum
digunakan sebagai buffer elektroforesis karena memiliki kapasitas buffering yang tinggi
pada titik isoelektriknya. Borat bertindak sebagai conducting ion sehingga dapat
mempertahankan kesetimbangan ion H+ dan OH- yang dihasilkan oleh elektrode, hal ini
berhubungan dengan fungsi buffer dalam menjaga kesetimbangan pH saat migrasi
fragmen DNA berlangsung, perubahan pH dapat mendenaturasi struktur DNA sehingga
merubah elektromobilitas DNA.
Hasil elektroforesis dapat divisualisasi dengan menggunakan pewarna fluoresensi
ethidium bromide (EtBr). Secara teknis, setelah proses running, gel direndam dalam

larutan buffer TBE atau TAE yang mengandung ethidium bromide, selanjutnya ethidium
bromide akan berdifusi ke dalam gel dan berasosiasi dengan DNA. Ethidium bromide
mampu berinterkalasi diantara pasang basa nukleotida pada struktur double heliks dan
saat gel hasil elektroforesis disinari dengan ultraviolet maka fragmen-fragmen DNA yang
telah terpisah tampak sebagai band-band berwarna oranye. Ethidium Bromide (EtBr)
merupakan zat karsinogenik, jadi kita harus hati-hati. Maka pada saat praktikum kita
memakai sarung tangan dua, yaitu sarung tangan lateks selanjutnya sarung tangan nitril
yang memiliki pori-pori lebih kecil dari sarung tangan lateks.

Gambar : Interkalasi ethidium bromide dalam molekul DNA.

3.4. Cara Membuat Gel Agarosa
Pertama, menimbang agarosa sebanyak 0,4 gram. Setelah itu dimasukkan dalam
erlenmeyer dan dilarutkan dalam 40 ml buffer TBE 1x dengan cara pemanasan sampai
semua larut sehingga diperoleh gel agarosa 1%. Pada praktikum kali ini digunakan 100
ml buffer TBE 5x yang diencerkan menjadi 40 ml buffer TBE 1x.

Berikut ini adalah perhitungan 100 ml buffer TBE 5x yang diencerkan menjadi 40 ml
buffer TBE 1x :
x 100 ml =20 ml

= 2 ml

Jadi diambil sebanyak 2 ml dari 100 ml buffer TBE 5x dan ditambahkan dengan
aquabidest steril 40 ml menggunakan gelas ukur. Setelah itu dituang ke dalam erlenmeyer
yang berisi agarosa. Setelah itu erlenmeyer ditutup dengan penutup kapas dan dipanaskan
sampai campuran agarosa jernih. Setelah itu didinginkan beberapa saat hingga suhu
mencapai sekitar 50C. Kemudian campuran agarosa ditambahkan dengan larutan
Ethidium Bromida (EtBr) sebanyak 1 ml dengan menggunakan mikropipet. Setelah itu,
campuran dikocok sampai homogen. Setelah homogen, dituang ke dalam cetakan/tray
agarosa yang telah ditutup semua sisinya yang berlubang dengan selotip kertas.
Kemudian sisir elektroforesis ditempatkan di atasnya untuk membentuk sumur.
Campuran tersebut dibiarkan hingga dingin dan memadat. Setelah gel memadat, sisir
elektroforesis dilepaskan dari cetakan. Setelah itu gel dikeluarkan dari cetakan dan
ditempatkan dalam wadah tertutup yang berisi aquabidest steril secukupnya. Kemudian
ditutup dan disimpan untuk digunakan dalam praktikum selanjutnya.

BAB IV
PENUTUP
4.1. Kesimpulan
1.

Kadar DNA dapat ditentukan dengan menggunakan spektrofotometri.

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada besarnya

nilai absorbansi suatu zat terhadap radiasi sinar elektromagnetik.
2.

Jika pada

sedangkan jika pada

nilainya < 1,8 maka kontaminan fenol/protein,

nilainya > 2,0 maka kontaminan RNA

3.

Agarosa merupakan polimer D-galaktosa dan 2,4-anhidro-L-galaktosa

4.

yang diisolasi dari ganggang laut.

Gel agarosa untuk elektroforesis dibuat dengan melelehkan agarosa
konsentrasi tertentu dalam buffer dan didingankan.

4.2. Saran
1.

Sebaiknya praktikan lebih teliti dalam melakukan isolasi DNA,

agar DNA tidak terkontaminasi dan didapat hasil yang maksimal pada penetapan kadar
DNA.
2. Sebaiknya praktikan lebih berhati-hati dalam membuat gel agarosa karena pada
pembuatan gel agarosa digunakan Ethidium Bromida (EtBr) yang bersifat karsinogen.
Selain itu, agar mendapatkan hasil gel agarosa yang baik untuk digunakan dalam
elektroforesis pada praktikum selanjutnya.

DAFTAR PUSTAKA
Brown. T. A. 2001. Gene Cloning and DNA Analysis an Introduction, Fifth Edition. USA :
Blackwell Publishing
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit Kanisius
Asris.

2010.

Isolasi

DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id/

2010/06/19/isolasi-dna/.

Diaksestanggal 25 April 2016

Larasati, P. 2011. Quantifikasi DNA danAnalisisKualitas. http://puspalarasati.wordpress.com.
Diaksestanggal 25 April 2016.